集成微流控芯片及其用于三维肿瘤定位、构建、回收方法
【专利摘要】本发明公开了一种集成微流控芯片及其用于三维肿瘤定位、构建、回收方法。所公开的芯片由样品流动层和气动控制层组成，样品流动层设有入口、微腔、出口和微管道网络，气动控制层设有进气入口、气动控制结构和末端封闭的微管道网络。气动控制结构由末端封闭的微管道网络与进气口相连接。气动控制结构的高度大于末端封闭的微管道网络的高度。本发明可以在单个微流控芯片内连续完成肿瘤细胞的精确定位捕获、三维肿瘤形成与在线分析及其回收操作。该操作具有极强的时间与空间控制性及灵活性，便于多学科研究学者掌握；同时具有操作简单快捷、样品低消耗、细胞定位精确与高效高通量等特点，适用于多种三维肿瘤构建与分析操作。
【专利说明】集成微流控芯片及其用于三维肿瘤定位、构建、回收方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微流控芯片【技术领域】，尤其涉及一种集成微流控芯片及其用于实时控制性的高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤组织构建与回收。
【背景技术】
[0002]癌症是由于细胞的分裂失控和异常生长而引起的疾病，常伴随着恶性肿瘤的形成，进而导致人类和动物疾病并最终造成死亡。广泛开展肿瘤研究是探索癌症作用机理与推动临床治疗进展的源动力。目前，常规的动物体内实验研究方法能够高度还原特定肿瘤的发生发展过程，但在动态检测，微环境控制以及肿瘤组织实时操作分析方面缺乏足够的优势。相比较，常规体外肿瘤细胞培养法在很多方面能够弥补这些欠缺，如肿瘤细胞直接操作、细胞监测分析等。体外细胞培养主要包括二维培养和三维培养。其中三维肿瘤培养因具有更好的体内肿瘤生物学特性仿生能力，近年来受到国内外研究人员的认可和关注。迄今为止，体外制备三维肿瘤组织的方法众多，包括悬滴法，琼脂糖表面培养法和旋转培养法等。这些方法对于体外肿瘤仿生研究具有较强的推动作用，但由于这些细胞操作方法仍处于宏观界面操作水平，很难完成微观尺度下的一些操作。同时，其制备方法操作较为繁琐、且需要较多的人力，所制备的三维肿瘤均一度较低。这在很大程度上限制了基于三维肿瘤的后期试验的研究进度及其研究结果的精准性。因此，大力开发、开展微观界面条件下的肿瘤细胞操作与三维肿瘤仿生构建，对于更有效地进行肿瘤研究、早日突破肿瘤治疗难题是具有重大科学意义和社会意义的。
[0003]微流控芯片，作为本世纪极具代表性的一种微型操作与分析平台，在细胞研究微型化的发展道路上扮演着非常重要的角色。微流控芯片的显著特征在于它的微型化，即微米级的芯片单元、微米级尺度下的细胞操作分析、生物样本的微纳升甚至皮升级操作处理与检测分析水平。目前，基于微流控芯片的肿瘤细胞操作多为被动式操作，在很大程度上缺乏细胞操作灵活性与时空控制能力。已开发的芯片微功能单元，如微筛、微孔，尽管能够完成肿瘤细胞的原位捕获，但由于其结构固定，无法实现实时空间控制的肿瘤细胞定位、三维肿瘤构建与分析及其回收操作与后分析研究。此外，如果采用极端条件处理进行样品回收，如使用极高流速液流，势必会造成三维肿瘤结构的破坏以及肿瘤细胞在这些固定微功能单元位置的残留，不利于三维肿瘤操作。因此，开发一种可控式高通量肿瘤细胞定位与三维肿瘤仿生构建芯片是十分有必要的。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于，提供一种含有气动控制结构的集成微流控芯片，并提供一种用于平行高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤仿生构建及其肿瘤回收的芯片操作方法。该芯片操作简单、快捷，便于多学科研究学者掌握。
[0005]为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案:
[0006]一种集成微流控芯片，该微流控芯片由样品流动层和气动控制层构成，所述样品流动层设有入口、微腔、出口和微管道网络，所述气动控制层设有进气入口、气动控制结构和末端封闭的微管道网络，所述气动控制结构由末端封闭的微管道网络与进气口相连接，所述气动控制结构的高度大于末端封闭的微管道网络的高度。
