一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌及其应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)DC-Tx,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCCNO.9462，保藏日期：2014年7月15日。本发明筛选出高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌DC-Tx，能够生产具有高纤溶活性和显著抗氧化功能的发酵鹰嘴豆。结果表明，本发明菌株生产的发酵鹰嘴豆，其纤溶活性可达30(X)FU/g，?0H清除率可达88.5%,Fe3+还原能力是鲜鹰嘴豆的3.33倍。同时本发明的方法具有操作简单，成本低，周期短，来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，易于实现等优点。
【专利说明】一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆 菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌，同时还 涉及该枯草芽孢杆菌的应用，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于饮食不平衡、环境恶化、遗传特质等原因，血管栓塞类疾病大幅增加， 严重威胁着人类的健康与生命安全，每年死于脑梗塞、心肌梗死的病人多达几百万，居各种 疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法，因此，具有高纤溶活性溶栓药物的研发日 益受到人们的关注，有着广阔的发展前景。目前溶栓药物研究的焦点之一，是通过细菌发酵 生产口服有效的溶栓功能性食品和保健食品--纳豆激酶，但该方法所得的纳豆激酶纤溶 活性多不尽如人意。
[0003] 另一方面，活性氧和自由基是人体新陈代谢过程的次生代谢产物，正常情况下总 是处于不断产生和消除的动态平衡中，但如果其含量过高，动态平衡被破坏，就会引起氧化 应激反应，从而引发癌症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、神经系统失灵、免疫力降低、关节 炎等100多种常见疾病。其中动脉粥样硬化又可引起心脑血管疾病，产生血栓，因此，活性 氧和自由基也是心脑血管疾病的病因之一。目前有研究表明，通过食用抗氧化性功能食品 补充抗氧化物质，是预防包括心脑血管疾病在内的多种疾病的有效措施之一。
[0004] 综上所述，活性氧和自由基可引起包括心脑血管疾病在内的多种疾病，而具有抗 氧化功能的食品和保健食品可以清除活性氧和自由基，因此也具有预防心脑血管疾病的作 用；而高纤溶活性的保健食品可溶解已经形成的血栓，从而治疗心脑血管疾病，如能研发一 种具有纤溶活性和抗氧化功能的食品，则既具有预防心血管疾病发生的功能，又能在血栓 产生后具有治疗效果，从而达到预防和治疗相结合的目的，但目前还没有相关研究的报道。
[0005] 鹰嘴豆（chickpea)学名Cicer arietinum L.，富含人类所需的多种糖类、植物蛋 白和氨基酸、纤维素、维生素及无机盐，具有预防高血压及动脉硬化、降低胆固醇和血脂血 糖，利尿、治疗失眠等作用。有研究表明，鹰嘴豆蛋白的酶解产物（鹰嘴豆短肽），具有显著 的抗氧化功能，也有报道指出，用纳豆芽孢杆菌发酵鹰嘴豆，可以得到高纤溶活性的纳豆激 酶，但目前还未见具有纤溶活性和抗氧化功能的发酵鹰嘴豆的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆 菌及其应用，采用本发明的枯草芽孢杆菌生产发酵鹰嘴豆，可以得到具有高纤溶活性和显 著抗氧化作用的鹰嘴豆发酵产物，且该方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优 点，为纳豆激酶的产业化提供了技术支持，并为其作为功能性食品和保健食品的开发应用 研究提供了新的思路。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种生产具有纤溶和抗 氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis)DC-Tx，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO. 9462,保藏日期：2014年7月15日。
[0008] 本发明从豆豉中筛选出高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌DC-Tx，采用本发明的菌株， 能够生产具有高纤溶活性和显著抗氧化功能的发酵鹰嘴豆。实验结果表明，本发明菌株生 产的发酵鹰嘴豆，其纤溶活性可达3000FU/g，羟基自由基（· 0H)清除率可达88. 5%，Fe3+ 还原能力是鲜鹰嘴豆的3. 33倍。
[0009] 本发明所采用的技术方案还在于提供一种枯草芽孢杆菌在生产具有纤溶和抗氧 化功能发酵鹰嘴豆方面的应用。
[0010] 本发明枯草芽孢杆菌生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的方法，包括以下步 骤：
[0011] (1)挑取枯草芽孢杆菌接种于LB液体种子培养基，在28-40°C条件下，120-180rpm 摇床恒温培养12-18h，得到枯草芽孢杆菌种子液；
[0012] (2)将鹰嘴豆浸泡过夜，浙干水分，高压灭菌，冷却至室温后，按照1-8%的接种量 接种枯草芽孢杆菌种子液，在28-40°C条件下发酵培养36-72h ;
