精子洗涤液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种精子洗涤液及其制备方法，解决精子清洗时维持精子的活力，降低精子的死亡率等技术问题。它是通过多种溶质溶于超纯净水中进行调配而成的清洗培养液，该溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质；该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、牛磺酸、非必需氨基酸和杀菌剂等；该原液溶质为人血清白蛋白。本发明包含有多种适合精子生存和生长的有机或无机成份，在精子清洗过程中，能维持精子原有活力，并有效地去除精液中的杂物，为试管婴儿的培育或精子的冷冻贮藏提供了保证。
【专利说明】精子洗涤液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于人工辅助生殖【技术领域】，涉及一种用于精子清洗的化学剂，尤其是一种精子洗涤液及其制备方法。
【背景技术】
[0002]目前人类不孕率提高促使试管婴儿技术的发展。在试管婴儿技术中首先需采集良好的精子，精子的优劣决定试管婴儿的成败。在试管婴儿技术中其精子来源主要有两方面:直接采集人体精子，或从精子贮藏库中提取。无论精子来源如何都必须使用清洗液对精子进行科学地洗涤，以收集活动能力较强、质量良好的精子，使精子获得足够的能量，同时除去精液中有害成份及死精子、炎细胞等。一方面保证冷冻贮藏的精液不变质、质量优良，另一方面在实施试管婴儿时对精液进行洗涤处理和筛选，保证培育优越的婴儿。
[0003]目前使用的清洗液(或洗涤液等)品种不统一，效果不明显，且价格昂贵。有些洗涤液中调配的营养不全，在清洗过程中容易造成精子的死亡或清子获能不足活力较低，如在精子活力实验中，精子保持活力的比率较低(同样的实验过程、同批次精液，下同)，其比率接近或低于合格标准(保持活力率> 75% )。有些洗涤液的稠度较高，在精洗过程难以一次性将精液中的有害成份、死精子和炎细胞去除，造成冷冻贮藏的精液质量不能得到保证。
[0004]另外，一般精子洗涤液在使用前不能直观地判断有效性的好坏，如果在洗涤液变质后仍继续使用将对实验或临床操作造成不可逆转的结果。
【发明内容】
[0005]本发明主要是解决精子清洗时更好地维持精子的活力、降低精子的死亡率等技术问题，以便更好的冷冻冷藏或为辅助生殖技术提供有力保证，避免风险发生。进而提供一种各项指标均达到体外清洗培养液的标准、有利精子生存、使用安全且易于判断该清洗培养液是否变质的精子洗涤液。
[0006]本发明的精子洗涤液，它是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成；该多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质；该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸；该原液溶质为人血清白蛋白；该杀菌剂为庆大霉素；该除菌是清洗培养液在超净工作台下利用0.2 μ m的滤膜进行过滤的过程。
[0007]进一步，该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下:氯化钠92.815~102.585mmol/L,氣化钟 4.465 ~4.935mmol/L,硫酸续 0.19 ~0.21 mmol /I,,葡萄糖 2.66 ~
2.94mmol/L,磷酸二氢钾 0.3515 ~0.3885mmol/L,氯化钙 1.9 ~2.lmmol/L,乳酸钠12.18 ~13.48mmol/L、丙丽酸纳 0.3135 ~0.3465mmol/L、碳酸氧纳 3.8 ~4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95~1.05mmol/L、牛磺酸0.095~0.105mmol/L、4_轻乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 19.95~22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5~10.5ml/L ;该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75~5.25g/L。
[0008]更进一步，该杀菌剂为庆大霉素，其在清洗培养液中的含量为9.5~10.5mg/L.