[0007]优选的，气动控制层高度与微管道网络高度的比值大于等于2，且小于等于5。
[0008]所述微流控芯片样品流动层设有I个入口、4_16个微腔、4-16个出口和一个对称微管道网络，每个微腔对应连接一个出口，并且微腔与出口之间通过对称微管道网络连接；所述气动控制层设有I个进气入口、144-1152个气动控制结构和一个末端封闭的微管道网络，所述气动控制结构由末端封闭的微管道网络与进气口相连接；优选的，每36-72个气动控制结构与样品流动层的一个微腔自下而上重叠对应。
[0009]本发明提供的集成微流控芯片，所述芯片制备材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，与涂有PDMS聚合物的玻璃或透明塑料材料进行不可逆封接，从而确保所使用微流控芯片质量以及芯片内各个微功能单元的完整性。
[0010]优选的，本发明提供的集成微流控芯片，所述微流控芯片样品流动层高度为100-500 μ m ;所述气动控制结构高度为20-150 μ m，末端封闭的微管道网络高度为10-30 μm。
[0011]相对于现有技术，本发明提供的集成微流控芯片，所述气动控制层中的气动控制结构高度大于微管道网络高度。气动控制结构与样品流动层之间的PDMS膜厚度明显小于气动控制层微管道网络与样品流动层之间的PDMS膜厚度。当在外源气压为12_30psi作用下，气动控制结构对应的PDMS膜形变明显大于气动控制层微管道网络对应的PDMS膜形变，并能够形成更高的三维结构。
[0012]气动控制结构和微管道网络的不同高度在于实现肿瘤细胞在气动控制结构对应微腔位置的精确定位，并减少肿瘤细胞被微管道网络拦截和在微腔其他位置的残留。本发明的微流控芯片适用于所有动物正常细胞、胚胎、肿瘤细胞，及各种微米级颗粒材料的富集操作。
[0013]本发明提供的集成微流控芯片用于高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤仿生构建及其肿瘤回收，所述细胞样品为哺乳动物肿瘤细胞及肿瘤细胞系。
[0014]本发明提供了一种基于集成微流控芯片的高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤仿生构建及其肿瘤回收的操作方法，具体步骤如下:
[0015]在流速范围为5-20 μ L/min条件下，将含抗细胞黏附物的溶液由样品流动层入口，通过对称微管道网络，灌注进入微腔内，对微腔进行抗细胞黏附修饰；
[0016]然后灌注新鲜细胞培养液，清洗微腔；
[0017]灌注细胞密度为I X 15-1 X 17个/mL的肿瘤细胞悬液，细胞进入微腔内；
[0018]然后通过气动控制层的进气入口对气动控制结构进行一定外源气压作用12-30psi，使其由二维结构转变为三维结构，所形成的三维结构可完成对肿瘤细胞的拦截定位捕获；
[0019]当细胞定位操作完成后，灌注新鲜细胞培养液，进行3-20天的细胞培养，肿瘤细胞自聚集形成三维肿瘤组织，进而开展微流控芯片内的三维肿瘤在线分析；
[0020]当需要回收三维肿瘤组织时，可以随时撤销施加于气动控制结构的外源气压，使其还原为二维结构，肿瘤组织随液流离开气动控制结构对应的微腔内捕获位点，并到达样品流动层出口。
[0021]本发明提供的集成微流控芯片用于高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤仿生构建及其肿瘤回收过程中，使用含抗细胞黏附物的溶液对样品流动层微腔进行抗细胞黏附修饰，所述抗细胞黏附物为牛血清白蛋白、聚乙二醇及其它已知的抗细胞黏附蛋白或抗细胞黏附聚合物。
[0022]相对于现有技术，本发明的集成微流控芯片的有益效果在于:可以在单个微流控芯片内连续完成肿瘤细胞的定位捕获、三维肿瘤仿生构建与分析及其回收操作。相对于以往微流控芯片内肿瘤细胞操作及三维肿瘤构建方法，其具有更好的时间与空间控制性及灵活性，同时具有操作简单快捷、样品低消耗、细胞定位精确与高效高通量等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1本发明微流控芯片的样品流动层和气动控制层平面结构参考示意图，其中I为流动层进样入口，2和3为流动层管道出口，4为气动控制层中进气入口。
