细胞或组织的培养装置和培养方法

细胞或组织的培养装置和培养方法
【专利摘要】本发明涉及细胞或组织等培养物的培养装置和培养方法，该培养装置具备：收纳培养物的培养器部(4)，和贯穿于培养器部的内外、可以以设定于上述培养器部的壁部或其附近的支点为中心进行圆弧运动的控制杆(70)，操作控制杆，对培养物施加位移。可以使弯曲力作用于细胞或组织等的培养物(细胞构成体6)，无需增减培养器部内的培养液(48)，即，无需增减对培养液的压力，即可以对培养器部内的培养物施加培养所必需的位移。通过弯曲，可以从其凹陷部分至突起部分的厚度方向产生连续的压缩和伸长。
【专利说明】细胞或组织的培养装置和培养方法
[0001]本申请属分案申请，其母案的申请号为200780026057.7。该母案的申请日为2007
年6月20日。

【技术领域】
[0002]本发明涉及在再生医疗领域、组织工程领域中的细胞或组织的培养，还涉及用于三维组织或器官再生的三维组织培养方法，具体来说，涉及含有细胞、细胞载体(scaffold)、细胞产生的胞外基质的任意种类作为细胞构成体(Cell construct),根据情况添加培养液或其它添加物、或生长因子或药品等进行的培养中所使用的培养装置和培养方法。
[0003]简而言之，本发明的培养装置和培养方法与以往的静置培养不同，是涉及物理作用并用的三维培养的培养装置，该培养装置是:对细胞构成体的细胞施加主动刺激，同时使细胞构成体位移，促进增殖、细胞移动、物质移动，通过促进或停止分化来实现目标再生组织。

【背景技术】
[0004]细胞或组织的培养中，对于对要培养的细胞或组织施加压力或张力等物理刺激的方法进行了研究，提出了各种生物反应器等。二元培养(平面培养)是使用平底培养基材的培养方法，通常是在培养箱内静置培养。悬浮培养是使非贴壁细胞悬浮培养的方法，也是在培养箱内静置培养。三维培养的常规方法是将接种了细胞的细胞载体在培养箱内静置，进行培养。三维培养(使用生物反应器)通常是使细胞粘附或包含在细胞载体上，进行培养液的搅拌等处理，但是细胞载体的三维培养中也有对细胞施加加压、压缩、张力、剪切等物理作用的培养方法。
[0005]施加物理性作用的培养装置被称为“生物反应器”、“组织工程处理器”等，作为用于组织工程的培养实验或再生医疗的体外细胞、组织的培养装置，有望得到实际应用。
[0006]关于上述细胞或组织的培养、该培养中所使用的具有施加物理性位移或应力、刺激的功能的生物反应器，采用压力、振动(超声波)的例子有专利文献I中公开的细胞或组织的培养方法及其装置；采用压力的例子有专利文献2中公开的生物体内、生物体外和试管内的软骨和胶原的修复和再生以及骨再形成的方法；采用剪切力的例子有专利文献3中公开的细胞、组织培养装置；采用拉伸力的例子有专利文献4中公开的细胞、组织培养装置；采用压缩力的例子有专利文献5中公开的细胞、组织培养装置；采用剪切力的例子有专利文献6中公开的细胞培养装置；采用拉伸力的例子有专利文献7中公开的使用硅胶带的培养细胞用伸缩刺激负荷装置；并用拉伸力和剪切力的例子有专利文献8中公开的对组织、合成或天然血管移植片进行灭菌、接种、培养、保存、运输以及检查的装置和方法。专利文献9中公开了通过膜体使保持膜体状的细胞产生变形的培养方法等。专利文献10和专利文献11中公开:培养中利用半透膜。人们对于各种物理性作用和刺激的施加或利用半透膜的细胞等的培养进行了尝试。
[0007]专利文献1:日本特开2001-238663号公报(摘要等)
[0008]专利文献2:日本特表2004-512031号公报(摘要等)
[0009]专利文献3:日本特开2002-315566号公报(摘要等)
[0010]专利文献4:日本特开2003-061642号公报(摘要等)
[0011]专利文献5:日本特开2003-180331号公报(摘要等)
[0012]专利文献6:日本特开平09-313166号公报(摘要等)
[0013]专利文献7:日本特开平10-155475号公报(摘要等)
[0014]专利文献8:日本特表平11-504216号公报(摘要等)
[0015]专利文献9:日本特开2005-143343号公报(摘要等)
[0016]专利文献10:W0 2006_015304A2(摘要等)
[0017]专利文献11:日本特表2000-513214号公报(摘要等)


【发明内容】

[0018]发明所要解决的课题
[0019]但是，人体存在承受各种应力的部位，这些部位的修复中所使用的组织根据其部位不同而不同。例如，在椎间板、半月板、骨骼、纤维软骨、心脏瓣膜处，在体内承受弯曲力。该弯曲力与单纯的压力、压缩、拉伸、剪切等不同。对于所述承受弯曲力的部位，采用通过单纯的压力、压缩、拉伸、剪切等刺激因素培养的组织并不足够。
[0020]因此，本发明人等认识到，作为施加给要培养的细胞或组织的刺激或负荷，弯曲对于细胞或组织的增殖等极为有利。上述课题在专利文献I?11中没有公开，也没有任何启
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[0021]因此，本发明的目的在于涉及含有细胞和/或组织的培养物的培养装置和培养方法，提供适合人等身体部位的细胞和/或组织的培养装置和培养方法。
[0022]本发明的另一目的在于涉及适合人等身体部位的细胞和/或组织的培养装置，通过使培养物弯曲或伸缩，有助于适当的细胞和/或组织的培养。
[0023]解决课题的方法
[0024]为实现上述目的，本发明的培养装置可以使弯曲力作用于含有细胞和/或组织的培养物，无需伴随培养器部内的培养液的增减、即，无需使培养液的压力增减，就可以对培养器部内的培养物施加培养所必须的位移。具体来说，通过弯曲，在从其凹陷部分至凸起部分的厚度方向上产生连续的压缩和伸长，对培养物施加以往的加压、剪切、拉伸中无法得到的物理性刺激或负荷，由此可以获得适合于伴有弯曲的部位的组织修复的培养物。本发明并不限于上述弯曲，无需伴有培养器部内的培养液的增减、即，无需使培养液的压力增减，就可以对培养物施加培养所必须的运动或刺激等。
