小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α（RORα）腺相关病毒载体及其构建方法，属于疾病的基因治疗领域。本发明所提供的载体基因组小，含4.7～6kb之间的线状单链DNA基因组，本发明采用降低腺病毒污染的三质粒共转染法以及不会破会AAV的肝素琼脂糖纯化法和利用AmiconUtra-15高效的浓缩作用包装rAAV-RORα，且应用于转染肿瘤细胞。该载体可感染分裂期及静止期细胞，整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性且免疫原性弱，可用于体内试验以及体外实验，从而充分发挥AAV载体在基因治疗中的作用，以及RORα于多种重要生理过程的调节作用。
【专利说明】小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α (R0R α )腺相关病毒载体及其构建方法，属于疾病的基因治疗领域。
【背景技术】
[0002]维甲酸相关孤核受体ct (retinoid acid receptor related orphan receptor,ROR a, NRIFI)，属类固醇激素受体超家族成员的转录调控因子，可直接进入细胞核调节靶基因的转录，从而参与多种重要生理过程的调节，在形态发育、细胞增殖分化、机体稳态维持、生物代谢调控、高级神经功能控制以及免疫调节等方面发挥重要作用。研究发现，ROR a基因缺陷的模型小鼠，体内出现了广泛而严重的功能性障碍，尤其是容易发生自身免疫性疾病和过敏性疾病，或表现出明显的免疫功能异常，如T和B细胞功能缺陷、巨噬细胞释放致炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-a)等。RORa与免疫系统的密切关系还在多种动物模型的研究中得以证实，并被视为化学治疗的潜在靶点。
[0003]基因治疗的常用载体包括病毒载体和非病毒载体，非病毒载体转染效率低、体内表达不稳定，包括脂质体、多聚阳离子聚合物、纳米粒、胶束、细菌质粒等；病毒载体不仅有较高的基因转染效率，而且有实现外源基因稳定表达的优势，故是目前基因治疗中应用最广泛的载体类型。但因病毒载体有激活体内原癌基因的可能性而存在安全隐患。逆转录病毒做为载体用于治疗，也有引起死亡和诱发发白血病的报道，因此逐渐被淘汰。腺病毒载体表达外源基因时间短，免疫原性强，可引发机体产生强烈的炎症反应和免疫应答，不适于慢性免疫紊乱性疾病的治疗。
【发明内容】
[0004]针对上述问题，本发明提供一种二型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV2)载体，基因组小，含4.7飞kb之间的线状单链DNA基因组，可感染分裂期及静止期细胞，整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性且免疫原性弱，是目前较为理想的基因治疗载体。
[0005]本发明解决其上述问题所采用的技术方案如下:
1.小鼠维甲酸相关的孤核受体a (RORci )腺相关病毒载体的构建方法，按照以下步骤进行:
(I)克隆小鼠RORa基因(参考NCBI中提供的序列:ΝΜ_013646.2)，应用PCR技术于小鼠的脑组织扩增出RORa mRNA的⑶S区，共1572bp，于⑶S区的上下游分别引入EcorI和XbaI酶切位点，将琼脂糖凝胶电泳并胶回收后的RORa片段和PMD18T克隆载体(购自TARAKA)进行T-A克隆，转化大肠杆菌Stbl3 (购于上海迈其生物科技有限公司)并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行AMP抗性筛选，挑取阳性菌于液体培养菌增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体记为pMD18-T-R0R α克隆载体。
[0006](2)将pMD18-T_R0Ra以及PZAC2.1 (核心质粒)(盘尼西亚大学赠送，本实验室保存)进行EcorI和XbalI双酶切，再分别胶回收琼脂糖凝胶后的PZAC2.1的载体片段和RORa片段，在T4DNA连接酶的作用下连接过夜，同样转化stbl3并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行筛选，挑选阳性菌落，次日取菌液按照菌液与培养基比例为1:100接种于的肉汤增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体命名为PZAC2.1-RORa。
[0007]2.AAV2-R0RQ (小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒)的包装，按照以下步骤进行:
(1)首先制备各种质粒:pZAC2.1-RORa、pAd_detaF6 (辅助质粒)、p5E18 (包装质粒)(其中pAd-deltaF6和p5E18为盘尼西亚大学赠送，本实验室保存)；
(2)复苏并传代HEK293细胞(购自ATCC)，采用磷酸钙共沉淀的方法将pZAC2.1-R0R α、pAd_detaF6、p5E18 按一定比例(1:2:1)共转染 70%_80% 汇合度的 HEK293细胞。
[0008](3)过夜更换新鲜完全培养液，48-72小时收获细胞，其间于荧光显微镜下检测转染的效率以及产毒的效果；收获细胞，加DMEN重悬已含病毒的HEK293细胞，-80和_37°C反复冻融三次，加入40微升的Benzonase (250U/微升)，37°C 30min，去除非病毒核酸，以3000g常温离心，收集的上清即为病毒粗制液。
[0009](4)加入10%D0C (脱氧胆酸),37°C孵育20min,先后经过5 μ m和0.8 μ m的滤膜滤去细胞碎片，收集过滤液。
[0010]3.AAV2-R0R α的纯化方法，按照以下步骤进行:
(I)于用于纯化的分离柱内加入肝素琼脂糖，用PBS分2次进行平衡。而后加入步骤
(3)所得小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒的包装滤液，调整流速为I滴/秒，直至滤液全部虑过琼脂糖柱子，用洗脱液(0.1M NACL PBS)洗涤柱子，流速控制为I滴/秒，等洗脱液全部流过柱子，最后加入洗脱缓冲液(0.4Μ MACL PBS)，收集洗脱液，留作浓缩。
[0011](2)将离心过滤装置放入离心管中，以灭菌的PBS漂洗滤器。将步骤(I)收集的纯化后的洗脱液加入滤器，4°C、3000rpm离心5分钟，根据流率再离心五分钟，浓缩样本至lmL。加入PBS进行洗涤，离心混匀后收集于Eppendorf管中4°C保存。
[0012]4.AAV2-R0R α的滴度的测定，按照以下步骤进行:
在离心管中依次加入病毒液10微升，1XDNaseI缓冲液10微升，40U无PNA酶的DNase I 4微升，无核酸酶的纯Η2076微升，37°C孵育1，以去除未包装成病毒而转入细胞的质粒的干扰而后立即煮沸五分钟，使病毒衣壳裂解，立即冰浴备用。以纯化的重组质粒pZAC2.1-RORa为标准品DNA的模板，用纯的H2010倍连续稀释成101° -1O4水平，和rAAV2-R0R α (重组腺相关病毒载体)一起用荧光定量PCR检测病毒的滴度。
[0013]本发明的有益效果是:
(I)本发明载体高度稳定，易制备，可浓缩和纯化，无毒性，有利于基因高效转移和长期表达；本研究应用AAV2作为基因治疗载体，AAV2进入细胞的过程是由基础受体(硫酸肝素蛋白多糖受体)和辅助受体[包括I型成纤维细胞生长因子受体(FGFR-1)和整合素a νβ I整合素α 5β I]介导产生。AAV2载体对多种组织细胞(如表面具有硫酸肝素蛋白多糖受体的肌肉、视网膜、肝脏、神经元细胞等)具有较好的转导效率。
[0014](2) AAV不能独立复制，需在辅助病毒如腺病毒存在的条件下，才能在感染的宿主细胞中进行复制并合成蛋白，形成新的病毒颗粒。传统包装rAAV载体的方法为“双质粒共转染加辅助病毒(腺病毒)感染法”，即用重组质粒和辅助质粒共转染腺病毒感染的人胚肾293细胞。重组质粒含有目的基因和两端的ITR序列，辅助质粒含有AAV的r印和cap基因，这种方法易被腺病毒污染。本研究为“三质粒共转染法”，首先将小鼠RORa基因成功插入AAV2表达质粒pZac2.1，形成重组质粒Pzac2.1-RORa。其次是应用腺病毒的E1A、E1B、E4、EZA以及VARNA基因片段所构建的腺病毒辅助质粒协P_deltaF6，代替辅助病毒感染，与重组质粒Pzac2.1-T-bet和包装质粒p5E18 —起通过磷酸韩共沉淀法转染293细胞,从而生成含目的基因RORci片段的重组腺相关病毒rAAV2-R0Ra，这种方法既减少了腺病毒污染，又简化了 AAV2的包装步骤。
[0015](3)本发明在病毒载体纯化方法上，既往常用的氯化艳梯度密度离心法已被证明会破坏AAV2，由于硫酸乙酞肝素是AAV2的表面受体，因此，利用重力作用，通过肝素琼脂糖亲和层析法分离纯化AAV2成为新方法，且在本研究中得到了成功应用。纯化的rAAV2病毒需要浓缩，因为rAAV2的滴度是影响靶细胞转染效率的重要因素。Amicon Ultra-15离心过滤器为纯化的rAAV2-R0Ra病毒液提供了简单且快速的浓缩去盐方法，病毒回收率大于95%,浓缩能力达到100倍。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为RORa的PCR图，图中泳道I为Marker ;泳道2-3为为扩增出的RORa CDS
