一种r-3-氨基哌啶的生物制备方法
【专利摘要】一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，按照SEQIDNO：1所示的序列进行全基因合成，克隆入表达载体pET22a制备重组表达载体，将该载体转入大肠杆菌制备出重组D-转氨酶的基因工程菌；对该菌进行培养制备出重组D-转氨酶基因工程菌；反应溶液中加入加入终浓度为10-300mmol/L的3-酮基哌啶、质量浓度为2-15%的二甲基亚砜或乙腈、终浓度为0.1-1mmol/L的磷酸吡哆醛、终浓度为0.02-1mol/L的异丙胺或D-丙氨酸，和质量浓度为0.2-0.4%的重组D-转氨酶组成反应体系进行反应；反应结束后提取反应液中的R-3-氨基哌啶；本发明成本低，转化率达到97%以上，产物得率大于85%，没有副产物，更适合工业应用。
【专利说明】一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及R-3-氨基哌啶的制备方法，具体的说是一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法。
【背景技术】
[0002]生物催化具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点，因此生物催化在新药的研究和开发中得到了广泛的应用。此外，利用理性设计和定向进化对生物催化剂进行改造优化，如提高催化剂的稳定性和底物选择性，将使其能够更好地应用于生产工艺。转氨酶作为生物催化剂主要是用于合成手性氨，手性氨基酸以及手性氨醇。
[0003]R-3-氨基哌啶在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，结构式如下:
【权利要求】
1.一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于:其制备方法包括以下步骤: 步骤一、重组D-转氨酶基因工程菌的制备 按照人工设计如SEQ ID NO:1所示的序列进行全基因合成，克隆入pET24a的Nde I和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌； 步骤二、重组D-转氨酶的制备 将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37°C培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1% ;然后置于37°C下培养至0D600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β -D-半乳糖苷或终质量浓度为0.5%的D-乳糖，置于25-28°C继续培养20-24h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体，洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用； 步骤二、R-3-氨基哌唳的制备 在反应溶液中依次加入终浓度为10-300mmol/L的底物、终质量百分比浓度为2-15%的助溶剂、终浓度为0.Ι-lmmol/L的辅因子、终浓度为0.02-lmol/L的氨基供体和终质量百分比浓度为0.2-0.4%的重组D-转氨酶组成反应体系；将该反应体系在25-30°C的条件下反应24-26h ;反应结束 后，检测反应液中R-3-氨基哌啶的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反应液中的R-3-氨基哌啶，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基哌啶； 所述底物为3-酮基哌啶；所述的反应溶液为pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH值为 8.0-11.0 的 50-100mmol/L Tirs 缓冲液或pH值为 8.0-11.0 的 50-100mmol/L碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜或乙腈；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺或D-丙氨酸。
2.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于:步骤二中所述超声破碎的具体方法为:将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为工作5s，间歇15s，循环数30。
3.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于:步骤二所述检测上清液中蛋白含量的方法为Bradford法。
4.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于:步骤三中反应体系的反应过程，取样并采用高效液相进行检测样品中R-3-氨基哌啶光学纯度和转化率，以监控其反应过程。
5.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于:步骤三中反应体系的反应过程，取样并采用毛细管电泳测定样品中R-3-氨基哌啶的光学纯度和转化率，以监控其反应过程。
【文档编号】C12N15/70GK104178536SQ201410372141
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】范文超, 丁鹏 申请人:洛阳华荣生物技术有限公司