一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，以牛肝脏为原料通过超声提取及低温离心等工艺制备得到过氧化氢酶粗提液，采用超滤浓缩和凝胶层析技术进行过氧化氢酶的提取纯化，取代了利用大量有机溶剂或无机盐溶液等进行提取的复杂工艺，一方面使提取工艺更加简单易操作，酶活性及产率均得到大幅度提高，所得过氧化氢酶酶活达到10000U/mg以上，产率达到18％以上，且大大降低了生产成本；另一方面将超滤浓缩产生的透过液重复回收利用，避免了废水的排放，是一种环境友好型生产工艺。
【专利说明】一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法。
【背景技术】
[0002]过氧化氢酶(Catalase，CAT)，又称触酶，是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，是以过氧化氢为底物，通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气，其系统名称是H2O2:H202氧化还原酶，国际酶学委员会的编号为ECl.11.1.6。过氧化氢酶分子结构中含有铁卟啉环，I个分子酶蛋白中含有4个铁原子，其作用基团是血红素。过氧化氢酶主要由四种次单元组成，每一种单元含一种苏木精衍生物称为ProtohemelX。不管什么来源，它的分子量均是225。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢分解，防止脱脂过氧化。目前过氧化氢酶主要的应用领域包括:临床、医药及食品加工等领域。
[0003]酶的纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，酶产品还必须保持其生物活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的酶，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯酶的最好方法去纯化酶。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。
[0004]国内外目前生产过氧化氢酶的方法有三个:Novozymes A/S公司由变种黑曲霉在通风搅拌等条件下培养而得；而杰能科公司则由纤维蛋白小球菌经深层发酵提取精制而得。国内由江南大学的华兆哲、陈坚等研究用利用Bacillus subtilis WSHDZ.01胞肉过氧化氢酶的纯学提取在这个方面做仅做了尝试，CN103509766提供了另外一中编号为CGMCCN03449的一株Serratia marcesces SRBC08高产过氧化氢酶菌的菌株为菌种,经过种子培养和在产酶培养基中添加100-200毫克/升烟酸作为诱导剂，调控菌体的生产代谢，该方法通过种子培养、发酵产酶、过氧化氢酶的提取纯化等三个步骤得到产品，但亦未见工艺化大生产，目前发酵法虽然采用添加过活性氧、乙醇等诱导CAT表达的发酵策略，但是目前产量提高非常有限，导致生产成本高，不合适工业化生产。
[0005]国内外主要是从猪、牛等动物肝脏中提取纯化而得，如CN1436846提出了一种由动物肝脏中提取过氧化氢酶的方法，该方法经过将动物肝脏在酸性条件下粗提、高速离心、硫酸铵沉淀、热变性等四个步骤最后得到过氧化氢酶溶液，但是该方法中要用到大量的饱和度45%的硫酸铵，在生产中容易造成大量无机盐的污染，不是环境友好型生产工艺，而且该方法得到的酶的活性不是很高，并只得到酶溶液而不是干品；CN101445794提供了另外一种方法，该方法经过中空纤维滤膜两次渗透，得到过氧化氢酶产品，但是该方法中中空纤维滤膜目前的成本高，难得到在大工业化中经济实惠的产品，不具备在市场上有竞争能力；US2992167中提供了一个由利用化学溶剂中动物肝脏中提取过氧化氢酶的，但是该方法使用的化学试剂对环境的污染比较大，生产工艺复杂且对生产条件要求高，造成提取率低，而且容易对人体造成比较大的伤害，不符合目前国内外清洁环保的生产需求。
