一株高产电的希瓦氏菌及其应用的制作方法

文档序号:483074阅读:805来源:国知局
一株高产电的希瓦氏菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株高产电的希瓦氏菌,其分类命名为希瓦氏菌(Shewanella oneidensis),已保藏于中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC No:M2014340,保藏日期为2014年7月16日。本发明还公开了上述高产电的希瓦氏菌在产电中的应用。本发明为提高希瓦氏菌在MFC中的产电能力提供了一种研究方向。本发明的希瓦氏菌在20mM乳酸钠作为电子供体时,最大输出电压高达449mV,比初始菌株MR-1提高了18.2%,最大输出功率密度为160mW/m2,比初始菌株MR-1提高了82.6%。CCTCC NO: M20143402014.07.16
【专利说明】-株高产电的希瓦氏菌及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染生物处理与生物能源【技术领域】,具体涉及一种希瓦氏菌及其 在微生物燃料电池产电上的应用。

【背景技术】
[0002] 能源短缺是我国现今面临的日益严峻的问题,因而能源开发成为了我国现代社会 进行可持续发展的一大挑战。科学家们不断寻找新的技术解决方案,其中微生物燃料电池 (Microbial Fuel Cell,MFC)就是其中之一用来产生可替代能源的新装置,并且其重要性 现今日益显现。
[0003] 同时,能源开发利用中引起的环境污染也是人类现代社会可持续发展面临的一大 挑战。而污水资源化俨然是一个再消除污染的同时又达到资源化的典范之一。
[0004] MFC是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。 从能源和环境保护的角度来看,将微生物燃料电池应用到废水处理领域,将MFC技术应用 废水处理中,在处理有机废水的同时获得电能,是缓解当前能源危机和解决环境问题的有 效途径。在此系统中,菌体是影响MFC产电性能的本质因素,并且近几年来,关于利用MFC 系统产生电流的微生物报道日益增多。虽然能够产电的菌株较多,然而它们大多数电化学 活性较低,其产生的电功率较为低下。尤其是革兰氏阳性菌,不仅细胞外包裹的一层油脂性 膜是非导电性材料并且细胞膜中富含肽聚糖等一些绝缘性物质,从而严重阻碍了微生物与 电极之间的电子交换,减小了 MFC的效率。因此,筛选更为高效的产电微生物成为MFC技术 的核心。
[0005] 微生物产电能力相差很大,产电微生物决定着MFC的功能及应用,目前已发现 的产电微生物主要集中在希瓦氏菌属(Shewanella)和地杆菌属(Geobacter) (Energy Environ. Sci. ,2011,4, 4366 - 4379)等一些革兰氏阴性菌。其中希瓦氏菌属于兼性厌 氧异养型,并且能利用多种有机物作为代谢底物。随着对产电微生物的深入研究,近来 关于希瓦氏菌在MFC中产电的报道也日益增多。Waston and Logan(Biotechnology and Bioengineering, 2〇10,1〇5(3) :489 -498)利用 Shewanella oneidensis MR-I, 18mM乳酸作为电子供体,仅产生电压120mV,输出功率40mW/m2 ;关于Shewanella oneidensis MR-I 产电原理解析,Bretschger 和 Obraztsova 等人(Appl. Environ. Microbiol, 2007, 73(21) :7003 - 7012)采用基因敲除法,分析了电子传递过程中的细胞色 素的作用。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一株经过ARTP等离子体诱变得到的具有高活 性产电能力的希瓦氏菌。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述希瓦氏菌在产电方面的应用。
[0008] 为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
