一种基于高分辨率熔解曲线的多snp鉴定方法
【专利摘要】本发明属于农业生物【技术领域】，具体公开一种基于高分辨率熔解曲线的多SNP鉴定方法。本发明针对目前SNP鉴定的局限性，将多重PCR、巢式PCR、等位特异性PCR相结合，提出基于高分辨率熔解曲线的多SNP鉴定方法。本方法利用多重PCR实现2~4个基因片段扩增，提高实验效率，降低实验成本；利用巢式PCR提高扩增片段特异性，获得高质量、浓度均一的DNA模板，提高HRM技术稳定性；利用等位特异性PCR，实现SNP位点判别，避免荧光标记的设定或繁琐的电泳及酶切操作；通过上述方法的综合运用，实现多个SNP的批量鉴定、降低实验成本。
【专利说明】—种基于高分辨率熔解曲线的多SNP鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体涉及一种基于高分辨率熔解曲线的多SNP鉴定方法。
【背景技术】
[0002]单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A，G，C，T)替换而引起的多态性，是新一代多态性遗传标记。SNPs在生物基因组中广泛存在，如人类30亿个喊基中每千个喊基出现一次，在整个基因组共有300万以上的SNPs ;在水稻基因组中，约300个碱基就存在I个SNP，全基因组约存在100万以上的SNPs。
[0003]SNPs在人类疾病研究、指导动植物育种方面具有重要应用价值。利用广泛存在的SNPs，可快速构建超高密度遗传连锁图谱，实现功能基因的精细定位；在人类医学上，通过全基因组SNPs关联分析，可发现与致病性密切相关的基因。在水稻中，目前已克隆的重要农艺性状基因90%以上与SNPs关系密切，这些SNPs做为功能型分子标记已应用于育种实践。如脸的第I内含子+1位点G/T SNP直接影响稻米直链淀粉含量；Pita基因第918氨基酸的G/T变异导致稻瘟病抗性差异'Pik在第2173位碱基处存在T/C SNP变异，其中抗性基因为T，而感病基因为C。
[0004]鉴于SNPs的重要应用价值，目前已开发多种方法用于SNPs的检测。主要有以下几种:(I)限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，该方法利用限制性内切酶对PCR片段进行酶切，通过电泳区分片段，根据电泳结果区分是否存在SNP。(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)，该方法利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分开。
(3)等位基因特异PCR (AS-PCR)，根据SNP位点设计特异引物，其中一条链的3’段与SNP位点的碱基互补，特异引物在一种基因型中有扩增产物，而在另一种基因型中没有扩增产物，通过凝胶电泳即可进行区分。(3)测序法，对SNP所在DNA区段进行直接测序比较，即可明确不同材料SNP类型。(4)基于核苷酸荧光标记的SNP分型技术，如KASP (LGC Genomics,www.lgcgenomics.com)、TaqMan (Applied B1systems, www.appliedb1systems, com)等，利用荧光基团标记特异引物或探针，可进行自动化分型，在几万个标记位点以上时具有很高的效率和极低单位成本。
[0005]但是，上述SNP检测方法具有不同的局限性。如利用凝胶分析DNA片段的方法，重复性好、成本低，但样品处理繁琐，难以实现大量样品的批量分析；测序法准确可靠、分析效率高，但测序成本较高；基于核苷酸荧光标记的SNP分型技术可实现自动化、批量分析的商业化育种平台，但对于实验中常用的50-200个标记，其分析成本较高。同时，上述的SNP检测方法无法实现在一个反应体系中同时分析多个SNP。
[0006]HRM技术是在定量PCR的基础上发展起来的后PCR分析方法，通过监测双链DNA熔解曲线的变化来区分DNA变异，其分辨率最高可以区分单碱基差异。相比电泳及其他常见的核酸变异分析技术，HRM最大的优势在于PCR后不需要其他的处理，真正实现了闭管操作；在此基础上，通过配套的硬件及软件系统，更容易实现批量的自动化分析。HRM还具有良好的通用性，在具备HRM功能的仪器上，只需要一种试剂(饱和荧光染料)即可实现对SNP、Indel及SSR等不同类型变异的分型。这一优点，使HRM有望在今后能够部分取代凝胶电泳分析技术，在普通实验室中得到普及应用。利用基于HRM的分子标记进行突变扫描、基因定位和分子辅助育种，已在水稻、玉米、小麦、大麦等重要农作物中得到报道。相比常用的商业分型平台，HRM分析的引物不需要进行荧光标记，使其标记开发成本更低。此外，由于其很高的灵敏度，使HRM其能够区分不同相对剂量的杂合扩增产物，从而可用于鉴定多倍体的等位基因及其相对剂量。