[0006]目前纺织印染企业生产用的过氧化氢酶产品几乎都依赖进口，市场为外商所垄断；食品行业用的过氧化氢酶则完全依靠进口且没有现货，因此国内过氧化氢酶制品的研制是市场的需要，也是企业降低成本的需要。在国内微生物发酵法制取过氧化氢酶仅处于实验室研究阶段，尚无工业化生产，而从动物原料中提取过氧化氢酶的研究也是在近几年才引起重视。哺乳动物组织中过氧化氢酶含量差异很大，肝和肾中含量最高，红细胞次之，结缔组织中含量最低。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有的过氧化氢酶提取工艺的不足，提供一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，本发明以牛肝脏为原料，顺次经过捣碎匀浆、超声处理和低温离心制备过氧化氢酶粗提液，将所得粗提液采用超滤浓缩和凝胶层析技术进行过氧化氢酶的提取及纯化，取代利用大量有机溶剂提取、大量无机盐沉淀等对环境污染的方法，且将超滤浓缩得到的大量透过液进行重复利用，具有节能减排、经济环保且酶活高的优点，适合工业化生产的要求。
[0008]本发明的技术方案为:
[0009]一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于，
[0010]以牛肝脏为原料提取获得过氧化氢酶粗提液，将所得过氧化氢酶粗提液采用孔径为0.004-0.006 μ m的中空纤维滤膜，以10_20L/h的流速进行超滤浓缩，收集超滤截留液得到含有高浓度过氧化氢酶的过氧化氢酶浓缩液；
[0011]此外，还包括以下步骤:
[0012]步骤一、纯化，将所得过氧化氢酶浓缩液采用Sephacryl S-200凝胶进行凝胶过滤层析，用PH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液进行洗脱，流速为1.0-2.0L/h，收集层析洗脱液得到纯化的过氧化氢酶母液；
[0013]步骤二、冷冻干燥，将所得过氧化氢酶母液经过冷冻干燥，既得所述过氧化氢酶。
[0014]优选的是，所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，所述过氧化氢酶粗提液的制备方法包括以下步骤:
[0015]步骤一、捣碎匀浆，将切碎的牛肝脏和pH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液按照体积比I: 6-10混合后，保持温度25-30°C进行捣碎20-30min，得到牛肝匀浆；
[0016]步骤二、超声提取，将所得牛肝匀浆进行超声振荡10_30min，超声波强度为30-80W，得到牛肝过氧化氢酶匀浆；
[0017]步骤三、离心分离，将所得牛肝过氧化氢酶匀浆在10-30°C下进行离心15_25min，取上层清液既得所述过氧化氢酶粗提液。
[0018]优选的是，所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，将所述超滤浓缩得到的透过液进行收集，并调节所得透过液的PH值为7.0-7.8后，可取代磷酸缓冲液与切碎的牛肝脏混合后进行捣碎。
[0019] 优选的是，所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，在进行凝胶过滤层析之前用PH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液对所述凝胶柱进行冲洗。
[0020]优选的是，所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，步骤二中冷冻干燥温度为-55—60°C。
[0021]优选的是，所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，离心分离的转速为大于或等于5000rpm。
[0022]优选的是，所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，所用磷酸缓冲液的浓度均为 0.09-0.llmol/L。
[0023]本发明具有以下有益效果:首先，本发明将经过捣碎匀浆后的牛肝脏进行超声处理，使过氧化氢酶快速高效释放，大大缩短过氧化氢酶的提取时间，并大幅度提高过氧化氢酶的产率。
[0024]其次，本发明将所得过氧化氢酶粗提液采用超滤浓缩和凝胶层析技术进行过氧化氢酶的提取及纯化，取代利用大量有机溶剂提取、大量无机盐沉淀等对环境污染的方法，且将超滤浓缩得到的大量透过液进行重复利用，具有节能减排、经济环保且酶活高的优点，是一种环境友好型生产工艺。本发明所述方法提取得到的过氧化氢酶酶活至少达到1000U/mg以上，产品回收率达到18%以上，均高于现有的从动物肝脏中提取过氧化氢酶的方法，适合工业化生产的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
[0027]如图1所示，一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其中，