[0025]因此，为实现上述目的，本发明的第一方面是含有细胞和/或组织的培养物的培养装置，该培养装置具备收纳上述培养物的培养器部、贯穿于上述培养器部内外的控制杆(lever)，操作上述控制杆，对上述培养物施加位移。通过所述构成可实现上述目的。
[0026]为实现上述目的，本发明的第二方面是含有细胞和/或组织的培养物的培养装置，该培养装置具备载放上述培养物的培养床；与该培养床一起收纳上述培养物的培养器部；贯穿于上述培养器部内外的控制杆；操作上述杆、把持上述培养床、通过上述培养床的弯曲变形对上述培养物施加位移的驱动装置。通过所述构成可实现上述目的。
[0027]为实现上述目的，上述培养装置中可以优选上述控制杆是以设定在上述培养器部的壁部或其附近的支点为中心进行圆弧运动的构成，通过所述构成可实现上述目的。
[0028]为实现上述目的，本发明的第三方面是含有细胞和/或组织的培养物的培养装置，该培养装置具备载放上述培养物的培养床；与该培养床一起收纳上述培养物的培养器部；贯穿于上述培养器部的内外、可以以设定在上述培养器部的壁部或其附近的支点为中心进行圆弧运动的控制杆；操作上述控制杆，对上述培养床施加伸缩力，通过上述培养床的伸缩变形来使上述培养物伸缩的驱动工具。通过所述构成可实现上述目的。
[0029]为实现上述目的，本发明的第四方面是含有细胞和/或组织的培养物的培养方法，该方法的构成是:将上述培养物收纳于培养器部中，以设定在上述培养器部的壁部或其附近的支点为中心，对贯穿于上述培养器部内外的控制杆施加圆弧运动，通过该圆弧运动对上述培养物施加弯曲位移。通过所述构成可实现上述目的。
[0030]发明效果
[0031 ] 根据本发明，可以得到以下效果。
[0032](I)对正在培养的培养物施加弯曲等位移(应力)，可以产生纯粹的弯曲动作。
[0033](2)可用于椎间板等体内承受弯曲力的组织的再生。
[0034](3)有望防止干细胞分化、组织细胞去分化，组织结构等具有方向性时，可以使其排列方向一致，可获得与体内组织同等的培养物。
[0035](4)排除压力等其它物理作用或使其最小化，通过弯曲作用可以培养所需的组织。
[0036](5)有望使细胞移动变得容易。
[0037](6)可使营养物、氧渗透至三维细胞构成体的内部，有望排出代谢废物。
[0038]本发明的其它目的、特征和优点可通过参照所附附图和各实施方式进一步明确。
[0039]附图简述
[0040]图1是表示实施方式I的培养装置的培养单元的纵截面图。
[0041]图2是表示培养器部的分解斜视图。
[0042]图3是表示含有控制杆部的培养器本体部的分解斜视图。
[0043]图4是表示控制杆部下面一侧的斜视图。
[0044]图5是表示驱动部的分解斜视图。
[0045]图6是表示从培养器部拆下控制杆部后所见的培养单元的平面图。
[0046]图7是将培养床放大表不的斜视图。
[0047]图8是表不调节器的图。
[0048]图9是表不调节器的平面图。
[0049]图10是表示调节器中的运动转换部的一个例子的图。
[0050]图11是表示运动转换部的动作的一个例子的图。
[0051]图12是表示培养装置的控制系统的一个例子的框图。
[0052]图13是表示培养的处理顺序的流程图。
[0053]图14A是表示设置有细胞构成体的培养床的图。
[0054]图14B是表示设置有细胞构成体的培养床的图。
[0055]图15A是表示对细胞构成体的弯曲动作的图。
[0056]图15B是表示对细胞构成体的弯曲动作的图。
[0057]图16是表示调节器的动作顺序的流程图。
[0058]图17是表示实施方式2的细胞构成体的构成例的图。
[0059]图18是表示细胞构成体的其它构成例的图。
[0060]图19是表示细胞构成体的其它构成例的图。
[0061]图20是表不实施方式3的培养系统的图。
[0062]图21是表不培养系统的控制系统的框图。
[0063]图22是表示培养系统的处理顺序的流程图。
[0064]图23是表示实施方式4的培养装置的培养单元的图。
[0065]图24是表示图23的XXIV-XXIV线截面图。
[0066]图25是表示实验例的图。
[0067]图26是表示实验例的图。
[0068]图27是表示实验例的图。
[0069]图28是表示实验例的图。
[0070]图29是表示实验例的图。
[0071]符号说明
[0072]2培养单元
[0073]4培养器部
[0074]6、600细胞构成体
[0075]8驱动部
[0076]16培养空间部
[0077]48培养液
[0078]70控制杆
[0079]72 支点
[0080]实施发明的最佳方式
[0081]实施方式I
[0082]参照图1?图12对本发明的实施方式I进行说明。图1是表示培养装置的实施方式I的培养单元的纵截面图，图2是表示培养器部的分解斜视图，图3是表示含有控制杆部的培养器本体部的分解斜视图，图4是表示控制杆部下面一侧的斜视图，图5是表示驱动部的分解斜视图，图6是表示从培养器部拆下控制杆部后所见的培养单元的平面图，图7是将培养床放大表示的斜视图，图8是表示调节器的图，图9是表示调节器的平面图，图10和图11是表示调节器中的运动转换部的具体例子的图，图12是表示培养装置的控制系统的一个例子的图。图10和图11中，对于与图8和图9的调节器的共通部分采用相同符号。
[0083]该实施方式I表不对于作为培养物的细胞构成体施加弯曲位移的培养单兀。该培养单元2如图1所示，具备作为培养室的培养器部4、和对培养器部4内的培养物例如细胞构成体6施加所需运动的驱动部8。以下详述各功能部的构成和功能，并述及培养方法。
[0084]A)培养器部(培养室)4
[0085]培养器部4构成细胞构成体6的培养空间，是对细胞构成体6给予培养液48 (图6)或施加培养所必需的位移或刺激的功能部。该培养器部4如图2所示，具备培养器本体部10、培养器底部12、和控制杆部14。培养器本体部10例如为扁平状的圆筒体，形成筒状的培养空间部16。