区片段。
[0017]图2为pMD18T_R0Ra酶切图，图中泳道I为Marker，泳道2，4，5为双酶切结果。 图3为PZAC2.1-RORa酶切图，图中泳道I为Marker，泳道2_4为双酶切结果。
[0018]图4为病毒包装过程中eGFP突光图。
[0019]图5为病毒感染小鼠Levis胃癌细胞图,左图为48h后的突光图,右图为3天后的荧光图。
【具体实施方式】
[0020]以下通过实施例对本发明进行具体描述或作进一步说明，其目的在于更好的理解本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。
[0021]实施例1:表达载体PZAC2.1-RORa的构建
1.小鼠RORa基因的克隆及与pMD-18T克隆载体的连接。
[0022](I)应用01igo6.0引物设计软件，根据NCBI中小鼠RORa的cDNA序列(ΝΜ_013646.2)，和所要连接的表达载体pZAC2.1的酶切位点，设计扩增RORα全长基因的引物如下:
Pl (上游引物):5’ -GAATTCACATGGAGTCAGCTCCGGCAG -3’，于其 5’ 端引入 EcoRI 酶切位点；
P2 (下游引物):5’ -TCTAGAGCGCGACATTTACCCATCGATT-3’，于其 5’ 端引入 XbaI 酶切位点。
[0023](2)应用RT-RCP (逆转录PCR)技术从小鼠的脑组织中扩增出小鼠RORa全长编码基因。
[0024](3 ) PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1，图中2和3为扩增出的ROR α⑶S区片段。切取含目的片段的凝胶，并采用promega公司的胶回收纯化试剂盒，回收并纯化PCR产物。
[0025](4)纯化的产物与TAKARA公司的T载体进行T-A克隆，16°C反应一小时，而后转化于本实验室保存的大肠杆菌Stbl3并涂布于含有100 μ g/mL的AMP的肉汤培养板进行筛选，37°C培养16h。
[0026](5)挑取一个单菌落，转到含100μ g/mL的AMP的6mL的肉汤培养基，37 °C(250rpm)培养12小时。
[0027](6)提取菌液质粒DNA，进行酶切鉴定，结果见图2，将鉴定正确的质粒DNA送至上海生工测序，测序正确，并命名为pMD-18T_R0Ra。
[0028]2.AAV2系统的表达载体PZAC2.1-RORa的构建
(I)将经过测序验证的pMD18T-R0Ra质粒与AAV2系统的表达质粒pZAC2.1 一同经过EcoRI/Xbal 双酶切，37°C，孵育 3h。
[0029](2)取50yL经过1%琼脂糖电泳，分别切取含目的片段以及pZAC2.1载体的凝胶，同样按照以上方式纯化目的片段和载体，应用T4DNA连接酶连接，16°C连接过夜。
[0030](3)连接的产物同样转化于本实验室保存的大肠杆菌Stbl3并涂布于含有100 μ g/mL的AMP的肉汤培养板进行筛选，37°C培养16h。
[0031](4)方法同前，液体增菌培养并提取质粒，酶切及测序鉴定，酶切结果见图3，将鉴定正确的质粒命名为PZAC2.1-RORa。
[0032]实施例2: rAAV2-R0R α的包装
(I)将本实验室保存的HEK293细胞冻存管，于37°C中转动至解冻，按照3x106接种入DMEM完全培养液的1cm培养皿20块，待其生长密度为70%_80%，包装前12h换新鲜培养液。
[0033](2)采用磷酸钙共沉淀的方法转染293细胞，包装病毒，其中，pZAC2.1-RORa和pAd-deltaF6、p5E18 3质粒按照12.5:25:12.5 ( μ g)的含量及比例转染每皿细胞，其中对照以带有EGFP荧光基团的PZAC2.1-EGFP ((盘尼西亚大学赠送，本实验室保存)代替PZAC2.1-RORa，同样的条件包装对照病毒。
[0034](3)配置转染混合物:
A 液:59mL 灭菌纯水,6.5 mL 2.5mol/L CaCL2, 1300 μ g pAd_deltaF6 质粒，650 μ gpZAC2.1-RORa 和 650 μ g p5E18 质粒。
[0035]B 液:2xHBS
将A液逐滴加入B液中，并迅速吹打，室温放置20-30min。
[0036](4)于每只培养皿加入2.5ML转染混合物，第二天更换新鲜DMEN完全培养液，第四天收获细胞。
[0037](5)收获的细胞置于_80°C和37°C反复冻融三次，加入40 μ L Benzonase (250U/μ L),混匀，37°C孵育30min,去除非病毒核酸,3000g常温1min离心,收集上清,此为病毒粗制液，即可用于体外实验。
[0038](6)加入10%的脱氧胆酸1.5mL，孵育，先后经过5 μ m和0.8 μ m的滤膜滤去细胞碎片,收集过滤液。