[0024]图2为样品流动层单个微腔和气动控制层单组气动控制结构阵列单元参考示意图，其中21为肿瘤细胞和液流入口，22为肿瘤细胞和液流出口，23为气动控制层中气动控制结构的进气入口，24为气动控制层的气动控制结构，25为气动控制层中微管道网络，26为样品流动层微腔内的微柱子。
[0025]图3为施加一定外源气压条件下的气动控制结构参考示意图，其中31为气动控制结构的二维状态，32为气动控制层的微管道网络。
[0026]图4为施加一定外源气压情况下的气动控制结构参考不意图,其中41为气动控制结构的三维状态，42为气动控制层的微管道网络，43为施加外源气压的进气入口。
[0027]图5为本发明微流控芯片内肿瘤细胞进样参考示意图，其中51为细胞进样入口，52为细胞进样出口，53为单个肿瘤细胞，54为二维状态的气动控制结构，55为气动控制层的微管道网络。
[0028]图6为本发明微流控芯片内细胞定位捕获参考示意图，其中61为三维状态的气动控制结构，62为已捕获的肿瘤细胞群，63为施加外源气压的进气入口。
[0029]图7为本发明微流控芯片微腔内新鲜细胞培养基灌注参考示意图，其中71为细胞悬液中的肿瘤细胞。
[0030]图8为本发明微流控芯片内三维肿瘤自聚集形成参考示意图，其中81为单个三维肿瘤。
[0031]图9为实施例2微流控芯片内气动控制结构捕获细胞形成的三维肿瘤荧光标记图。
[0032]图10为微流控芯片内三维肿瘤回收示意图，其中101为即将离开微腔的单个三维肿瘤。
【具体实施方式】
[0033]本发明的气动控制结构具有两种空间结构状态:包括二维静息状态和三维激发状态。当在大气压下，气动控制结构为二维结构；当在一定外源气压作用下，气动控制结构与样品流动层之间的PDMS膜发生形变，气动控制结构受激发而形成三维结构。其中，三维气动控制结构在于对肿瘤细胞的定位、三维肿瘤组织构建控制性操作。二维气动控制结构在于对所仿生构建的肿瘤组织的回收操作。
[0034]本发明的集成微流控芯片的制备材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，与涂有PDMS聚合物的玻璃或透明塑料材料进行不可逆封接，从而确保所使用微流控芯片质量以及芯片内各个微功能单元的完整性。
[0035]本发明所述的高度均指工作腔内的高度。
[0036]本发明提供的集成微流控芯片用于高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤仿生构建及其肿瘤回收，所述细胞样品为哺乳动物肿瘤细胞及肿瘤细胞系。
[0037]本发明提供了一种基于集成微流控芯片的高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤仿生构建及其肿瘤回收的操作方法，具体步骤如下:在流速范围为5-20 μ L/min条件下，将含抗细胞黏附物的溶液由样品流动层入口，通过对称微管道网络，灌注进入微腔内，对微腔进行抗细胞黏附修饰；然后灌注新鲜细胞培养液，清洗微腔；灌注细胞密度为I X 15-1 X 17个/mL的肿瘤细胞悬液，细胞进入微腔内；然后通过气动控制层的进气入口对气动控制结构进行一定外源气压作用12_30psi，使其由二维结构转变为三维结构，所形成的三维结构可完成对肿瘤细胞的拦截定位捕获；
[0038]当细胞定位操作完成后，灌注新鲜细胞培养液，进行3-20天的细胞培养，肿瘤细胞自聚集形成三维肿瘤组织，进而开展微流控芯片内的三维肿瘤在线分析；
[0039]当需要回收三维肿瘤组织时，可以随时撤销施加于气动控制结构的外源气压，使其还原为二维结构，肿瘤组织随液流离开气动控制结构对应的微腔内捕获位点，并到达样品流动层出口。
[0040]本发明提供的集成微流控芯片用于高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤仿生构建及其肿瘤回收过程中，使用含抗细胞黏附物的溶液对样品流动层微腔进行抗细胞黏附修饰，抗细胞黏附物为牛血清白蛋白、聚乙二醇及其它已知的抗细胞黏附蛋白或抗细胞黏附聚合物。