[0009]再进一步，该清洗培养液中还具有用以判断该清洗培养液pH值的指示剂；该指示剂为酚红，在清洗培养液中的含量为9.5~10.5mg/L。
[0010]进一步，该清洗培养液的pH值为7.20~7.40 ;该清洗培养液的渗透压为260~290m0sm/Kg。
[0011]更进一步，该非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几种。
[0012]本发明的一种如上所述的清子洗涤液的制备方法，它包括以下步骤:
[0013](I)、清洗培养液的配制:
[0014]a、先按照各溶质的含量和配制容量要求称取或量取各溶质，并分开放置；同时准备好带刻度调制容器和超纯净水，并将称量好的超纯净水加入调制容器中；
[0015]b、将除碳酸氢钠外的各基础液溶质按先固体后液体的顺序溶于调制容器内的超纯净水中；
[0016]C、向上述步骤b所得溶液中加入所量取的杀菌剂和所称取的NaHCO3基础液溶质，同时根据需要添加指示剂，得基础液；
[0017]d、向上述步骤c所得基础液中加入所称取的人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得原液；
[0018]e、检测上述步骤d所得的原液的渗透压和pH值，通过滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液调整其pH值至7.20~7.40，并记录最终渗透压和pH值
[0019](2)、清洗培养液的处理:
[0020]a、除菌，将上述的所得清洗培养液在超净工作台下利用0.2μπι的滤膜过滤除菌；
[0021]b、分装及冷存，在无菌环境下对上述过滤后的清洗培养液进行分装、封口，并放置于冰箱或冷库内在2~8 °C条件下保存，得精子洗涤液；
[0022]C、检验，取上述分装好的精子洗涤液进行检测；检测项目包括pH值检测、渗透压检测、细胞毒性检测、皮内刺激反应检测、致敏反应检测、无菌检测、热原检测、细菌内毒素检测、体外鼠胚试验和精子活力试验，以判断该精子洗涤液是否合格。
[0023]本发明的精子洗涤液可根据需要添加指示剂酚红，酚红在pH值变化时颜色变化明显，PH值在7.0~7.5范围内酚红溶液为粉红色到橙红色，当pH值小于6.8时为黄色，当PH值大于8.4时为红色，变色比较明显，精子洗涤液的pH值在7.20~7.40范围内溶液为粉红色到橙红色，当精子洗涤液颜色与此不符时，说明该精子洗涤液变质，不能用于实验或临床，从而避免了使用变质精子液而产生的风险。当不添加指示剂时，本发明的洗涤液呈透明、清澈，在有效期内使用能够保证液体不变质。
[0024]本发明通过使用抗生素来抑制细菌的生长，如庆大霉素是一种光谱、热稳定性好的抗生素，在精子洗涤液中添加庆大霉素可以有效抑制细菌的生长。
[0025]本发明包含有多种适合精子生存和生长的有机或无机成份，在对精子的清洗过程中，能创建适合于精子的生存环境，维持了精子原有活力，同时能有效地去除精液中的杂物，杀死有害细菌等，为试管婴儿的培育或精子的冷冻贮藏提供了保证。
[0026]本发明精子洗涤液的原料均是已经证明其安全性的物质，在制备过程中其溶剂采用超纯水，超纯水的总有机碳(TOC)超低，避免了因杂质过多影响测定的结果。
[0027]本发明配制工艺操作简单合理，检测严密，能够提供新鲜的培养液供生殖中心或科研院所使用。
【具体实施方式】
[0028]以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
[0029]实施例一
[0030]本发明的精子洗涤液是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成。该超纯净水的物理标准为:①流速为0.05Lpm-2.0Lpm、②在25°C时电阻率为18.2ΜΩ.cm、③在25°C时电导率为0.055 μ S/cm ;化学标准为:热原质< 0.001Eu/ml，微粒(l/ml，T0C<5ppb。该超纯净水也可用注射用水替代。所述多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质。通过基础液溶质调配创建适合于精子生存的环境。该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸。该原液溶质为人血清白蛋白，用于提供精子生存的必要的培养物质。该杀菌剂为庆大霉素，用于杀灭溶液中的细菌。
[0031]该除菌是清洗培养液在超净工作台下利用0.2 μ m的滤膜过滤除菌过程。通过滤膜除去清洗培养液中有关细菌和杂物。
[0032]上述基础液溶质在清洗培养液中的含量如下:氯化钠92.815mmol/L(即配制后的清洗培养液中每升含有氯化钠92.815mmol,下同)、氯化钾4.465mmol/L、硫酸镁0.19mmol/L、葡萄糖 2.66mmol/L、憐酸二氧钟 0.3515mmol/L、氣化?丐 1.9mmol/L、乳酸纳 12.18mmoI /L、丙酮酸钠0.3135mmol/L、碳酸氢钠3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95mmol/L、牛磺酸0.095mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L ;该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75g/L。具体参见表1的“配方I”一栏。
[0033]表1精子洗涤液中物质含量:
[0034]
【权利要求】
1.一种精子洗涤液，它是对多种溶质溶于超纯净水所配制的清洗培养液进行除菌而成，该多种溶质包括基础液溶质、杀菌剂和原液溶质，其特征在于:该基础液溶质包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸；该原液溶质为人血清白蛋白；该杀菌剂为庆大霉素；该除菌是清洗培养液在超净工作台下利用0.2 μ m的滤膜进行过滤的过程。