[0007]然而，HRM技术也存在一些不足之处需要改进。首先，HRM技术依赖于监测熔解曲线进行DNA变异分析，具有高分辨率和灵敏度，但同时不可避免的存在稳定性较差的缺点；其次，HRM对PCR扩增的要求很高，要求使用高质量、浓度均一的DNA模板，引物具有良好的扩增特异性和效率；最后，由于HRM分析对PCR产物的要求高，使得PCR所用的引物、扩增体系和条件都需要不断优化。归结起来，制备高质量的模板DNA和需要对PCR体系反复优化，是限制HRM分析效率的主要因素。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是为了克服目前SNP检测方法存在的上述缺陷，提供一种基于高分辨率熔解曲线的多SNP鉴定方法。
[0009]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
51.样品DNA提取；
52.针对特测基因，设计可扩增SNP位点的外引物，外引物扩增片段长度20(T300bp且涵盖SNP位点；
53.以样品DNA为模板，加入外引物，构建PCR反应体系，进行第一轮扩增。此处可同时加入针对多个基因的多对外引物，实现多个基因片段的扩增；
54.第一轮扩增产物进行稀释15~20倍，分装至编号为A、B的PCR管；
55.针对SNP位点，每个基因设计3条引物(引物a、引物b、引物C)，3条引物组合构成内引物对I和内引物对2，内引物I由引物a和引物c组成，内引物2由引物b和引物c组成；所述引物a和引物b只在3’段最后一个碱基具有区别，分别适配不同SNP类型；
56.在A管中加入内引物对1、在B管中加入内引物对2，构建PCR反应体系，进行第二轮扩增；其中A管中可加入多个针对不同基因的内引物对1、B管中可加入多个针对不同基因的内引物对2。
[0010]S7.第二轮扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，判定SNP类型。
[0011]本方法利用多重PCR实现2~4个基因片段扩增，提高实验效率，降低实验成本；利用巢式PCR提高扩增片段特异性，获得高质量、浓度均一的DNA模板，提高HRM技术稳定性；利用等位特异性PCR，实现SNP位点判别，避免繁琐的电泳及酶切操作；通过上述方法的综合运用，实现多个SNP的批量鉴定、降低实验成本。
[0012]优选地，S2中所述待测基因为2~4个，且含有SNP变异。
[0013]优选地，步骤S3所述PCR反应体系为:
2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 μ L ；
外引物(10 ymol/L)各 0.3 μ L ；基因组DNA0.5 μ L ；
双蒸水补足10 μ L ;
PCR 扩增程序为 95°C，5min; 95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25 个循环；72 °C，5min。
[0014]优选地，S4所述第一轮PCR扩增产物稀释15~20倍。
[0015]优选地，S6所述PCR反应体系为:
2X Power Taq PCR MasterMix 母液4 μ L ；
内侧引物(10 ymol/L)各 0.3 yL ；
20 X EvaGreen 染料0.5 μ L ；
稀释过的第一轮PCR产物0.5 UL ；
双蒸水补足10 μ L ;
PCR 扩增程序为 95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 个循环；72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
[0016]S7所述高分辨率溶解曲线分析，可将第二轮扩增DNA片段根据溶解温度进行区分。
[0017]本发明所述针对多个基因的多SNP检测方法，可以适合所有类型的SNP检测，在举例方面，本发明不能将所有的案例都举出来，但是这并不能限定本发明的保护范围。在【具体实施方式】中，本发明针对水稻Wx、Pita、Pik三个基因的SNP进行检测来具体解释本发明的原理，以使本领域技术人员可以理解本发明的思路和方法。
[0018]一种基于高分辨率熔解曲线的Wx Pita Pik基因型鉴定方法，包括如下步骤:
S1.水稻DNA提取；
S2.针对阪、Pita、Pik基因，分别设计一对扩增SNP位点的外引物，外引物序列如SEQID NO:1-6 所示；
S3.以水稻DNA为模板，加入针对脸、Pita、/^基因的外引物，构建PCR反应体系，进行第一轮扩增；
S4.第一轮扩增产物进行稀释，分装至编号为Α、B的PCR管；
S5.分别针对脸、Pita、/^基因SNP位点，各设计3条引物，引物a、引物b、引物c，3条引物组合构成内引物对I和内引物对2，内引物对I由引物a和引物c组成，内引物对2由引物b和引物c组成；所述引物a和引物b只在3’段最后一个碱基具有区别，分别适配不同SNP类型；内引物序列如SEQ ID NO:7~15所示；
S6.在A管中加入分别针对脸、Pita、/7^基因的内引物对1，在B管中加入分别针对Wx, Pi ta、/7^基因的内引物对2，构建PCR反应体系，进行第二轮扩增；
S7.第二轮扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，判定SNP类型。
[0019]本发明的有益效果是:
首先，本发明克服了现有HRM技术检测SNP稳定性差的技术缺陷，其相应的改进方案为利用巢式PCR提高扩增片段特异性，获得高质量、浓度均一的DNA模板，提高HRM技术稳定性。