[0028]以牛肝脏为原料提取获得过氧化氢酶粗提液，将所得过氧化氢酶粗提液采用0.004-0.006μπι的中空纤维滤膜，本发明所用滤膜为由北京海德能提供的型号为HU10-90，孔径为0.005μπι的中空纤维滤膜，并以10_20L/h的流速进行超滤浓缩，截留分子量10万以上的肽链，收集超滤截留液得到含有高浓度过氧化氢酶的过氧化氢酶浓缩液，而将超滤透过液回收到储蓄罐中，并利用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节透过液的pH值为7.0-7.8备用。另外，在进行超滤浓缩之前先用纯净水对超滤设备进行冲洗，将超滤设备的管道及容器冲洗干净后再加入所述过氧化氢酶粗提液进行超滤浓缩。
[0029]此外，还包括以下步骤:
[0030]步骤一、纯化，将所得过氧化氢酶浓缩液采用Sephacryl S-200凝胶进行凝胶过滤层析，在进行凝胶过滤层析之前用浓度为0.09-0.llmol/L, pH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液对所述凝胶柱进行冲洗，上样后用浓度为0.09-0.llmol/L, pH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液进行洗脱，流速为1.0-2.0L/h，收集层析洗脱液得到纯化的过氧化氢酶母液；
[0031]步骤二、冷冻干燥，将所得过氧化氢酶母液经过冷冻干燥，既得所述过氧化氢酶，冷冻干燥温度为-55-60°C，优选_55°C，所用冷冻干燥仪器为FD-18S型冷冻干燥机。
[0032]所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，所述过氧化氢酶粗提液的制备方法包括以下步骤:
[0033]步骤一、捣碎匀浆，将新鲜牛肝脏用水洗净后切碎，将切碎的牛肝脏和pH值为
7.0-7.8的磷酸缓冲液按照体积比1: 6-10混合后，保持温度25-30°C用组织捣碎匀浆机进行捣碎20-30min，匀浆机转速为2000-3000rpm，得到牛肝匀浆；
[0034]步骤二、超声提取，将所得牛肝匀浆进行超声振荡10_30min，超声波强度为30-80W,使细胞破碎，细胞内的过氧化氢酶快速溶出，得到牛肝过氧化氢酶匀浆；
[0035]步骤三、离心分离，将所得牛肝过氧化氢酶匀浆用低温离心机在10_30°C下进行离心15-25min，离心分离的转速大于或等于5000rpm，取上层清液既得所述过氧化氢酶粗提液。
[0036]所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法中，将所述超滤浓缩得到的透过液进行收集，并调节所得透过液的PH值为7.0-7.8后，可取代磷酸缓冲液与切碎的牛肝脏混合后进行捣碎，从而将超滤产生的大量透过液回收利用，实现提取工艺中的废水零排放。
[0037]实施例1
[0038]将新鲜牛肝20kg用自来水洗净，切碎，加入6倍体积的pH值为7.2的磷酸缓冲液，用组织捣碎匀浆机捣碎，然后超声波强度为20W提取20min，得到牛肝匀浆，取牛肝匀浆，然后用低温离心机在15°C下于6000rpm离心20分钟，上层清液为得到过氧化氢酶粗提液。先冲洗超滤设备，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，用北京海德能HU10-90，，以1L/h的流速进行超滤浓缩，得到过氧化氢酶浓缩液，而透过液回收到储罐中，然后调节PH值为7.2后替代进行捣碎时的磷酸缓冲液使用。将得到的过氧化氢酶浓缩液采用SephacrylS-200凝胶柱进行凝胶过滤层析，装柱后，用浓度为0.lmol/L，pH值为7.2的磷酸缓冲液冲洗后上样，用0.lmol/L，pH值为7.2的磷酸缓冲液进行洗脱，流速1.0L/h，收集酶液得到过氧化氢酶母液，纯化后的过氧化氢酶母液采用FD-18S型冷冻干燥机，_55°C冷冻干燥，得到过氧化氢酶产品，酶活达11000U/mg。
[0039]实施例2
[0040]将新鲜牛肝20kg用自来水洗净，切碎，加入6倍体积的pH值为7.4的磷酸缓冲液，用组织捣碎匀浆机捣碎，然后超声波强度为20W提取25min，得到牛肝匀浆，取牛肝匀浆，然后用低温离心机在15°C下于6000rpm离心20分钟，上层清液为得到过氧化氢酶粗提液。先冲洗超滤设备，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，用北京海德能HU10-90，以15L/h的流速进行超滤浓缩，得到过氧化氢酶浓缩液，而透过液回收到储罐中，然后调节PH值为7.4后替代进行捣碎时的磷酸缓冲液使用。将得到的过氧化氢酶浓缩液采用SephacrylS-200凝胶柱进行凝胶过滤层析，装柱后，用浓度为0.lmol/L，pH值为7.4的磷酸缓冲液冲洗后上样，用0.lmol/L，pH值为7.4的磷酸缓冲液进行洗脱，流速1.5L/h，收集酶液得到过氧化氢酶母液，纯化后的过氧化氢酶母液采用FD-18S型冷冻干燥机，_55°C冷冻干燥，得到过氧化氢酶产品，酶活达11000U/mg。