[0086]培养器底部12具备遮挡培养空间部16的隔膜部20，经由密封装置、例如O形圈22，由多个固定螺丝23安装在培养器本体部10的下面一侧。隔膜部20是为了由外部对培养空间部16施加压力而设置，在培养器底部12、在与培养空间部16对应的位置形成筒状的竖直壁部24，形成被该竖直壁部24包围的窗口部26，同时设置加压装置27和压力传感器29。加压装置27是以水等流体为介质，经由隔膜部20向培养空间部16施加其压力P。该压力P通过压力传感器29检测。
[0087]培养器本体部10的上部如图3所示，由圆筒状的竖直壁部28形成窗口部30，在竖直壁部28的内侧和外侧，经由O形圈32、34可拆卸地安装外罩部14。
[0088]另外，培养器本体部10的培养空间部16中，在其内壁面形成搁架部38、40，这些搁架部38、40上横跨两者之间载放有培养床36。培养器本体部10中，形成培养床36的定位凸起部42 (图6)、44，培养床36的边缘部与一个定位凸起部42接触、另一定位凸起部44与培养床36的咬合凹陷部46咬合，由此，培养床36在培养空间部16中定位，并可拆卸。即，培养床36的高度位置由搁架部38、40确定，水平方向的位置和角度通过定位凸起部42与培养床36的位置、定位凸起部44与咬合凹陷部46的位置关系以及咬合来确定。
[0089]培养床36可放置在培养空间部16的上下方向。如图4所示，在外罩部14的下面一侧形成向培养床36 —侧突起的多个支撑突起部47，该支撑突起部47与培养床36的边缘部接触，支撑培养床36，阻止培养床36上下方向的自由移动。
[0090]如图6所示，培养器本体部10上形成将培养液48流入培养空间部16的入口侧接口部50、由培养空间16排出培养液48的出口侧接口部52。入口侧接口部50的通孔54在载放培养床36的搁架部38的下侧开口，与在定位突起部42上开口的透孔部56连通。出口侧接口部52的贯通孔58在载放培养床36的搁架部40的下侧开口，与在搁架部40开口的透孔部60连通。因此，由入口侧接口部50供给的培养液48流入搁架部38的下侧，由定位突起部42的透孔部56到达培养床36的上侧，经由培养空间部16内到达贯通孔58，但其一部分由培养床36的上部经由搁架部40的透孔部60到达出口侧接口部52。入口侧接口部50与循环管路51、出口侧接口部52与循环管53连接，所述循环管路51、53构成培养液48的循环路径。
[0091]如图1、图2、图3和图6所示，培养器本体部10中，连接部62通过安装螺丝65固定，在培养空间部16和驱动部8之间，横跨培养器本体部10的壁部设置控制杆70。该控制杆70可以以设定在培养器本体部10的壁部的支点72 (图1)为中心进行圆弧运动，通过由驱动部8施加的驱动力，其先端部上下移动，其先端部与培养床36接触，可以使培养床36弯曲，可以对在培养床36上保有的细胞构成体6施加位移动作。
[0092]如图3所示，控制杆70由培养空间部16 —侧看，依次具备作用部74、小直径部76、大直径部(密封部)78、法兰部80、圆柱部82、先端部为最尖锐的圆锥部84。法兰部80由作用部74 —侧观察，是前面一侧为平面，后面一侧具备由球面形成的滑动面86。
[0093]培养器本体部10上形成使控制杆70贯穿的贯通孔88，贯通孔88为了允许培养空间部16 —侧的控制杆70的转动，朝向培养空间部16 —侧形成大直径，为了保持控制杆70与培养器本体部10的壁部的气密性，设置O形圈90。该O形圈90的中心是控制杆70的转动中心，构成上述支点72。在该O形圈90和控制杆70的法兰部80之间，设置环状的杠杆引导92，控制杆70是以O形圈90的中心为旋转中心转动的构成。
[0094]连接部62是用于将驱动部8的框架64和培养器本体部10结合的部件，如图6所示，由安装螺丝66、68固定，将该连接部62的突起部96(图3)与贯通孔88所对应的凹陷部98 (图1)咬合，同时在该凸起部96上形成与控制杆70的法兰部80的滑动面86相接触的由球面形成的滑动面100。另外，连接部62中形成用于允许控制杆70转动的、使开口端一侧为大直径的透孔部102。
[0095]该培养器部4中，隔膜部20例如由像硅橡胶等没有成分溶出等的安全性高的柔软材料形成。隔膜部20形成较薄，其周围形成O形圈部22。隔膜部20为薄膜状，该构成是为了将外侧的压力P传递至培养空间部16内，为了间隔隔膜部20，使培养器部4的压力与相反一侧压力大致相同压力。另外，控制杆70用O形圈90密封，可保持培养器本体部10的气密性和水密性。
[0096]B)驱动部8
[0097]驱动部8是接受来自外部的驱动力、驱动对细胞构成体6提供位移动作的控制杆70的功能部。如图1和图5所示，驱动部8的框架64中，外罩部104由多个螺丝106固定。外罩部104经由线杆(wire) 110接受驱动力。外罩部104上可滑动的安装上下移动的第一滑块112，该滑块112的先端部与控制杆70接触。框架64上设置有与滑块112配置在同一直线上的第二滑块114，该滑块114与框架64之间设置有为了使滑块114向上移动时使复原力作用在滑块114上的弹簧116。弹簧116构成将滑块112返回至移动前的位置的复位弹黃。
[0098]线杆110的先端部安装在滑块112上，线杆110的外面部具备外筒部118，线杆110与外筒部118独立可滑动。由线杆110和外筒部118构成电缆119。外筒部118贯穿固定螺母120，通过固定螺母120固定在外罩部104上。固定螺母120和外罩部104之间设置有滑套122。线杆110的端部安装有调节器124，作为使滑块112上下移动的驱动源(图8、图9)。此时，滑块112下降，则滑块114与控制杆70 —起被压下，如果解除其驱动力，则滑块112、114通过弹簧116的复原力而回归至原来位置。
[0099]框架64上形成用于插入控制杆70的开口部126，同时，引导控制杆70插入的引导板128、130由开口部126插入到滑块112、114之间。如果在该引导板128、130之间插入控制杆70的圆锥部84，则可以将控制杆70容易地插入到滑块112、114之间规定位置。
[0100]C)培养床 36
[0101 ] 培养床36是保有细胞构成体6、同时向细胞构成体6传递位移动作的装置，利用培养床36所具有的弹性，可以将细胞构成体6恢复至位移动作之前的状态。例如细胞构成体6载放于培养床36上，装载于培养空间部16中。
