一种枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种枯草芽孢杆菌Bacillus?subtilis?ZK1-18，保藏编号CGMCC?No.9402。本发明的枯草芽孢杆菌ZK1-18菌株源于土壤，该菌株生态安全，无腐蚀，对人畜动植物无害，该菌株是以有机磷源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变有机磷的性质，使有机磷的组分发生变化，起到解磷作用。本发明的菌株为后续研制具有降解土壤有机磷功效的生物有机肥提供高效、稳定的菌种及基础资料。
【专利说明】一种枯草芽孢杆菌
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种枯草芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002] 磷元素是植物生长的一种主要营养元素，在土壤中主要以难溶的矿物形态存在， 导致植物对土壤中的磷元素利用率很低，影响植物的生长。我国对解磷菌的研究起步于20 世纪50年代，解磷菌能将植物难以吸收利用的难溶性或不溶性磷转化为可利用的形态，提 高土壤中磷素的利用效率，减少化学肥料的施用，降低农业投入成本，因此对土壤环境进行 微生物修复，是提高作物产量，解决土壤速效磷缺乏的重要途径之一。然而，现在我国对解 磷菌的研究主要集中于溶解无机磷菌株的筛选，对于土壤难溶性有机磷解磷菌的研究却鲜 有报道。有机磷是土壤磷的重要组成部分，一般占土壤全磷的20%?50%。土壤的微生物 修复技术，近十几年来在国外得到了较大发展，但是土壤有机磷降解速度缓慢，致使治理过 程延续时间较长，一直是这项技术的一个突出难点，因此寻找高效有机磷降解菌，将土壤中 植物难以吸收利用的有机磷转化为可吸收利用的形态，是当前磷污染土壤微生物修复技术 的研究热点。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆 菌。该菌株源于土壤，生态安全，无腐蚀，对人畜动植物无害，该菌株是以有机磷源筛选出来 的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变有机磷的性质，使有机磷的组分发生变化，起到 解磷作用。该菌株为后续研制具有降解土壤有机磷功效的生物有机肥提供高效、稳定的菌 种及基础资料。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌，其特征在 于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis ZK1-18,保藏编号CGMCC No. 9402,保藏日为 2014年6月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0005] 1、该菌株具有如下的性质：
[0006] 形态特征：杆状，大小（0. 5?0. 8) μ mX (1. 8?2. 2) μ m，芽孢中生或近中生。菌 落圆形，白色、表面干燥有褶皱、无光泽、不透明，边缘不光滑。
[0007] 生理生化特征：革兰氏阳性细菌。
[0008] 2、该菌株的筛选方法为：
[0009] 步骤一、富集：从西安市雁塔区西安文理学院生物技术学院无花果园土壤表层以 下5cm?10cm采集土样100g左右，将采得的土样放入纸袋中带回实验室分离。以无菌方 式称取土样10. 〇g放入含有100. OmL富集培养基（已灭菌）的250mL的三角瓶中，于30°C， 140r/min恒温摇床富集培养5d ;然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的富集培养基中，再 进行3次富集培养，每次5d ;所述富集培养基的组成为：葡萄糖3. 506g，蛋白胨0. 83g，酵母 膏0. 5g，磷酸二氢钾0. 35g，碳酸钙0. 25g，卵磷脂0. 02g，蒸馏水lOOOmL，培养基pH值6. 8? 7. 1，105KPa 灭菌 20min ?25min ;
[0010] 步骤二、筛选和纯化：将步骤一中3次富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀 释，取10_ 3、10_4、10_5、10_6、10_7 5个稀释度的培养液各0. lmL涂布于有机磷固体平板培养基 中，每个稀释度涂布3块平板，置于28°C恒温培养箱内培养5d，能产生溶磷圈（透明圈）的 菌株即为解磷细菌，将溶磷圈较大的菌株在有机磷固体培养基平板上进行多次划线纯化， 以纯化得到形态一致的纯化菌株，然后将纯化菌株转接到基础培养基斜面上，于28°C培养 箱中培养2d，置于4°C冰箱中保存待用；所述基础培养基的组成为：葡萄糖3. 506g，蛋白 胨0. 83g，酵母膏0. 5g，磷酸二氢钾0. 35g，碳酸|丐0. 25g，琼脂16g?20g，蒸馈水1000mL ;所 述有机磷固体平板培养基的组成为：基础培养基，卵黄液60mL，培养基pH值自然；有机磷固 体平板培养基的制法：将l〇〇〇mL灭菌后的基础培养基冷却到50°C以下，立即加入60mL新 鲜配制的卵黄液后移入平板；卵黄液制备：以酒精擦净鸡蛋外壳，用解剖刀切破鸡蛋两端， 流去卵清后将卵黄流入已灭菌的锥形瓶中，约加等量无菌生理盐水摇匀；
[0011] 步骤三、复筛：将步骤二中保存的菌株活化后得到菌悬液，将菌悬液滴加到有机磷 固体平板培养基中，以1 μ L无菌水为对照，重复3次，28°C条件下培养5d，用直尺测量溶磷 圈直径（D)和菌落直径（d)，并根据是否产生溶磷圈以及D/d值的大小来初步确定菌株的 解磷能力（D/d值越大解磷能力越好）；然后将解磷能力好的菌株接种于50mL蒙金娜有机 磷液体培养基中，以等体积的无菌水为对照，重复3次，摇床培养（28°C、120r/min)7d后， 8000r/min离心15min，取上清液5mL，进行超声波破碎细菌细胞（200W，20min)，使之释放出 细菌细胞内的有效磷，用钥锑抗比色法测定PCV 4含量，保存PCV4含量最高的菌株，命名为 ZK1-18 ;所述的蒙金娜有机磷液体培养基的制备方法为：向1000mL灭菌后的蒙金娜培养基 中加入0. 2g用无水乙醇溶解的经过滤和灭菌的卵磷脂，其中蒙金娜培养基的组成为：葡萄 糖 10g，（NH4)2S04 0· 5g，MgS04 · 7H20 0· 3g，NaClO. 3g，KC1 0· 3g，FeS04 0· 03g，MnS04 · H20 〇· 〇3g，蒸馈水 1000mL，105KPa 灭菌 20min ?25min。
[0012] 3、该菌株的鉴定方法为：
[0013] (1)形态学鉴定：将筛选出来的菌株ZK1-18在琼脂平板上培养，观察细菌菌落生 长特征，注意其形状、大小、颜色、透明度、边缘特征等，并作记录；同时用接种环挑取单菌落 进行革兰氏染色，镜检，记录结果。
[0014] 结果：ZK1-18菌株呈杆状，大小（0. 5?0. 8) μ mX (1. 8?2. 2) μ m，芽孢中生或近 中生。菌落圆形，白色、表面干燥有褶皱、无光泽、不透明，边缘不光滑，革兰氏染色呈阳性。
[0015] (2)生理生化鉴定：生理生化实验按照伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）方法进行， 结果见下表。
[0016] 表1 ZK1-18菌株的生理生化特征
[0017]
【权利要求】
1. 一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis ZK1-18， 保藏编号 CGMCC No. 9402。
【文档编号】C12R1/125GK104195078SQ201410417922
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】赵咏梅 申请人:西安文理学院