[0013] (3)将步骤（2)的鹰嘴豆发酵培养产物低温真空冷冻干燥，粉碎，过80-120目筛即 得。
[0014] 所述LB液体种子培养基包括以下质量分数的原料：蛋白胨1%，酵母粉0.5%， NaCl l%;pH6.8，121°C 高压灭菌 20min。
[0015] 所述低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度20-100Pa，冻干温度 45°C，冻干时间24-48h。本发明中冷冻干燥选择低温真空冷冻干燥，而不采用喷雾干 燥，目的是为了更好地保持所得发酵产物的纤溶和抗氧化功能。
[0016] 本发明利用枯草芽孢杆菌DC-Tx发酵生产具有高纤溶活性和显著抗氧化功能的 发酵鹰嘴豆，该方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本发明采用鹰 嘴豆为原料，来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生 产。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0018] 图1为本发明发酵鹰嘴豆纤溶活性测定结果；
[0019] 图2为本发明发酵鹰嘴豆· OH清除率测定结果；其中，
[0020] a为GSH，b为发酵36h鹰嘴豆，c为发酵48h鹰嘴豆，d为发酵72h鹰嘴豆，e为鲜 鹰嘴豆；
[0021] 图3为本发明发酵鹰嘴豆Fe3+还原能力测定结果；其中，
[0022] a为GSH，b为发酵36h鹰嘴豆，c为发酵48h鹰嘴豆，d为发酵72h鹰嘴豆，e为鲜 鹰嘴豆。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0024] 实施例I
[0025] I、纳豆激酶高产菌株的筛选
[0026] I. 1纳豆激酶高产菌株的初筛取市售豆豉，分离样品10g，加入IOOmL无菌水中， 充分振荡，KKTC沸水煮沸5min，静置片刻，取上层混浊液，梯度稀释后，分别取100 μ L不同 稀释度的溶液，均匀涂布于LB平板上，37°C过夜培养，挑单菌落进行划线培养，连续两次。 挑取LB分离平板上的单菌落点种到纤维蛋白平板上，37°C培养18h，测量溶解圈直径，溶解 圈较大的菌株液体发酵进行复筛。
[0027] 1. 2纳豆激酶高产菌株的复筛将初筛透明圈直径较大的菌株，用LB种子培养基 活化（37°C、150r/min、过夜），按照5%的接种量分别接入液体发酵培养基（以质量分数计： 6 %大豆粉，2 %葡萄糖，0· 06 % CaCl2，0· 07 % MgSO4, ρΗ6· 5)中，37°C发酵72h，其发酵产物用 PH7. 4的磷酸缓冲液稀释，取稀释液10 μ L，加样于纤维蛋白平板上37°C恒温培养18h，测定 透明圈直径，选取溶解圈最大的菌株，命名为DC-Tx。
[0028] 菌株DC-Tx的特征如下：
[0029] 形态特征：
[0030] LB平板上37°C培养24h，菌株DC-Tx菌落呈圆形，边缘微有叶状齿，白色不透明； 菌体形态呈小短杆状，长3. 0-4. 0 μ m，宽0· 8-1. 0 μ m，革兰氏阳性，芽孢中生，椭圆形。
[0031] 生理生化特征见表1。
[0032] 表1菌株DC-Tx的生理生化特征
[0033]
【权利要求】
1. 一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯 草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)DC-Tx，保藏单位：中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO. 9462,保藏日期：2014年7月15日。
2. -种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆 方面的应用。
3. -种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的 方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 挑取枯草芽孢杆菌接种于LB液体种子培养基，在28-40°C条件下，120-180rpm摇床 恒温培养12-18h，得到枯草芽孢杆菌种子液； (2) 将鹰嘴豆浸泡过夜，浙干水分，高压灭菌，冷却至室温后，按照1-8%的接种量接种 枯草芽孢杆菌种子液，在28-40°C条件下发酵培养36-72h ; (3) 将步骤（2)的鹰嘴豆发酵培养产物低温真空冷冻干燥，粉碎，过80-120目筛即得。
4. 根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的方 法，其特征在于，所述LB液体种子培养基包括以下质量分数的原料：蛋白胨1%，酵母粉 0· 5%，NaCl 1% ;ρΗ6· 8,121°C高压灭菌 20min。
5. 根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的方 法，其特征在于，所述低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度-50°C，真空度20-100Pa，冻 干温度彡-45°C，冻干时间24-48h。
【文档编号】A23L1/29GK104212741SQ201410401745
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】周伏忠, 陈晓飞, 冯菲, 胡宜亮, 陈国参, 孙玉飞, 王雪研 申请人:河南省科学院生物研究所有限责任公司