[0102]如图7所不，培养床36具备平行载放两个细胞构成体6的载放部136,该载放部136构成接受来自外部的作用而变形的受力部，具有将两个细胞构成体6平行载放的面积和形状，对各细胞构成体6施加弯曲运动，因此由弹性材料形成为板状。弹性材料例如可使用弹簧用不锈钢钢板或其它弹性高的材料。此时，可以用弹性材料形成培养床36全体，也可以用弹性材料形成可弯曲运动的载放部136或其一部分。载放部136并不限定于平板状，也可以是网状。为了防止弹簧材料成分的溶出，可以施以稳定的涂层。
[0103]该载放部136为长方形状，在其长度方向的端部形成长方形状的竖直壁部138、140。各竖直壁部138、140与载放部136成直角，同时形成插入各细胞构成体6的椭圆形的透孔部142。该透孔部142具有固定细胞构成体6的两端的作用。另外，各竖直壁部138、140可以根据各细胞构成体6的尺寸设定为规定高度h。
[0104]在各竖直壁部138、140的顶部与载放部136平行地形成具有一定宽度的支撑面部144、146，各支撑面部144、146上，将一部分弯折，与各竖直壁部138、140平行地形成弯折部148，各弯折部148可以使各支撑面部144、146和各竖直壁部138、140得到补强，同时可固定细胞构成体6。即，即使用与含有薄板状部的载放部136相同的板材形成各支撑面部144、146和各竖直壁部138、140，也可得到足够的强度，采用该实施方式时，只沿长度方向弯曲。为了固定支撑面部144 一侧，培养床36上形成与图6所示定位突起部44对应的U字形的咬合凹陷部46。
[0105]载放部136的中间边缘部形成支撑所载放的细胞构成体6的侧面部的支撑壁部152、154，各支撑壁部152、154的顶部形成覆盖细胞构成体6的上面部的把持部156、158。各支撑壁部152、154是与载放部136垂直相交的壁部，其高度与上述竖直壁部138、140同样。另外，各把持部156、158与载放部136构成平行面。细胞构成体6配置在载放部136和各把持部156、158的间隔内。各把持部156、158的终端部构成曲面部，两者之间设定用于拆卸细胞构成体6的间隔160。
[0106]这里,关于培养器部4,其构成材料可根据对培养物或培养液的稳定性、经济性、耐灭菌性、加工性、耐磨损性、应用性等方面考虑来选择。与培养液48接触的部件例如培养器本体部10、外罩部14、O形圈32、34、90、培养床36、控制杆70应当使用构成材料中没有物质溶出的稳定性高的材料，例如可使用不锈钢钢材、塑料等。不锈钢钢材稳定性、耐灭菌性优异，塑料加工性优异，重量轻或一次性使用方面等应用性优异。
[0107]使用塑料时，必须防止杂菌的污染或他人细胞或基因的污染，因此可以采用一次性，与不锈钢钢材比较成本较低。培养器部4必须在组装好的状态下进行灭菌，不锈钢钢材和塑料均可以耐受灭菌处理。例如在以121°C、2个大气压的条件下进行灭菌处理的高压釜中需求足够的耐热性，该处理下适合采用PTFE、ETFE、PFA等氟树脂或聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯、玻璃强化PET和聚醚砜等。通过Y射线或电子射线进行的灭菌处理中，适合采用ETFE、或聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯、PET、聚乙烯、聚丙烯等。
[0108]培养器部4中，在连接部62、杠杆引导92等中，控制杆70与法兰部80的滑动反复进行，因此要求耐磨损性。因此适合采用聚缩醛或聚乙烯、聚丙烯、PTFE、ETFE、PFA等氟树脂。
[0109]为了无需拆卸外罩部14即可观察其内部，适合采用透明材料。外罩部14适合采用聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯、PET等透明材料。
[0110]为防止培养物的污染，灭菌处理是不可缺少的，因此从灭菌耐性材料中选择是很重要的。所选材料不仅可用高压釜进行灭菌处理而且还可用Y射线或电子射线进行灭菌处理，并且如果考虑各部件所必需的功能性等，最佳材料如下。
[0111]培养器本体部10和培养器底部12和外罩部14适合采用聚砜、聚醚砜或聚碳酸酯，O形圈32、34、90适合采用氟橡胶、硅橡胶，隔膜部20或O形圈22适合采用氟橡胶、硅橡胶或ETFEE薄膜，连接部62或杠杆引导92适合采用ETFE，控制杆70适合采用不锈钢(SUS316、SUS304)，培养床36适合采用弹簧用不锈钢(SUS304CSP系列)。
[0112]弹簧用不锈钢与SUS316系列相比耐腐蚀性稍差，因此为了弥补该缺点，可以实施例如类金刚石涂层(DLC)等的涂层。
[0113]如果以彻底清洗、重复使用为前提，则可以使用不锈钢SUS316、SUS304代替塑料。对于培养床36的构成材料，通过加压产生必要的位移运动、并恢复至位移前的状态的功能是不可缺少的，因此。例如可以使用弹簧用不锈钢钢板等强韧的弹性材料。
[0114]D)调节器 124
[0115]调节器124构成由外部对驱动部8施加控制杆70的驱动力的驱动源。如图8和图9所示，调节器124是将马达旋转变换为线杆110的进退移动，将该移动施加到驱动部8的滑块112上。因此，驱动部8的线杆110与外筒部118 —起被导入调节器124，其端部用线杆固定螺丝164固定在曲杆162上。覆盖线杆110的外筒部118固定在调节器124的框架部166中作为连接部件而设置的补强板168的固定部170上。
[0116]曲杆162经由轴承172固定在曲柄轴174上。固定有曲柄轴174的曲柄176上安装有马达178。马达178例如由DC马达构成。该马达178中设置有检测旋转的编码器180。
[0117]调节器124的框架部166中设置旋转调节器182、电源开关183、旋转开关184、旋转调节标度盘186，除此之外还设置显示转数等的显示装置188。
[0118]将该调节器124的曲柄结构放大的例子如图10所示，在马达178的旋转轴190上安装表示曲柄176的曲柄臂192，在该曲柄臂192上，通过曲柄轴174可转动地安装曲杆162,线杆110的端部通过线杆固定螺丝164固定在曲杆162上。
