烟草热休克蛋白基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。本发明利用烟草各个发育时期的44个组织样品，通过实时荧光定量PCR实验比较HSC70-1基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。可见，将HSC70-1基因应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够提高相对定量结果的准确性，为烟草实时荧光定量PCR实验提供了一个新的工具。
【专利说明】烟草热休克蛋白基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及烟草实时荧光定量PCR实验中内参基因的选择，特别是涉及烟草热休 克蛋白基因 HSC70-1作为新的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用。
【背景技术】
[0002] 实时荧光定量PCR是基因表达研究的一种重要研究手段，具有定量准确、灵敏度 高、重复性好等特点。为了消除模板质量/数量、PCR反应效率、实验材料差异等因素对定 量结果的影响，实时荧光定量PCR通常使用内参基因进行校正和标准化，其结果的准确性 很大程度上取决于内参基因的选择。
[0003] 烟草实时荧光定量PCR研究中通常使用持家基因作为内参基因，因为持家基因参 与植物的基本生化代谢过程，是植物维持生命活动所必需的，其在所有的细胞和生理状态 下都较稳定地表达。但已有研究结果表明，持家基因在不同组织器官和发育时期样品中的 稳定性不同，其表达并不是恒定不变的。因此持家基因作为内参基因存在缺陷，需要寻找新 的内参基因。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于寻找表达稳定性显著优于传统内参基因的基因，进而为烟草实 时荧光定量PCR实验提供新的内参基因。
[0005] 本发明的技术方案是：一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQ ID N0 :1所 /_J、1 〇
[0006] -种烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0007] 烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用。
[0008] 所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，所 述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4。
[0009] 本发明中烟草热休克蛋白基因是一个新发现的烟草实时荧光定量PCR内参基因， 通过与烟草中常用的8个内参基因的表达稳定性比较，烟草热休克蛋白基因表达稳定性优 于所有8个常用内参基因。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过 专利加以保护。
[0010] 本发明提供的烟草新内参基因编码烟草热休克蛋白，来源于烟草（Nicotiana tabacum)，命名 HSC70-1。
[0011] 本发明的烟草热休克蛋白基因 HSC70-1可以是cDNA序列，也可以是基因组DNA序 列，或者是与这些序列具有90 %以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。
[0012] 本发明的有益效果是：利用烟草各个发育时期的44个组织样品（每个样品3个重 复），通过实时荧光定量PCR实验比较HSC70-1基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定 性，发现其表达稳定性优于所有8个常用内参基因。可见，将HSC70-1基因应用于烟草实时 荧光定量PCR实验中，能够提高相对定量结果的准确性，为烟草实时荧光定量PCR实验提供 了一个新的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为烟草热休克蛋白基因的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0014] 图2为常用内参基因 Actin的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0015] 图3为常用内参基因 PP2A的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0016] 图4为常用内参基因 L25的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0017] 图5为常用内参基因 Ntubc2的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0018] 图6为常用内参基因 EF-la的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0019] 图7为常用内参基因 a-Tubulin的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0020] 图8为常用内参基因 β-Tubulin的实时荧光定量PCR溶解曲线；
[0021] 图9为常用内参基因18S rRNA的实时荧光定量PCR溶解曲线。
【具体实施方式】
[0022] 一种烟早热休克蛋白基因，其喊基序列如SEQ ID NO : 1所不。
[0023] 所述的烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0024] 烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，针对所述 烟草热休克蛋白基因设计PCR引物，在烟草中开展基于实时荧光定量PCR实验的定量表达 分析。。
[0025] 所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用，所 述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4。
[0026] 烟草中常用的内参基因为8个持家基因，包括Actin、PP2A、L25、Ntubc2、EF_l a、 a-Tubulin、β-Tubulin和18S rRNA。基于芯片数据和实时荧光定量PCR实验，比较所述 烟草热休克蛋白基因与烟草常用的8个内参基因的表达稳定性，发现其表达稳定性优于所 有8个常用内参基因。将烟草热休克蛋白基因应用于烟草实时荧光定量PCR实验中，能够 提高定量结果的准确性。
[0027] 1、基于芯片数据的表达稳定性分析
[0028] 使用EBI ArrayExpress数据库中的100张 Affymetrix芯片数据（数据编号： E-MTAB-176)，比较烟草热休克蛋白基因（HSC70-1)与8个常用烟草内参基因的表达稳定 性，结果见表1，其中变异系数越小表明该基因表达稳定性越高。表1结果表明，烟草热休克 蛋白基因表达稳定性优于所有8个常用烟草内参基因。
[0029] 表1烟草热休克蛋白基因和常用内参基因芯片数据分析结果
[0030]
【权利要求】
1. 一种烟草热休克蛋白基因，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 如权利要求1所述的烟草热休克蛋白基因，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 /_J、1 ο
3. 烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分析的应用。
4. 如权利要求3所述的烟草热休克蛋白基因在烟草实时荧光定量PCR中定量表达分 析的应用，其特征在于：所述烟草实时荧光定量PCR的特异性引物对为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。
【文档编号】C12N15/29GK104193811SQ201410405712
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】曹培健, 王燃, 许亚龙, 李泽锋, 卢鹏, 杨军, 李锋, 魏春阳, 罗朝鹏, 金立锋, 林福呈 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院