[0020]另外，本发明通过对HRM反应体系的不断调整和优化，最终实现多个SNP的批量鉴定、降低实验成本，其相应的改进方案为利用多重PCR可以实现对2~4个基因片段扩增，提高实验效率，降低实验成本；利用巢式PCR提高扩增片段特异性，获得高质量、浓度均一的DNA模板，提高HRM技术稳定性；利用等位特异性PCR，实现SNP位点判别，避免繁琐的电泳及酶切操作；通过上述方法的综合运用，实现多个SNP的批量鉴定、降低实验成本。
[0021]
【专利附图】
【附图说明】
图1.基因型鉴定技术示意图。
[0022]图2.第一轮PCR技术示意图。
[0023]图3.A管B管分装技术示意图。
[0024]图4.第二轮PCR，等位特异性扩增技术示意图。
[0025]图5.高分辨率溶解曲线分析技术示意图。
[0026]图6.基因型判断技术不意图。
[0027]图7./&基因的SNP位点图示。
[0028]图8.朽ia基因的SNP位点图示。
[0029]图9./--左基因的SNP位点图示。
[0030]图10.脸基因SNP位点的内引物设计位置。
[0031 ] 图11.朽ia基因SNP位点的内引物设计位置。
[0032]图12.基因SNP位点的内引物设计位置。
[0033]图13.Wx Pita Pik基因型高分辨率熔解曲线分析结果。
【具体实施方式】
[0034]下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。
[0035]实施例1
一种利用HRM技术判别水稻材料“特籼占13”/& Pita 基因型的方法 1.特籼占13基因组DNA的提取:
具体方法:(I)取少量水稻插秧后一月幼叶置于液氮冷冻的2.0 mL灭菌离心管中搅拌至粉末状，加1000 μ L 2 X CTAB-DNA提取液(质量分数W/V 2%的CTAB，ρΗ8.0 ;质量分数W/V1%的PVP ；100 mmol/L Tris-HCl，ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl ；20 mmol/L EDTA，pH8.0 ;体积分数V/V 0.2%的巯基乙醇)；(2)置于65 °C恒温水浴锅中每隔10 min摇动一次，30~45 min后取出；(3)冷却2 min后加1000 μ L体积比24:1的氯仿-异戊醇，上下剧烈充分摇动，使两者混合均匀；(4) 10000 rpm离心10 min,轻取上清至1.5 ml灭菌新离心管中，加入600 4 1^预冷异丙醇上下轻摇均匀；(5)-201:放置30 min使DNA沉淀；(6)10000 rpm离心6 min，立即倒掉上清倒立离心管于纸巾上；(7) I min后直立离心管,加入800 μ L 70%乙醇和3 M NaAc (体积比9:1),轻摇使DNA悬浮放置30 min ； (8) 10000 rpm离心6 min,立即倒掉上清加入800 μ L 70%乙醇将DNA再次漂洗30 min ； (9) 10000 rpm离心3 min，通风橱内烘干；(10)加入 100~200 μ L IXTB Buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0 ；1 mM EDTA,pH8.0)溶解，4 °C保存备用。
[0036]2.Wx Pita Pik基因外引物设计。
[0037] 具体方法-.Wx的第I内含子+1位点存在G/T SNP, Pita基因第918氨基酸的存在G/T变异，在第2173位碱基处存在T/C SNP变异，见图7、8、9。分别设计外引物外引物-Wx-F/R、外引物-Pita-F/R、外引物-Pik-F/R。
[0038]外引物的设计原则为:外引物针对待测基因设计，扩增长度20(T300bp且涵盖SNP位点。
[0039]外引物-Wx-F: 5，-GCTTCACGCAACGGCGCTACAA-3’
外引物-Wx-R:5’ -GCATGTGATCGATCTGAATAAGAG-3’
扩增片段285bp ；
外引物-Pita-F:5’ -ATTCGCAAGCATCCGACGCCGA-3’
外引物-Pita-R:5’ -ACGTGAAGAGGATTCCGGTAGCA-3’
扩增片段319bp ；
外引物-Pik-F:5’ -TGCAATGCCAGCACTCGAAATCA-3’
外引物-Pik-R:5’ -TGCAGTGACGATGCCATCAACAAA-3’
扩增片段199bp。
[0040]3.第一轮 PCR:
反应体系:依次加入2XPower Taq PCR MasterMix母液(百泰克,北京)5 μ L、外引物-Wx-F/R、外引物-Pita-F/R、外引物-Pik-F/R (10 μ mol/L)各 0.3 μ L 以及 0.5 μ L基因组DNA,最后以双蒸水补足10 μ L0在GeneAmp 9700型PCR仪(Applied B1systems,USA)上进行 PCR 扩增，扩增程序为 95°C，5min; 25 X (95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C ,10s) ; 72°C , 5min。反应完成后，向PCR管加入200 μ L双蒸水，以稀释第一轮PCR产物(约20倍)。