[0119]根据上述构成，通过马达178的旋转，曲柄臂192以旋转轴190为中心旋转，通过曲柄轴174安装在其先端部的曲杆162沿图11的点横虚线X所示的轨迹运动。固定在其先端部的线杆110根据曲柄臂192的长度S，以行程2S前后移动，该位移运动经由线杆110时施加给驱动部8。该位移运动传递至控制杆70，使控制杆70形成圆弧运动。
[0120]无需使曲柄臂192连续旋转，只通过步进马达或伺服马达使必要的角度位移，也可以同样地获得控制杆70的位移运动。
[0121]如图12所示，该调节器124具备控制马达178的控制装置200，该控制装置200与加压装置27、压力传感器29、马达178、编码器180、旋转调节器182、电源开关183、运转开关184、显示装置188等连接。控制装置200通过旋转调节标度盘186在旋转调节器182上设定转数，马达178按照设定的转数旋转，该旋转力变换为线杆110的进退运动，施加给驱动部8。马达178的旋转由编码器180检测，可以计算出与所设定的转数的变化，控制为规定的转数。该实施方式中，通过采用控制装置200，根据压力传感器29的检测压力，可以控制加压装置27的输出压P，也可以通过其它控制装置控制加压装置27或获取压力传感器29的检测压力。
[0122]E)培养方法
[0123]接着，参照图13?图16，对使用培养单元2的细胞或组织的培养方法进行说明。图13是表不培养的处理顺序的流程图，图14A和图14B是表不细胞构成体的设置的图，图15A和图15B是表示对细胞构成体的弯曲运动的施加及其解除的图，图16是表示调节器的动作顺序的流程图。
[0124]如图13所示，细胞构成体6的培养处理包含前处理(步骤SI)、培养处理(步骤S2)和后处理(步骤S3)。前处理中包含细胞构成体6的形成、半透膜的包埋处理等。培养处理包含弯曲运动处理，反复进行弯曲处理(步骤S21)、弯曲解除(步骤S22)、弯曲处理
(步骤S23).......弯曲解除(步骤S2N)。后处理包含将结束培养的细胞构成体6从培养床36中取出等。
[0125]I前处理(步骤SI)
[0126]如图14A和图14B所示，形成作为培养物的细胞构成体6。该细胞构成体6例如用半透膜覆盖。
[0127]细胞构成体6含有细胞、细胞载体、上述细胞生产的胞外基质、培养液48的任意几种，也可以含有添加物作为其它要素。
[0128]细胞构成体6可以是接种了细胞的三维载体和凝胶状物质，也可以是将接种了细胞的三维载体用半透膜密封所得，还可以是将接种了细胞的三维载体和凝胶状物质用半透膜密封所得。三维载体和凝胶状物质由生物体吸收性材料构成。
[0129]细胞构成体6可以是将细胞接种于三维载体上所得，或者是其它载体与上述构成体复合所得，或者将它们装入半透膜制的袋或管中所得，或者是在半透膜制的袋或管中密封悬浮有细胞的培养液所得，或者是将细胞和凝胶状的载体密封到半透膜制的袋或管中所得。
[0130]半透膜可以从透过分子量为100[kDa]?1000[kDa]的半透膜中选择使用。将半透膜用于培养的研究在 PCT/US2005/027220 (Amorphous cell delivery vehicle treatedwith physical/physicochemical stimuli)等中有阐述。该半透膜根据可透过的分子的大小不同而可提供多种，因此可以使用它们。即，选择可透过培养液中的营养成分、必需的氧等气体或细胞产生的代谢废物等低分子物质等、而细胞或大分子的胞外基质无法透过的半透膜，只要可以锁住细胞，则可以防止细胞或胞外基质流失，同时可以使营养成分或氧的供给成为可能，可实现高效率培养。此时，作为半透膜妨碍营养物质通过时的解决对策，本发明中是施加弯曲动作，因此，弯曲部的位移主动提高，还产生压力差，因此可以促进营养成分的移动。没有血管阶段的细胞构成体6 (在没有血管的组织中)的弯曲动作可以代替血管或心脏的功能，同时也形成对细胞的物理性刺激。
[0131]如图14A和图14B所示，由半透膜覆盖的细胞构成体6设置于培养床36的载放部136上。细胞构成体6被培养床36支撑、载放。
[0132]II培养处理(步骤S2)
[0133]如图1和图15A所示，细胞构成体6与培养床36—起转移到作为培养空间的培养器部4。
[0134]向培养器部4内加入培养液48,安装外罩部14。安装了外罩部14,贝U设在外罩部14上的四处支撑突起部47轻轻地压住并支撑培养床36的边缘部。
[0135]通过控制杆70，由培养床36的背面一侧施加力F，则如图15B所示，培养床36的载放部136由于力F而向上方弯曲，该弯曲导致载放部136上的细胞构成体6也弯曲。SP，细胞构成体6产生弯曲。
[0136]由该弯曲状态解除力F，则培养床36的载放部136由于弹性而恢复成原形状，变得平坦，因此，如图15A所示，载放部136上的细胞构成体6也转移成平坦状态。这种情况下，细胞构成体6的上面部存在培养床36的把持部156、158，向上方突起变形的细胞构成体6与载放部136的复原一起被把持部156、158把持，复原成载放部136的原状，变得平坦。
[0137]上述弯曲运动反复进行(步骤S21?步骤S2N)，经过必需的培养时间，形成组织。如果使用图1所示的培养单元2，通过向培养器底部12的隔膜部20施加压力P，由此经由培养液48，可以使与弯曲有别的所需压力P作用于细胞构成体6。
[0138]该培养中，培养液48是由入口侧接口部50向培养空间部16供给，由出口侧接口部52排出，由此可以向培养空间部16供给新鲜的培养液48。培养液48是将氧等气体或养分等供给细胞构成体6的供给介质，同时也是由细胞构成体6排出的代谢废物等的传送介质。
[0139]III后处理(步骤S3)
[0140]结束培养的细胞构成体6与培养床36 —起从培养器部4(图1等)中取出。细胞构成体6适用于人体的修复部位。
[0141]上述培养的处理顺序中，对于控制装置200的控制动作参照图16所示流程图进行说明。