[0009] 一株高产电的希瓦氏菌,其分类命名为希瓦氏菌(Shewanella oneidensis),已保 藏于中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC No :M2014340,保藏日期为2014年7月 16日。
[0010] 本发明的希瓦氏菌 Shewanella oneidensis CCTCC No :M2014340 的筛选方法,将 希瓦氏菌出发菌株Shewanella oneidensis MR-I经等离子体诱变后,利用W03显色技术筛 选得到可能高产电的菌株,再经过双室MFC进行筛选高产电能的菌株。
[0011] 其具体步骤如下:
[0012] (1)等离子体诱变:将希瓦氏菌原始菌株MR-I活化培养,培养温度28?30°C, 50mL的离心管装液量为5?10mL,培养时间12?16h,得到处于对数生长期的菌液,将培养 的细胞稀释至OD 6tltl = 0. 1?1. 0,滴加在灭菌冷却后的载片上,用无菌空气吹干;以氦气为 放电气体,以80?120W作为射频功率,以10?30SLM作为气体流量,以10?1800s作为 辐照时间对菌株进行等离子体诱变。
[0013] (2)三明治式培养技术初筛选:将诱变后的菌株分别涂布在固体培养基中,20min 之后,再涂布25mL无菌的WO3琼脂悬浮液,30°C厌氧培养,培养时间24?36h,观察颜色变 化,挑取蓝色部分菌落,种子培养,保存。
[0014] (3)96孔平板显色技术复筛选:将上述收集的菌株接种于种子培养基中,30°C温 室摇床培养12?16h后,达到对数期菌液,在8000rpm下离心3min收集菌体,用无菌乳酸 钠最小盐溶液悬浮,调细胞〇D_ = 1. 0备用。取IOOul含有乳酸钠最小盐溶液的备用菌液 加入96孔平板中,再分别加入SOul无菌含WO3簇状物(5g/L)的乳酸钠最小盐溶液,立即 加入80ul凡士林确保无氧状态,放入30°C厌氧箱,10、15、30、60min观察颜色变化。
[0015] (4)双室MFC技术筛选:将步骤(3)筛选出来的菌株接入种子液,培养温度28? 30°C,转速150rpm,培养时间12?16h。然后进行双室MFC技术,调至阳极室中菌体初始 0D_= 1.0,培养温度28?30°C;考察步骤⑶筛选出的菌株的产电量,同时选出产电量最 高的菌株。
[0016] (5)在上述筛选方法中:步骤(1)中所述的等离子体诱变方法中,优选100W作为 射频功率,10SLM作为气体流量,90s作为辐照时间。
[0017] 在上述筛选方法中:步骤(2)所述的固体培养基:蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂; 无菌的WO 3琼脂悬浮液包含WO3簇状物、钠盐、琼脂。
[0018] 在上述筛选方法中:步骤(3)所述的种子液为TSB水溶液包含胰蛋白胨、大豆蛋白 胨、肉汤;乳酸钠最小盐溶液包含乳酸钠、钠盐、钾盐、磷酸盐、羟乙基哌嗪乙磺酸及微量无 机盐化合物,分别为NTA、镁盐、锰盐。钠盐、亚铁盐、钙盐、钴盐、锌盐、铜盐、铝盐、镍盐、钨化 物、硼酸的一种或多种,WO 3簇状物的乳酸钠最小盐溶液,为乳酸钠最小盐溶液中添加 WO3簇 状物。
[0019] 在上述筛选方法中:步骤(4)所述双室MFC装置中,阳极液为钾盐、磷酸盐、铵盐, 乳酸钠作为电子供体。阴极液为钾盐、磷酸盐、铁氰化合物。
[0020] 其中,所述的双室MFC技术产电方法包含如下步骤:
[0021] (1)菌株活化:将希瓦氏菌 Shewanella oneidensis CCTCC No :M2〇14340 接种到 TSB种子培养基中,培养温度28?30°C,转速150rpm,培养时间12?16h ;
[0022] (2)装置搭建:安置阳极室的阳极,安置阴极室的阴极,安置介于阳极隔室和阴极 隔室之间用于分隔阳极室和阴极室的质子交换膜,进行灭菌处理;
[0023] (3)MFC技术:向阳极室中加入阳极液,接入希瓦氏菌Shewanella oneidensis CCTCC No :M2014340,阳极室初始0D_ = 1. 0,迅速密封阳极室,向阴极室加入阴极液,迅速 密封阴极室,至于30°C恒温箱,进行电压数据采集器采集数据。
[0024] 所述的阳极和阴极均为PAN基石墨软毡(5X5cm),以钛丝作为外接电路,外接电 阻为1000 Ω,质子交换膜为杜邦NafionNl 17。