[0041 ] 4.Wx Pi ta Pik基因内引物设计:
针对脸、Pi ta、Pik基因SNP位点，设计内引物。
[0042]内引物设计原则为:内引物根据待测基因设计，内引物扩增长度50_150bp，每个基因设计3条引物(引物a、引物b、引物C)，3条引物组合构成内引物对I和内引物对2，内引物对I由引物a和引物c组成，内引物对2由引物b和引物c组成；所述引物a和引物b只在3’段最后一个碱基具有区别，分别适配不同SNP类型。
[0043]Wx基因SNP位点的内引物预期扩增片段55bp，Tm=74°C, Wx基因SNP位点的内引物构成如下，扩增片段及引物位置如图10所示。
[0044]ffx-a: CAGGAAGAACATCTGCAAct
ffx-b: CAGGAAGAACATCTGCAAcg
Wx-c: GAGGGGAAACAAAGAATTAT
脸基因内引物I组成为:Wx-a/Wx-c ； Wx基因内引物2组成为:Wx-b/Wx-c ；
Pita基因SNP位点的内引物预期扩增片段63bp，Tm=80°C, Pita基因SNP位点的内引物构成如下，扩增片段及引物位置如图11所示。
[0045]Pita-a:AGTCAGGTTGAAGATGCATAcg Pita-b: AGTCAGGTTGAAGATGCATAca Pita-c: TGAGCTTCTTTCTTTCTCTGCC
Pita基因内引物对I组成为:Pita-a/Pita-c ；
Pita基因内引物对2组成为:Pita-b/Pita-c ；基因SNP位点的内引物预期扩增片段基因SNP位点的内引物构成如下，扩增片段及引物位置如图12所示。
[0046]Pik-a:GGTTATTGCTTCTGCCCCATag Pik-b: GGTTATTGCTTCTGCCCCATaa Pik-c: GCCAGCACTCGAAATCATTGA
/?基因内引物I组成为:Pik-a/Pik-c ；
Pik基因内引物2组成为:Pik-b/Pik-c ；
5.第二轮 PCR。
[0047]将第一轮PCR产物分别移取0.5 μ L至96孔PCR板Al、BI位置。
[0048]Al 中依次加入 2 X Power Taq PCR MasterMix 母液(百泰克，北京)4 μ L, ffx-a/Wx_c、Pita-a/Pita-c、Pik-a/Pik-c (10 μ mol/L)各 0.3 μ L、0.5 μ L 20 XEvaGreen 染料(B1tium, USA),最后以双蒸水补足10 μ L。
[0049]BI 中依次加入 2XPower Taq PCR MasterMix 母液(百泰克，北京)4 μ L, ffx-b/Wx_c、Pita-b/Pita-c、Pik-b/Pik-c (10 μ mol/L)各 0.3 μ L、0.5 μ L 20 XEvaGreen 染料(B1tium, USA),最后以双蒸水补足10 μ L。
[0050]PCR 扩增程序为 95°C，2min; 25 X (95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s);72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
[0051]6.闻分辨率熔解曲线分析。
[0052]第二轮扩增产物分别全部转移至带裙边、白底不透明的96孔板Al、BI位置，加入20 μ L矿物油(SIGMA, USA)，离心(1000 rpm, I min)以消除气泡。将待测的检测板放入LightScanner 96 (Idaho Technology, USA)分析系统,读取 60°C _95°C 的熔解曲线。所采集的原始数据用LightScanner Call IT软件(Idaho Technology, USA)进行分析,选用Small Amplicon模式进行自动化分析。
[0053]7.结果分析:
结果表明，内引物扩增片段依据Tm值呈现不同的熔解曲线，其中脸基因片段在73.5~74°C范围内表现出熔解峰xPita基因片段在8(T80.5°C范围内表现出熔解峰'Pik基因片段在85、5.5°C范围内表现出熔解峰，三者间具有显著差异。
[0054]对比Al、BI间熔解曲线(图13)，发现BI中并无明显的熔解曲线，表明BI中无扩增产物。基因型由于内引物根据SNP在3’段引入错配碱基，因此错配的引物无法扩增出相应片段，导致无熔解峰。基因型纯合个体只能在一对内引物中扩增出片段，基因型杂合个体在两对内引物中均有扩增产物。对比两个熔解曲线，可以判定特籼占13的基因的SNP类型为纯合T\、Pita基因SNP类型为纯合⑷、Pik基因SNP类型为纯合GG。
[0055]本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属【技术领域】的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
[0056]尽管对本发明已作出了详细说明并引证了一些具体实例，但是对于本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