[0041]实施例3
[0042]将新鲜牛肝20kg用自来水洗净，切碎，加入6倍体积的pH值为7.6的磷酸缓冲液，用组织捣碎匀浆机捣碎，然后超声波强度为25W提取30min，得到牛肝匀浆，取牛肝匀浆，然后用低温离心机在10°C下于7000rpm离心20分钟，上层清液为得到过氧化氢酶粗提液。先冲洗超滤设备，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，用北京海德能HU10-90，以15L/h的流速进行超滤浓缩，得到过氧化氢酶浓缩液，而透过液回收到储罐中，然后调节PH值为7.6后替代进行捣碎时的磷酸缓冲液使用。将得到的过氧化氢酶浓缩液采用SephacrylS-200凝胶柱进行凝胶过滤层析，装柱后，用浓度为0.lmol/L，pH值为7.6的磷酸缓冲液冲洗后上样，用0.lmol/L，pH值为7.6的磷酸缓冲液进行洗脱，流速1.5L/h，收集酶液得到过氧化氢酶母液，纯化后的过氧化氢酶母液采用ro-18S型冷冻干燥机，-55°C冷冻干燥，得到过氧化氢酶产品，酶活达12000U/mg。
[0043]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【权利要求】
1.一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于， 以牛肝脏为原料提取获得过氧化氢酶粗提液，将所得过氧化氢酶粗提液采用孔径为0.004-0.006 μ m的中空纤维滤膜，以10_20L/h的流速进行超滤浓缩，收集超滤截留液得到含有高浓度过氧化氢酶的过氧化氢酶浓缩液； 此外，还包括以下步骤: 步骤一、纯化，将所得过氧化氢酶浓缩液采用Sephacryl S-200凝胶进行凝胶过滤层析，用PH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液进行洗脱，流速为1.0-2.0L/h，收集层析洗脱液得到纯化的过氧化氢酶母液； 步骤二、冷冻干燥，将所得过氧化氢酶母液经过冷冻干燥，既得所述过氧化氢酶。
2.如权利要求1所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述过氧化氢酶粗提液的制备方法包括以下步骤: 步骤一、捣碎匀浆，将切碎的牛肝脏和PH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液按照体积比I: 6-10混合后，保持温度25-30°C进行捣碎20-30min，得到牛肝匀浆； 步骤二、超声提取，将所得牛肝匀浆进行超声振荡10_30min，超声波强度为30-80W，得到牛肝过氧化氢酶匀浆； 步骤三、离心分离，将所得牛肝过氧化氢酶匀浆在10-30°C下进行离心15-25min，取上层清液既得所述过氧化氢酶粗提液。
3.如权利要求2所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于，将所述超滤浓缩得到的透过液进行收集，并调节所得透过液的PH值为7.0-7.8后，可取代磷酸缓冲液与切碎的牛肝脏混合后进行捣碎匀浆。
4.如权利要求1所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于，在进行凝胶过滤层析之前用PH值为7.0-7.8的磷酸缓冲液对所述凝胶柱进行冲洗。
5.如权利要求1所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于，步骤二中冷冻干燥温度为-55—60°C。
6.如权利要求2所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于，离心分离的转速为大于或等于5000rpm。
7.如权利要求2或4所述的从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，其特征在于，所用磷酸缓冲液的浓度均为0.09-0.llmol/L.
【文档编号】C12N9/08GK104178466SQ201410408847
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】张春颖, 杨旭锦 申请人:西藏天虹科技股份有限责任公司