[0025] 所述的阳极液为钾盐、磷酸盐、铵盐,乳酸钠作为电子供体。阴极液为钾盐、磷酸 盐、铁氰化合物。
[0026] 按照上述筛选方法获得的突变株CCTCC No :M2014340与出发菌株MR-I在固体培 养基上的菌落形态、色泽几乎相同可知,经诱变的突变株CCTCC No :M2014340仍旧属于希 瓦氏菌。
[0027] 上述高产电的希瓦氏菌在产电中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0028] 上述高产电的希瓦氏菌作为微生物燃料电池在产电中的应用也在本发明的保护 范围之内。
[0029] 上述希瓦氏菌作为微生物燃料电池进行产电的具体方法,包括如下步骤:
[0030] (1)构建微生物燃料电池:将含有燃料的阳极液加入到阳极室中,以高产电希瓦 氏菌CCTCC No :M2014340菌体作为阳极室接种物;将阴极液加入到阴极室中;
[0031] (2)利用微生物燃料电池产电:将微生物燃料电池放入28?30°C的温室中静置培 养,进行产电。
[0032] 步骤(1)中,所述的含有燃料的阳极液中,以乳酸钠为电子供体,乳酸钠的浓度为 20±0. 2mmol/L,优选 20mmol/L。
[0033] 步骤(1)中,含有燃料的阳极液优选配方如下:乳酸钠20±0.2mmol/L,氯化铵 0· 31±0· 02g/L,二水合磷酸二氢钠 2. 772±0· 05g/L,十二水合磷酸氢二钠 IL 5±0· 3g/L, 氯化钾0. 13±0. 01g/L,溶剂为水,pH = 7。
[0034] 步骤(1)中,所述的高产电希瓦氏菌CCTCC No :M2014340菌体预先经过如下方 式活化:由28?3〇V/V%甘油水溶液冷冻保藏的菌种接种于TSB种子培养基中,培养温度 28?30°C,转速150rpm,恒温培养菌体12?16h,达到指数生长期,以接种量为5v/v%转接 二级,在相同条件下培养12?16h。取得到的对数期菌液,离心,弃上清液,添加无菌生理盐 水摇匀,再次离心,如此反复清洗2次,得到菌泥,
[0035] 步骤(1)中,初始阳极室中菌体浓度0D600 = 1. 0±0· 1。
[0036] 步骤(1)中,所述的阴极液优选配方如下:二水合磷酸二氢钠2.772±0.05g/L, 十二水合磷酸氢二钠11. 5±0. 3g/L,氯化钾0. 13±0. 01g/L,铁氰化钾40±2mmol/L,溶剂 为水,pH = 7。。
[0037] 有益效果:本发明方法与现有技术相比,本发明的具有如下优势:
[0038] (1)本发明采用等离子体诱变希瓦氏菌,先利用"三明治式"固体培养基筛选出可 能具有高产电能力的菌落,再利用96孔平板WO 3显色技术筛出能够高产电的单菌落菌株, 最后利用双室MFC技术筛选和验证出高产电量的菌株。
[0039] (2)本发明为提高希瓦氏菌在MFC中的产电能力提供了一种研究方向。
[0040] (3)本发明的希瓦氏菌在20mM乳酸钠作为电子供体时,最大输出电压高达449mV, 比初始菌株MR-I提高了 18. 2%,最大输出功率密度为160mW/m2,比初始菌株MR-I提高了 82. 6%。

【专利附图】

【附图说明】
[0041] 本发明的微生物分类命名为希瓦氏菌ML_5Shewanella oneidensis ML-5,保藏单 位为中国典型培养物保藏中心,简称CCTCC,地址:中国.武汉.武汉大学,邮编:430072,保 藏编号为CCTCC NO :M 2014340,保藏日期为2014年7月16日。
[0042] 图1为希瓦氏菌的等离子体诱变存活率曲线。
[0043] 图2为以希瓦氏菌为阳极催化剂的微生物燃料电池结构原理图。
[0044] 图3a为本发明希瓦氏菌Shewanella oneidensis ML-5在20mM乳酸钠阳极液中 的产电活性图。
[0045] 图3b为初始菌株MR-I在20mM乳酸钠阳极液中的产电活性图。
[0046] 图4为本发明与初始菌株MR-I利用20mM乳酸钠作为电子供体的产电情况。

【具体实施方式】
[0047] 根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实 施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0048] 实施例1 :