[0039]三质粒共转染的HEK293细胞包装rAAV2，病毒包装过程中eGFP荧光结果见图4。
[0040]实施例3:rAAV2_R0Ra的的纯化 (I)于用于纯化的分离柱内加入肝素琼脂糖4mL，用PBS分2次进行平衡。而后加入包装后的滤液，调整流速为I滴/秒，直至滤液全部虑过琼脂糖柱子。
[0041](2)用洗脱液(0.1M NACL PBS)洗涤柱子，流速控制为I滴/秒，等洗脱液全部流过柱子，最后加入洗脱缓冲液(0.4M MACL PBS),收集洗脱液，留作浓缩。
[0042](3)将Milipore Amicon Utra-15 10k离心过滤装置放入离心管中，以灭菌的PBS漂洗滤器。将收集的纯化后的洗脱液加入滤器，离心5分钟，根据流率在再离心五分钟，浓缩样本。加入PBS进行洗涤，按上诉步骤离心，混匀后收集于Eppendorf管中4°C保存。
[0043]实施例4:rAAV2_R0Ra的滴度的测定
(I)在Eppendorf管中依次加入病毒液10 μ L，10 X DNaseI缓冲液10 μ L，无RNA酶的DNase I 4 μ L，无核酸酶的纯水76 μ L，37°C孵育lh，以去除未包装成病毒而转入细胞的质粒的干扰。
[0044](2)立即煮沸五分钟，使病毒衣壳裂解，立即冰浴备用。
[0045]以纯化的重组质粒pZAC2.1-R0R α为标准品DNA的模板，用纯水10倍连续稀释成101° --1O4水平，和纯化前后的rAAV2-R0Ra —起用荧光定量PCR检测病毒的滴度，根据标准曲线求得其滴度。
[0046]实施例5:rAAV2-R0R α转染小鼠肺癌细胞系(购自ATCC)
(O应用转染的浓度应该为104_5 V.g/细胞，而我们的纯化前的rAAV2-R0Ra，滴度为19 V.g/mL,故于培养的小鼠肺癌细胞加入200 μ L的未纯化的rAAV2_R0R a，对照加入rAAV2-EGFP0
[0047](2)转染后48h看到荧光的表达，而第3天荧光较强，结果见图5。
[0048](3)收获转染了 rAAV2_R0Ra的细胞，提取RNA，RT-QPCR检测其ROR a mRNA的表达，含量明显高于对照，约10倍。
【权利要求】
1.一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体为pZAC2.1-ROR α，该载体含有小鼠基因ROR a mRNA的CDS区序列。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体基因组小，能感染分裂期及静止期细胞，整合到宿主细胞基因组的特定区域，无致病性且免疫原性弱。
3.一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，按照以下步骤进行: Cl)克隆小鼠RORa基因，应用PCR技术于小鼠的脑组织扩增出RORa mRNA的⑶S区，于CDS区的上下游分别引入EcorI和XbaI酶切位点，将琼脂糖凝胶电泳并胶回收后的RORa片段和PMD18T克隆载体进行T-A克隆，转化大肠杆菌Stbl3并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行AMP抗性筛选,挑取阳性菌于液体培养菌增菌培养,提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体记为pMD18-T_R0Ra克隆载体； (2)将pMD18-T-R0R α以及PZAC2.1核心质粒进行EcorI和XbalI双酶切，再分别胶回收琼脂糖凝胶后的PZAC2.1的载体片段和ROR α片段，在T4DNA连接酶的作用下连接过夜，同样转化stbl3并涂布于含有AMP的肉汤培养板进行筛选,挑选阳性菌落,次日取菌液按照菌液与培养基比例为1:100接种于的肉汤增菌培养，提取菌液中的质粒，PCR鉴定及测序正确后，该载体命名为PZAC2.1-RORa。
4.一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒的包装方法，其特征在于，采用三质粒磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞，其中所述的三质粒分别为pZAC2.1-RORa、pAd_detaF6、p5E18。
5.一种小鼠维甲酸相关的孤核受体α腺相关病毒的纯化方法，其特征在于，采用肝素琼脂糖亲和层析法分离纯化rAAV。
【文档编号】C12N15/66GK104232686SQ201410411105
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】吴玉敏, 许化溪, 苏兆亮, 王胜军, 应欣宇, 杨慧建, 别庆丽 申请人:江苏大学