[0041]以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0042]实施例1:
[0043]本实施例所使用的集成微流控芯片为 申请人:的实验室设计并制备。制备集成微流控芯片所使用的材料为PDMS聚合物，不可逆封接于涂有PDMS薄膜的玻璃表面。
[0044]本实施例所使用的集成微流控芯片由样品流动层和气动控制层构成。
[0045]如图1所示，样品流动层包含I个入口⑴、8个微腔、8个出口(2和3)和I个对称微管道网络。每个微腔对应连接I个出口(2和3)，8个微腔呈对称分布，并由对称微管道网络与入口(I)连接。
[0046]气动控制层包含I个进气入口(4)、360个气动控制结构和I个末端封闭的微管道网络。样品流动层高度为100 μ m，气动控制结构高度为30 μ m，微管道网络高度为15 μ m，其高度比值为2。气动控制结构由微管道网络与进气口相连接。
[0047]本实施例所使用集成微流控芯片的气动控制层单组气动控制结构阵列与样品流动层单个微腔自下而上重叠对应，每组阵列由45个气动控制结构组成(如图2所示)。该微流控芯片样品流动层共包含了 8个微腔(图1所示)，分别对应于气动控制层的8组气动控制结构阵列。
[0048]本实施例所使用集成微流控芯片可同时实现360个平行的肿瘤细胞精确定位操作。
[0049]当未施加压力(Opsi，即大气压下)时，气动控制结构呈二维形态(如图3所示)；当施加一定外源气压(12-30psi)时，气动控制结构呈三维空间形态(如图4所示)，可以完成对肿瘤细胞的主动机械式拦截定位捕获操作。
[0050]在外源气压作用下，气动控制层的气动控制结构高度为100 μ m，微管道网络高度为25 μ m，其高度比值增大为4。
[0051]气动控制结构和微管道网络的不同高度不仅实现肿瘤细胞在气动控制结构对应微腔位置的精确定位，同时也减少肿瘤细胞被微管道网络拦截和在微腔其他位置的残留。
[0052]实施例2:
[0053]该实施例为实施例1提供的微流控芯片的高通量H印G2肝癌细胞定位捕获与三维肿瘤构建:
[0054]首先对实施例1所述微流控芯片进行抗细胞黏附修饰，即通过微量注射泵将浓度为2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液以5 μ L/min的流量由芯片流动层入口⑴导入，BSA经对称微管道进入微腔内；室温孵育2小时；然后用新鲜DMEM细胞培养液灌注清洗；
[0055]对实施例1所述微流控芯片进行细胞灌注，即将细胞密度为I X 15个/mL的肝癌细胞悬液以5 μ L/min的流量由芯片流动层入口(I)导入，细胞经对称微管道进入细胞微腔内(图5所示);
[0056]给予气动控制结构一定气压(12psi)，使其呈现为三维空间形态(如图4所示)，从而捕获肝癌细胞(如图6所示)，一定数量的细胞群被定位于气动控制结构对应的流动层微腔位置(62)；
[0057]进一步灌注不含肿瘤细胞的新鲜DMEM细胞培养液，清洗掉微腔内的残留细胞悬液(如图7所示)；
[0058]将该芯片放置于37°C、5% CO2饱和湿度条件下连续培养7天，使肝癌细胞自聚集形成三维肿瘤组织(如图8所示)；然后进行选择性荧光标记检测分析(如图9所示)。
[0059]实施例3:
[0060]该实施例为实施例1提供的微流控芯片的高通量MCF-7乳腺癌细胞定位捕获与三维肿瘤构建。
[0061]首先对实施例1所述微流控芯片进行抗细胞黏附修饰，即通过微量注射泵将浓度为lmg/mL的脱脂奶粉溶液以5 μ L/min的流量由芯片流动层入口⑴导入，脱脂奶粉溶液经对称微管道进入微腔内；室温孵育2小时；然后用新鲜DMEM细胞培养液灌注清洗；
[0062]首先对实施例1的微流控芯片进行细胞灌注，即通过微量注射泵将细胞密度为I X 17个/mL的乳腺癌细胞悬液以15 μ L/min的流量由芯片流动层入口⑴导入，细胞经对称微管道进入细胞微腔内(参考图5所示)；
[0063]给予气动控制结构一定气压(30psi)，使其呈现为三维空间形态，从而捕获乳腺癌细胞(参考图6所示)，一定数量的细胞群被定位于气动控制结构对应的流动层微腔位置