[0049] 本实施例说明将希瓦氏菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。
[0050] 希瓦氏菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下:
[0051] 将希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-I菌株活化培养,培养温度28?30°C, 50mL离心管装液量为5?IOmL,转速150rpm,培养时间12?16h,得到生长旺盛的菌液; 按5v/v%转接二级,培养条件与活化相同。取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度0D_ = 1? I. 5,滴加在灭菌冷却后的载片上,用无菌空气吹干;以氦气为放电气体,以100W作为射频 功率,以10SLM作为气体流量,以10?1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变,诱 变后,将载体上的菌膜洗脱下来,计算存活率。实验结果如附图1所示;由图1可知,90s是 最佳的诱变辐照时间。
[0052] 实施例2 :
[0053] 本实施例说明筛选出高产电的拜氏梭菌的方法。
[0054] 其中,所使用的培养基配方如下所示:
[0055] (I)TSB 种子培养基:3g TSB/100ml 水
[0056] (2)三明治式培养基如下:
[0057] a)、固体培养基:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,琼脂15?20g/L。
[0058] b)、WO3琼脂悬浮液:WO3簇状物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂20g/L。
[0059] (3)乳酸钠最小盐溶液:乳酸钠2. 02g/L,氯化钠5. 85g/L,轻乙基哌嗪乙磺酸 II. 91g/L,氢氧化钠0. 3g/L,氯化铵I. 498g/L,氯化钾0. 097g/L,二水合磷酸二氢钠0. 67g/ L〇
[0060] 附加微量元素溶液(比例1:1000) :NTA (C6H9NO6) I. 5g/L,七水合硫酸镁30g/L,一 水合硫酸猛5g/L,氯化钠 lOg/L,七水合硫酸亚铁lg/L,二水合氯化興lg/L,六水合氯化钴 lg/L,氯化锌I. 3g/L,五水合硫酸铜0. lg/L,十二水合硫酸钾铝0. lg/L,硼酸0. lg/L,二水 合钥酸钠0. 25g/L,六水合氯化镍0. 25g/L,二水合钨酸钠0. 25g/L。
[0061] 附加氨基酸溶液(比例1:1000) :L-谷氨酸2g/L,L-精氨酸2g/L,DL-丝氨酸2g/ L〇
[0062] 附加维生素溶液(比例1:1000):生物素2g/L,叶酸2g/L,盐酸吡哆醇10g/L,核黄 素5g/L,烟碱酸5g/L,维生素 B55g/L,维生素 B12O. lg/L,p-对氨基苯甲酸5g/L,硫辛酸5g/ L〇
[0063] 含WO3簇状物的乳酸钠最小盐溶液:加 WO3簇状物的乳酸钠最小盐溶液。
[0064] (4)双室MFC中阳极液:乳酸钠20mM,氯化铵0· 31g/L,二水合磷酸二氢钠2. 772g/ L,十二水合磷酸氢二钠11. 5g/L,氯化钾0. 13g/L,pH = 7。
[0065] 双室MFC中阴极液:二水合磷酸二氢钠2. 772g/L,十二水合磷酸氢二钠11. 5g/L, 氯化钾0. 13g/L,铁氰化钾40mM,pH = 7。
[0066] 筛选步骤:
[0067] (1)三明治式培养技术初筛选
[0068] 将诱变后的载片置于装有1?2mL生理盐水的具塞试管中,剧烈震荡,将载片上的 菌株洗脱,稀释成不同浓度涂布于固体培养基平板上,20分钟后,再在固体平板培养基上涂 布25mL无菌WO 3琼脂悬浮液,28?30°C厌氧培养24?36h,挑选出具有颜色变化区的菌落, 种子培养基培养,保存。
[0069] (2) 96孔平板显色技术复筛选