[0142]启动运转开关184，则显示装置188亮灯(步骤Sll)。在该状态下设定转数(步骤S12)。由此开始旋转，由调节器124经由线杆110对驱动部8的滑块112施加位移(步骤S13)。通过线杆110的进退使控制杆70来回转动，所述的运动施加到细胞构成体6上。
[0143]发生旋转和位移，则显示装置188显示其设定转数和实际转数(步骤S14)，控制装置200监视实际转数与设定转数的转数差(步骤S15)，转数差或旋转偏差达到规定值以上时判定为异常。发生异常时，显示装置188显示警告(步骤S16)。
[0144]实施方式2
[0145]本发明的实施方式2中，参照图17?图19进行说明。图17?图19表示细胞构成体的构成例。
[0146]使用该细胞构成体的细胞和/或组织的培养方法的步骤如下。
[0147]a从体内取出组织或细胞。
[0148]b用酶等分解取出的组织，分离细胞，筛选所需细胞。作为培养对象的细胞任何种类均可。
[0149]c筛选的细胞数不足时或需要增加时，可先通过单层培养等增加细胞数。
[0150]d制备细胞构成体。
[0151]i为不定形构成体时(以下任何情况均可根据需要添加生长因子、药剂等)
[0152]?使细胞悬浮在培养液中。
[0153].使细胞悬浮在水凝胶中。
[0154].使细胞混入凝胶状载体中。
[0155]?为定形构成体时(以下任何情况均可根据需要添加生长因子、药剂等)
[0156].使细胞悬浮在培养液中，将其加入到胶原海绵、壳聚糖海绵等细胞载体中，使细胞附着于载体。
[0157].以溶胶的状态使细胞混入载体中，将其加入到胶原海绵、壳聚糖海绵等细胞载体中，使细胞附着于载体，同时形成凝胶。
[0158]e细胞构成体6是将细胞等装入到半透膜制的管或袋中，然后将该管或袋密封而构成。半透膜是不透过细胞或分子量大的物质，而透过培养液中成分的营养成分、药剂、氧等气体等分子量小的物质。
[0159]f细胞构成体6安装于培养床36上。
[0160]g使培养液循环时，准备培养液的循环回路。循环回路中设置气体交换部，可以使培养装置内的气体与培养回路的培养液中的气体进行气体交换。
[0161]h将细胞构成体6与培养床36 —起加入到培养器部4中，充满培养液48。
[0162]i在培养器部4上安装外罩部14，使培养器部4 (和培养回路)密封。
[0163]以上，在清洁室或净化台等清净环境中进行。以后，由于回路密封，因此即使在上述以外的场所也不会有杂菌的污染。
[0164]j将驱动部8安装在培养器部4上。
[0165]k将温度、气体浓度保持最佳状态。
[0166]I反复对细胞构成体施加弯曲动作。弯曲动作的周期、大小、动作程序等预先设定并运转。
[0167]m根据需要进行培养液的循环、加压。加压可以从一定、断续、周期性反复等加压模式中选择最佳模式。
[0168]η经过规定时间后由培养器部4拆卸下驱动部8。
[0169]在上述培养方法中，细胞构成体6如图17所示，是通过半透膜加入到管202中，这种情形下，是由培养液48和在凝胶中混合了细胞的混合物204构成。管202是将两端的开口用密封栓206密封。
[0170]该细胞构成体6例如是两根为一组，安装在培养床36上，反复施加上述弯曲位移动作。由此，在细胞增殖的同时还产生胞外基质，生成不定形的新生组织。
[0171]观察该生成过程可知，培养前，为细胞、培养液、水凝胶或凝胶状载体的全部或它们的部分组合的细胞构成体6在培养后变换为细胞、培养液、水凝胶、凝胶状载体、胞外基质或其它细胞生产物的全部或它们的部分组合。
[0172]由细胞构成体6提取的培养物注入到体内的损伤或缺损部位，则在该注入部位可以再生原有的组织，注入的培养物与周围组织融合成为一体。
[0173]细胞构成体6如图18所示，是通过半透膜加入到管202中，这种情况下，细胞构成体6也是由培养液48和在凝胶中混合有细胞的混合物204构成。将管202的各开口端一侧弯折，用夹子208夹住密封。这种情况下，管202中有富余空间，向填充了培养液48和混合物的管202中加入培养液48和混合物204使管的截面成为椭圆程度。将这些细胞构成体6安装于上述培养床36上并反复弯曲。
[0174]使用上述细胞构成体6也可得到细胞的增殖，通过胞外基质等的产生，生成不定形的新生组织。即，培养前含有细胞、培养液、水凝胶和凝胶状载体的全部或它们的部分组合的细胞构成体6在培养后变换为细胞、培养液、水凝胶和凝胶状载体与胞外基质及其它细胞生产物的全部或它们的部分组合。
[0175]将上述培养物注入人体的损伤或缺损部位，则体内注入的部位再生原有的组织，并且可以与周围组织融合。
[0176]细胞构成体6如图19所示，是加入到半透膜的管202中。这种情况下，细胞构成体6是将细胞接种在定形的细胞载体205上而构成。管202的各开口端用密封栓206密封。
[0177]该细胞构成体6以单体或多个排列安装在培养床36上，并进行反复弯曲，由此，在细胞增殖的同时产生胞外基质等，生成不定形的新生组织。即，培养前的含有细胞、胶原海绵等细胞载体和凝胶状载体的细胞构成体6在培养后生成为含有细胞、细胞载体和胞外基质及其它细胞生产物的新生组织。
[0178]除去半透膜，取出其中的新生组织，通过缝合或粘合等将其移植到人体的损伤或缺损部位，则在移植部位再生原有的组织，并且可以与周围的组织融合。
[0179]实施方式3
[0180]参照图20?图22，对本发明的实施方式3进行说明。图20是表示实施方式3的培养系统的图，图21是表示控制部的构成例的图，图22是表示培养动作的处理顺序流程图。
[0181]该培养系统240中，由于进行培养液48的循环或随时供给新鲜的培养液48，因此在培养室242内设置包含培养单元2的培养器部4的培养回路244。培养回路244是通过循环管246将培养液槽248、气体交换部250、泵252、逆止阀254、培养器部4、压力调节阀256连接，构成循环路径。该培养回路244中，可以任意进行培养液48的循环，但作为对该循环进行控制的一个方式，例如停止或禁止培养液48的循环时，可以堵塞培养回路244。上述泵252可以由活塞式泵、汽缸式泵、蠕动泵等构成。循环管246中可设置例如通过计数培养液48的滴加数等方法检测培养液48的流动的流量传感器268。