(62)；
[0064] 进一步灌注不含肿瘤细胞的新鲜DMEM细胞培养液，清洗掉微腔内的残留细胞悬液(参考图7所示)；
[0065]将该芯片放置于37°C、5% CO2饱和湿度条件下连续培养15天，使乳腺癌细胞自聚集形成三维肿瘤组织；然后进行乳腺癌相关药物筛选分析。
[0066]实施例4:
[0067]该实施例为提供实施例2所述微流控芯片内的三维肿瘤组织回收。根据特定需求，准备对微流控芯片内三维肿瘤进行回收时，可任意选择特定的时间点撤销作用于气动控制结构的外源气压，使其降至Opsi，气动控制结构还原为二维形态。芯片样品流动层微腔内三维肿瘤被释放，并随液流排出，进入芯片流动层出口(如图10所示)，从而实现三维肿瘤组织的回收。
【权利要求】
1.一种集成微流控芯片，该集成微流控芯片包括样品流动层和气动控制层组成，所述样品流动层设有入口、微腔、出口和微管道网络，所述气动控制层设有进气入口、气动控制结构和末端封闭的微管道网络，所述气动控制结构由末端封闭的微管道网络与进气口相连接，其特征在于:所述气动控制结构的高度大于末端封闭的微管道网络的高度。
2.如权利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述气动控制结构的高度与末端封闭的微管道网络的高度比值大于等于2，且小于等于5。
3.如照权利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片的制备材料为聚二甲基硅氧烷。
4.按照权利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片样品流动层设有I个入口、4-16个微腔、4-16个出口和I个对称微管道网络，每个微腔对应连接一个出口，并且微腔与出口之间通过对称微管道网络连接；所述芯片气动控制层设有I个进气入口、144-1152个气动控制结构和一个末端封闭的微管道网络，气动控制结构由末端封闭的微管道网络与进气口相连接；每36-72个气动控制结构与一个微腔自下而上重叠对应。
5.按照权利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述样品流动层高度为100-500 μ m;所述气动控制结构的高度为20-150 μ m，所述末端封闭的微管道网络高度为10-30 μ mD
6.如权利要求1所述的集成微流控芯片用于高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤组织构建及回收，其特征在于:所述细胞样品为哺乳动物肿瘤细胞及肿瘤细胞系。
7.如权利要求6所述的高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤组织构建及其回收，其特征在于:包括: 在流速范围为5-20 μ L/min条件下，将含抗细胞黏附物的溶液由样品流动层入口，通过对称微管道网络，灌注进入微腔内，对微腔进行抗细胞黏附修饰； 然后灌注新鲜肿瘤细胞培养液，清洗微腔； 灌注细胞密度为I X 15-1 X 17个/mL的肿瘤细胞悬液，细胞进入微腔内; 然后通过气动控制层的进气入口对气动控制结构进行12-30psi外源气压作用，使其由二维结构转变为三维结构，所形成的三维结构可完成对肿瘤细胞的拦截定位捕获； 当细胞定位操作完成后，灌注新鲜肿瘤细胞培养液，进行3-20天的细胞培养，肿瘤细胞自聚集形成三维肿瘤组织； 当需要回收三维肿瘤组织时，可以随时撤销施加于气动控制结构的外源气压，使其还原为二维结构，肿瘤组织随液流离开气动控制结构对应的微腔内捕获位点，并到达样品流动层出口。
8.按照权利要求7所述的高通量肿瘤细胞定位、三维肿瘤组织构建及其回收，其特征在于:所述抗细胞黏附物为牛血清白蛋白或聚乙二醇。
【文档编号】C12M1/04GK104164360SQ201410366445
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】刘文明, 王进义, 王建春, 许娟, 李天保, 涂琴, 王垚磊 申请人:西北农林科技大学