[0070] 将上述收集的菌株和出发菌株MR-I接种于TSB种子培养基中,培养温度28? 30°C,转速150rpm,培养12?16h ;在8000rpm下离心3min收集菌体,用无菌乳酸钠最小盐 溶液悬浮,调细胞〇D_ = I. 0备用。取IOOul含有乳酸钠最小盐溶液的备用菌液加入96孔 平板中,再分别加入80ul无菌含WO3 (5g/L)簇状物的乳酸钠最小盐溶液,立即加入80ul凡 士林确保无氧状态,放入30°C厌氧箱,10、15、30、60min观察颜色变化,挑选出8株快速变蓝 及颜色深的菌株。
[0071] (3)双室MFC技术筛选
[0072] 将上述挑选得到的菌株和出发菌株MR-I接种于种子培养基中,培养温度28? 30°C,转速150rpm,培养时间12?16h,达到对数期菌液;转接二级种子,500ml的三角瓶中 装液量IOOmL,接种量5mL,培养温度28?30°C,转速150rpm,培养时间12?16h ;取对数期 菌液,8000rpm离心3min,弃上清液,添加无菌生理盐水摇勻,再次离心,如此反复清洗2次, 得到菌泥;按照初始阳极室中菌体浓度〇D_ = I. 0接种于阳极室,迅速密封阳极室,向阴极 室接入阴极液,密封阴极室,外接电阻1000 Ω,培养温度28?30°C,数据采集。当产生的电 压降低时,立即利用万用表及电阻箱测定输出电压,进行测定筛选菌株和出发菌株MR-I的 最大功率功率密度及最大输出电压,如表1所示:
[0073] 表 1
[0074]

【权利要求】
1. 一株高产电的希瓦氏菌,其分类命名为希瓦氏菌(Shewanella oneidensis),已保藏 于中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC No :M2014340,保藏日期为2014年7月 16日。
2. 权利要求1所述的高产电的希瓦氏菌在产电中的应用。
3. 权利要求1所述的高产电的希瓦氏菌作为微生物燃料电池在产电中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用,其特征在于,希瓦氏菌作为微生物燃料电池进行产电 的方法,包括如下步骤: (1) 构建微生物燃料电池:将含有燃料的阳极液加入到阳极室中,以高产电希瓦氏菌 CCTCC No :M2014340菌体作为阳极室接种物;将阴极液加入到阴极室中; (2) 利用微生物燃料电池产电:将微生物燃料电池放入28?30°C的温室中静置培养, 进行产电。
5. 根据权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,所述的含有燃料的阳极液中, 以乳酸钠为电子供体,乳酸钠的浓度为20±0. 2mmol/L。
6. 根据权利要求4或5所述的应用,其特征在于,含有燃料的阳极液配方如下:乳酸钠 20±0. 2mmol/L,氯化铵 0. 31±0. 02g/L,二水合磷酸二氢钠 2. 772±0. 05g/L,十二水合磷 酸氢二钠 11. 5±0. 3g/L,氯化钾 0. 13±0. 01g/L,溶剂为水,pH = 7。
7. 根据权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤⑴中,所述的高产电希瓦氏菌CCTCC No :M2014340菌体预先经过如下方式活化:由28?30v/v%甘油水溶液冷冻保藏的菌种接 种于TSB种子培养基中,培养温度28?30°C,转速150rpm,恒温培养菌体12?16h,达到指 数生长期,以接种量为5v/ v%转接二级,在相同条件下培养12?16h。
8. 根据权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,初始阳极室中菌体浓度 0D600 = 1. 0±0· 1。
9. 根据权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,所述的阴极液配方如 下:二水合磷酸二氢钠2. 772±0. 05g/L,十二水合磷酸氢二钠11. 5±0. 3g/L,氯化钾 0. 13±0. 01g/L,铁氰化钾 40±2mmol/L,溶剂为水,pH = 7。
【文档编号】C12R1/01GK104263672SQ201410354073
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】朱大伟, 郑晓, 孙梦茹 申请人:常州市第一人民医院
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1