[0182]培养室242中设置有温度调节器258、气体浓度调节器260和控制装置262。培养室242内通过温度调节器258设定为培养所必需的温度，通过气体浓度调节器260保持一定的气体浓度，通过控制装置262可以控制培养液48的循环和培养器部4内的压力。
[0183]由调节器124经由电缆119对培养器部4施加弯曲应力。此时，调节器124设置于培养室242内，也可以设置于培养室242的外部。
[0184]调节器124的动作可以与培养液48的加压循环一并控制，但也可以分别独立控制。此时，培养液48的加压和调节器124的弯曲应力被施加到细胞构成体6上。
[0185]对于细胞构成体6,为了一并控制其弯曲位移、培养液48的循环和培养器部4内的压力，如图21所示，可以构成控制系统。控制装置262中，由输入装置264设定马达178的转数、培养液48的循环量，来驱动马达178和泵252。控制装置262由具备CPU (中央处理器)、R0M(只读存储器)和RAM(随机存储器)的计算机构成。
[0186]通过马达178、编码器180和控制装置262实行位移施加控制，马达178的转数通过编码器180检测，其检测信息输入至控制装置262。
[0187]通过压力调节阀256、泵252、流量传感器268和控制装置262实行培养液送液控制。该培养液送液控制中，如果使泵252的转数升高，则培养液48的流量增加，但是该送液的压力可通过压力调节阀256调节。培养液48的流动可通过例如计数培养液48的滴加数等的方法，由流量传感器268检测，该检测信息可用于泵控制等控制信息。
[0188]通过加压装置27、压力传感器29和控制装置262实行加压控制，通过压力传感器29检测压力，由该检测信息实行加压控制。
[0189]通过构成温度调节器258的温度传感器280、加热器282和控制装置262实行温度调节控制，根据温度传感器280的检测信息可以控制加热器282的发热温度通过构成气体浓度调节器260的CO2浓度传感器284、CO2电磁阀286、O2浓度传感器288、N2电磁阀290和控制装置262实行气体浓度控制。根据CO2浓度传感器284的检测信息可以控制CO2电磁阀286的开合度，根据O2浓度传感器288的检测信息可以控制N2电磁阀290的开合度。通过这些温度调节和气体浓度的控制，可以实行培养室242内的环境控制。即，根据培养室242内的气体浓度气氛，可以在气体交换部250中，在培养液48和培养室242内之间进行气体交换。
[0190]如图22所示，上述培养系统240中，启动电源开关292 (步骤S51)，则显示装置266亮灯(步骤S52)。在输入环境控制值(步骤S53)、输入控制动作值(步骤S54)后，设定值显示在显示装置266上(步骤S55)。从而，启动运转开关294 (步骤S56)。
[0191]如果培养系统240进入动作状态，则实行温度调节(步骤S57)、气体浓度调节(步骤S58)、加压控制(步骤S59)、培养液送液运转(步骤S60)、施加位移的运转(步骤S61)，运转状态显示在显示装置266上(步骤S62)。
[0192]监控施加位移所需的运转状态(步骤S63)，如果有异常，则在警告显示后停止运转(步骤S64)，使培养系统240重置(步骤S65)，消除异常原因(步骤S66)，再次使步骤S51?S63动作，直至培养结束(步骤S67)。培养结束后切断运转开关294 (步骤S68)，结束培养处理(步骤S69)。
[0193]实施方式4
[0194]参照图23和图24对本发明的实施方式4加以说明。图23是表示实施方式4的培养单元的图，图24是表示图23的XXIV-XXIV线截面图。图23和图24中，与图1?图8相同部分采用相同符号。
[0195]在实施方式I?3中，关于对细胞构成体6施加弯曲位移的处理进行了说明，本发明也可适用于细胞构成体600的伸缩处理，通过控制杆70的运动，无需使培养器部4的培养空间部16中的内部压力发生变化，即可以对细胞构成体600施加所需的位移。
[0196]该实施方式的培养器部4形成为长方形状的培养空间部16。将细胞构成体600的一端安装在该培养空间部16的自搁架部295上突出的突起296上，且将控制杆70的先端部可旋转动地固定在安装于细胞构成体600的另一端侧的保持框298上。该实施方式中，在保持框298上突出设置定位销300，因此可以使在控制杆70的先端部形成的咬合环302可动性地与该定位销300咬合。
[0197]采取上述构成，如果通过由调节器124(图8、图9)经由线杆110施加于驱动部8上的应力而使控制杆70圆弧转动，则根据该圆弧转动，使细胞构成体6沿箭头m、η方向伸缩，可以反复进行施加以及解除培养所必需的刺激、张力。
[0198]此时，由入口侧接口部50向培养空间部16内流入培养液48，由出口侧接口部52流出，可以向细胞构成体600供给新鲜的培养液48。
_9] 由实施方式中提取的特征事项
[0200]接着，关于由以上所述各实施方式中提取的特征事项，例举了在权利要求范围以外的特征事项。本发明并不限定于所例举的特征事项。
[0201](I)上述培养装置，其特征在于:上述培养床和上述控制杆平行或成直角配置。
[0202](2)上述培养装置，其特征在于:上述培养器部是密闭结构。
[0203](3)上述培养装置，其特征在于:在上述控制杆的端部具备作用部。
[0204](4)上述培养装置，其特征在于:上述培养床支撑上述培养物，承受来自上述控制杆的加压并弯曲，通过解除上述加压恢复至加压前的状态。
[0205](5)上述培养装置，其特征在于:上述培养床具备在端部的支撑上述培养器部的支撑部、在中间部的承受来自上述控制杆的作用的受力部。
[0206](6)上述培养装置，其特征在于:上述控制杆具备在上述支点附近具有圆弧状面的法兰部，与该法兰部对应，在上述培养器部具备具有圆弧状面的连接部，上述法兰部的上述圆弧状面和上述连接部的圆弧状面可滑动性地接触。
[0207](7)上述培养装置，其特征在于:上述连接部在使上述控制杆旋转时，其旋转中心与上述控制杆的密封部中央一致。
[0208](8)上述培养装置，其特征在于:在上述培养器部的一侧设置驱动部，其中，该驱动部对由上述培养器部引出的上述控制杆的后端部施加驱动力。