【权利要求】
1.一种基于高分辨率熔解曲线的多SNP鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤: S1.样品DNA提取； S2.针对待测基因，设计一对扩增SNP位点的外引物； S3.以样品DNA为模板，加入外引物，构建PCR反应体系，进行第一轮扩增； S4.第一轮扩增产物进行稀释，分装至编号为A、B的PCR管； S5.针对SNP位点，设计由3’段碱基错配的引物搭配构成的内引物对I和内引物对2 ； S6.在A管中加入内引物对1，在B管中加入内引物对2，构建PCR反应体系，进行第二轮扩增； S7.第二轮扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，判定SNP类型。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S2中所述待测基因为2~4个，且含有SNP变异；S2中所述外引物针对待测基因设计，扩增长度20(T300bp且涵盖SNP位点。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3中能够同时加入多对针对不同基因的外引物。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3所述PCR反应体系为: 2 X Power Taq PCR MasterMix 母液 5 μ L ； 外引物(10 ymol/L)各 0.3 μ L ； 基因组DNA0.5 μ L ； 双蒸水补足10 μ L ; PCR扩增程序为 95°C，5min;95°C , 20s; 57°C , 20s; 72°C , 10s; 25个循环；72°C，5min。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S4所述第一轮PCR扩增产物稀释15~20倍。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S5所述内引物根据待测基因设计，内引物对扩增长度50-60bp，每个基因设计3条引物，引物a、引物b、引物C，3条引物组合构成内引物I和内引物2，内引物I由引物a和引物c组成，内引物2由引物b和引物c组成；所述引物a和引物b只在3’段最后一个碱基具有区别，分别适配不同SNP类型。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S6所述A管中能够加入多个针对不同基因的内引物1、B管中能够加入多个针对不同基因的内引物2。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S6所述PCR反应体系为: 2 X Power Taq PCR MasterMix 母液4 μ L ； 内侧引物(10 ymol/L)各 0.3 yL ； 20 X EvaGreen 染料0.5 μ L ； 稀释过的第一轮PCR产物0.5 UL ； 双蒸水补足10 μ L ; PCR 扩增程序为 95°C，2min; 95°C , 20s; 59°C , 20s; 72°C , 10s;共 25 个循环；72 °C , 5min; 95 °C , 2min ；25°C , 2min。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S7所述高分辨率溶解曲线分析，可将第二轮扩增DNA片段根据溶解温度进行区分。
10.一种基于高分辨率熔解曲线的脸Pita 基因型鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤:S1.水稻DNA提取；S2.针对阪、Pita、Pik基因，分别设计一对扩增SNP位点的外引物，外引物序列如SEQID NO:1-6 所示；S3.以水稻DNA为模板，分别加入阪、Pita、Pik基因的外引物，构建PCR反应体系，进行第一轮扩增；S4.第一轮扩增产物进行稀释，分装至编号为Α、B的PCR管；S5.分别针对脸、Pita、/^基因SNP位点，各设计3条引物，引物a、引物b、引物c，3条引物组合构成内引物对I和内引物对2，内引物对I由引物a和引物c组成，内引物对2由引物b和引物c组成；所述引物a和引物b只在3’段最后一个碱基具有区别，分别适配不同SNP类型；内引物序列如SEQ ID NO:7~15所示；S6.在A管中加入分别针对脸、Pita、/7^基因的内引物对1，在B管中加入分别针对Wx, Pi ta、/7^基因的内引物对2，构建PCR反应体系，进行第二轮扩增；S7.第二轮扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，判定SNP类型。
【文档编号】C12Q1/68GK104131092SQ201410349635
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】郭涛, 罗文龙, 王加峰, 黄翠红, 周丹华, 陈志强, 王慧 申请人:华南农业大学