2.根据权利要求1所述的精子洗涤液，其特征在于:该基础溶质在清洗培养液中的含量如下:氯化钠92.815~102.585mmol/L,氯化钾4.465~4.935mmol/L,硫酸镁0.19~0.21 mmol /I,,葡萄糖 2.66 ~2.94mmol/L,憐酸二氧钟 0.3515 ~0.3885mmol/L,氣化?丐1.9 ~2.1 mmol/L,乳酸纳 12.18 ~13.48mmol/L、丙丽酸纳 0.3135 ~0.3465mmol/L、碳酸氢钠3.8~4.2mmol/L、丙氛酸谷氛酸胺0.95~1.05mmol/L、牛横酸0.095~0.10SmmoI /L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸19.95~22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5~10.5ml/L ;该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75~5.25g/L。
3.根据权利要求2所述的精子洗涤液，其特征在于:该庆大霉素在清洗培养液中的含量为 9.5 ~10.5mg/L。
4.根据权利要求3所述的精子洗涤液，其特征在于:该清洗培养液中还具有用以判断该清洗培养液pH值的指示剂；该指示剂为酚红，在清洗培养液中的含量为9.5~10.5mg/L0
5.根据权利要求4所 述的精子洗涤液，其特征在于:该清洗培养液的pH值为7.20~7.40 ;该清洗培养液的渗透压为260~290m0sm/Kg。
6.根据权利要求2或3或4或5所述的精子洗涤液，其特征在于:该非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸中的一种或者几种。
7.根据权利要求6所述的精子洗涤液，其特征在于:该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下:氯化钠92.815mmol/L、氯化钾4.465mmol/L、硫酸镁0.19mmol/L、葡萄糖2.66mmol/L、憐酸二氧钟 0.3515mmol/L、氣化|丐 1.9mmol/L、乳酸纳 12.18mmol/L、丙丽酸纳0.3135mmol/L、碳酸氢钠 3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺 0.95mmol/L、牛磺酸 0.095mmol/L>4-羟乙基哌嗪乙磺酸19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L ;该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为4.75g/L。
8.根据权利要求6所述的精子洗涤液，其特征在于:该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下:氯化钠97.7mmol/L、氯化钾4.70mmol/L、硫酸镁0.20mmol/L、葡萄糖2.80mmol/L、憐酸二氧钟 0.37mmol/L、氣化?丐 2.0mmol/L、乳酸纳 12.84mmol/L、丙丽酸纳 .0.33mmol/L、碳酸氢钠4.0mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.0mmol/L、牛磺酸0.10mmol/L、4_轻乙基哌嗪乙磺酸21.0mmol/L及非必需氨基酸10ml/L ;该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为5g/L。
9.根据权利要求6所述的精子洗涤液，其特征在于:该基础液溶质在清洗培养液中的含量如下:氯化钠102.585mmol/L、氯化钾4.935mmol/L、硫酸镁0.21mmol/L、葡萄糖.2.94mmol/L、憐酸二氧钟 0.3885mmol/L、氣化韩 2.lmmol/L、乳酸纳 13.48mmol/L、丙丽酸纳.0.3465mmol/L、碳酸氢钠 4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺 1.05mmol/L> 牛磺酸 0.105mmol/L>.4-羟乙基哌嗪乙磺酸22.05mmol/L及非必需氨基酸10.5ml/L ;该人血清白蛋白在清洗培养液中的含量为5.25g/L。
10.一种如权利要求3~9任意项所述的清子洗涤液的制备方法，其特征在于:它包括以下步骤: (1)、清洗培养液的配制: a、先按照各溶质的含量和配制容量要求称取或量取各溶质，并分开放置；同时准备好带刻度调制容器和超纯净水，并将称量好的超纯净水加入调制容器中； b、将除碳酸氢钠外的各基础液溶质按先固体后液体的顺序溶于调制容器内的超纯净水中； C、向步骤b所得溶液中加入所量取的杀菌剂和所称取的NaHC03溶质，同时根据需要添加指不剂，得基础液； d、向步骤c所得基础液中加入所称取的人血清白蛋白，震荡或搅拌混合均匀，得原液； e、检测步骤d所得的原液的渗透压和pH值，通过滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液调整其PH值至7.20~7.40，并记录最终渗透压和pH值。 (2)、清洗培养液的处理: a、除菌，将上述的所得清洗培养液在超净工作台下利用0.2μπι的滤膜过滤除菌； b、分装及冷存，在无菌环境下对过滤后的清洗培养液进行分装、封口，并放置于冰箱或冷库内在2~8°C条件下保存，得精子洗涤液； c、检验，取分装好的精子洗涤液进行检测；检测项目包括pH值检测、渗透压检测、细胞毒性检测、皮内刺激反应检测、致敏反应检测、无菌检测、热原检测、内毒素检测、体外鼠胚试验和精子活力试验，以判断该精子洗涤液是否合格。
【文档编号】C12N5/076GK104164401SQ201410396987
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】王维华, 周淑梅, 黄永军 申请人:沈阳洁瑞生物技术有限公司