[0209](9)上述培养装置，其特征在于:上述驱动部可拆卸地设置在上述培养器部上。
[0210](10)上述培养装置，其特征在于:具备可周期性、连续地控制由上述驱动部施加给上述控制杆的上述加压、和/或控制加压速度的控制部。
[0211](11)上述培养装置，其特征在于:由供给口向上述培养器部供给培养液，由排出口排出。
[0212](12)培养装置，其特征在于:培养器部具备隔膜部，经由该隔膜部，可对上述培养器部内施加压力。
[0213](13)上述培养装置，其特征在于:上述驱动部具备:
[0214]设置于上述培养器部一侧部的框体部；
[0215]可滑动地支撑上述框体部、通过由外部施加的驱动力滑动、使上述控制杆产生圆弧运动的第一滑块；和
[0216]可滑动地支撑上述框体部，使复原力与上述滑块相反方向地作用于上述控制杆的第二滑块。
[0217](14)上述培养装置，其特征在于:上述筐体具备:
[0218]插入上述控制杆的插入口 ；和
[0219]将由上述插入口插入的上述控制杆的端部引导至上述第一滑块和上述第二滑块之间的引导部。
[0220]实骀结果
[0221]接着，参照图25?图29，对使用上述培养装置和培养系统的实验结果进行说明。
[0222]图25表示细胞构成体,该细胞构成体是将在培养液中悬浮的细胞加入到半透膜的管中而构成。如图26所示，细胞构成体固定在培养床上，收纳于培养器部(室)。此时，使驱动部与培养器部分离。
[0223]来自调节器的加压作用于培养单元，对细胞构成体施加弯曲动作。调节器设置在培养室外，电缆贯穿培养室的门，与驱动部连接。调节器的动作状态可通过显示装置确认。
[0224]调节器可以通过曲柄将马达的旋转运动变换为直线运动，通过选择曲柄臂的长度，可以调节线杆的进退幅度，由此可以调节对细胞构成体施加的弯曲的大小。
[0225]该实验中，加压动作是保持大气压、只限定于弯曲动作，进行培养液循环。压力和调节器产生的弯曲动作可以分别无关系地单独施加。该实验中，例如可以施加0.5[MPa]以上的加压。
[0226]图27?图29表示脊椎器官的培养实验(出生2天的小鼠的脊椎器官培养(Vertebrae organ culture of 2 days old mouse))。实验是将从出生后两天的小鼠中取出的脊椎设置在培养床上(图27)，以0.1 [Hz]的频率施加弯曲动作，实施10天的培养。该实验中未进行加压。
[0227]比较例是进行静置培养。图28和图29表示10天的静置培养。10天后，将器官的截面用甲苯胺蓝染色，观测细胞的存活状况。图中，着色部分未能明确标识，但是亮度降低的部分(染色部分)表示存在存活的细胞。静置培养中，椎间板内部的细胞密度没有提高，可见基质的变性(图28a)。
[0228]与此相对，施加了弯曲动作、位移的脊椎中，可见椎间板内部细胞的增生以及新生基质的畜积(图29b)。
[0229]由该实验结果可知，施加弯曲动作的培养与静置培养比较，可见细胞的增生和新生基质的堆积，由此可以推断:该弯曲动作可以对细胞构成体产生刺激，同时促进物质移动。
[0230]如上所述，以最优选的实施方式的形式说明了本发明，但本发明并不限定于上述实施方式。
[0231]产业实用性
[0232]本发明涉及含有细胞和/或组织的培养物的培养装置，提供适合人等身体部位的细胞和/或组织的培养装置，通过对细胞构成体施加弯曲动作，可以高效地进行脊椎等的组织培养，因此本发明是有用的。
【权利要求】
1.一种含有细胞和/或组织的培养物的培养装置，其特征在于，该培养装置具备: 培养床:具有载放上述培养物的可变形的载放部； 培养器部:具有填充培养液并培养上述培养物的培养空间部，对设置在该培养空间部的上述培养床进行固定，可旋转动地设置使上述培养床的上述载放部变形的控制杆；驱动部:从上述培养器部的外部对上述控制杆施加或解除驱动力； 隔膜部:设置在上述培养器部，密封上述培养空间部；以及 加压部:从上述隔膜部进行对上述培养空间部的上述培养液的加压或其解除， 通过因对上述控制杆的上述驱动力的施加及其解除而在上述载放部发生的位移使上述培养物发生弯曲运动，通过来自上述加压部的加压或其解除经由上述培养空间部内的上述培养液进行对上述培养物的加压或其解除。
2.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于， 上述载放部具有弹性，通过对上述控制杆施加上述驱动力上述培养床的上述载放部弯曲，通过从该弯曲状态解除上述驱动力，因上述载放部的复原引起的位移使上述培养物发生弯曲运动。
3.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于， 上述驱动部与上述培养器部可拆卸地设置，上述控制杆与上述驱动部可拆卸。
4.如权利要求1所述的培养装置，其特征在于， 上述驱动部，具有: 框架部:被插入从上述培养器部突出的上述控制杆； 滑块:可滑动地安装在该框架部，被施加用于使上述控制杆旋转的驱动力或解除该驱动力； 弹簧:上述滑块被施加上述驱动力而成为压缩状态，通过上述驱动力的解除而对上述控制杆施加复原力。
5.一种培养物的培养方法，使用培养装置培养上述培养物，该培养装置含有用隔膜部对培养含有细胞和/或组织的培养物的培养空间部进行密封的培养器部和具有可变形的载放部的培养床，其特征在于，该培养方法具备如下步骤: 在上述培养床的上述载放部载放上述培养物； 在上述培养空间部中固定上述培养床，并且填充培养液； 对在上述培养器部可旋转动地设置的控制杆施加或解除驱动力； 从上述隔膜部对上述培养空间部的上述培养液加压或解除； 通过因对上述控制杆的上述驱动力的施加或其解除而在上述载放部发生的弯曲位移及其复原位移使上述培养物发生弯曲运动； 通过对上述隔膜部的加压或其解除经由上述培养空间部内的上述培养液进行对上述培养物的加压或其解除。
【文档编号】C12M3/00GK104293665SQ201410406026
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2007年6月20日 优先权日:2006年7月10日
【发明者】渡边节雄 申请人:目的株式会社