一种检测人类y染色体微缺失的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒。本发明确定最优的STS分布及PCR扩增体系，将15个STS分配到4管中设计特定的引物，进行多重PCR扩增，建立了一种符合2013版EAA/EMQN指南要求的Y染色体微缺失检测测试剂盒，所述试剂盒检测特异性强、灵敏度高和条带均一性好。实现一次试验即可检测和确证Y染色体的微缺失类型，满足2013版EAA/EMQN指南的“基本分析”和“拓展分析”要求，可方便快速地为Y染色体微缺失的临床处理提供科学、全面的依据。
【专利说明】一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类Υ染色体微缺失的试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 人类Υ染色体长臂上存在与精子生成密切相关的无精子因子（Azoospermia factor，AZF)，无精子因子发生微小的DNA片段缺失称之为Y染色体微缺失。发生Y染色体 微缺失，会引起精子生成障碍，导致少、弱、畸形精子症甚至无精子症。据WHO统计，男性原 发性无精子症与少精子症患者中约10%?15%存在Y染色体微缺失。在精子生成障碍引 起的男性不育患者中，Y染色微缺失的发生率是居于第二位的遗传因素。
[0003] 目前，AZF被划分为3个区，S卩AZFa、AZFb和AZFc，这些区域的任何一个或多个 缺失都将导致精子发生障碍，造成少、弱、畸形精子症甚至无精子症，最终导致不育在AZF 的3个区中，每个区域均有明确的序列标签位点（Sequence tagged site, STS)可供识 另1J ;每个区域的缺失机理和缺失的断裂点均已明确。由欧洲男科协会（European Academy of Andrology，EAA)和欧洲分子遗传质控网（European Molecular Genetics Quality Network, EMQN)联合发布的1999版和2004版《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》均推 荐使用多重PCR-琼脂糖凝胶检测STS的方法来检测Υ染色体的微缺失。同时，指南推荐每 个区域检测2个STS，分别为AZFa检测sY84和sY86, AZFb检测sY127和sY134, AZFc检测 sY254和sY255,若每个区域的2个STS发生缺失时，则代表该区域发生缺失；并指出通过以 上6个STS可以检测出几乎所有临床相关的微缺失或95%文献报道的AZF微缺失，足以满 足常规诊断。2013年，EAA和EMQN发布新版指南，在上述指南的基础上提出Y染色体微缺 失检测的流程图，并将上述的6个STS的检测定义为"基础分析"，若"基础分析"中，某个区 域的2个STS发生缺失，则必须进行后续的"拓展分析"，选择该缺失区域的近端和远端断裂 点上下游的STS和Y染色体远端的异染色质标签进行检测确证，判断是否该区域发生完全 缺失或Y染色体异染色质化。另外，指南明确指出，不推荐检测独立的基因特异性缺失来进 行Y染色体微缺失检测。
[0004] 现有的产品均能检测指南推荐的6个STS，即：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、 sY255,可以满足2013版EAA/EMQN指南"基本分析"的需求，但均不能满足2013版EAA/EMQN 指南的"拓展分析"需求。有些产品（如北京阅微、Promega)还含有2013版EAA/EMQN指南 不推荐检测的STS或独立的基因。因此，根据2013版EAA/EMQN指南的检测流程图，这些产 品的检测结果是不足以出具报告指导临床或进行遗传咨询的。
[0005] 另外，现有产品采用的技术平台也具有局限性。
[0006] 1)多重PCR-琼脂糖凝胶电泳。首先，琼脂糖凝胶电泳的检测方法，检测灵敏度低， 产物量（上样量）较少时条带不易判别，难以区分弱阳性与阴性，容易造成假阳性或假阴 性；其次，该方法的分辨率低，扩增片段之间必须达到30bp以上，才能较好区分。再者，琼脂 糖凝胶电泳从制胶、上样到信号读取，均需人工操作，工作量大。
[0007] 2)多重实时荧光PCR。该方法虽然具有简便、快速的优势，但需要设计特异性的检 测探针并进行报告基团的修饰，难度较大且价格昂贵。
[0008] 3)其他平台，如北京阅微（CN 102912028A)采用测序仪进行检测，北京海斯特（CN 103571957A)采用DHPLC进行检测。测序仪和HPLC价格昂贵，仪器操作和结果判读专业性 要求高，不利于推广。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，在 一次试验中同时满足"基本分析"和"拓展分析"的要求，且方便、快速、结果可靠，有效地减 少操作人员的工作量，降低检测成本。
[0010]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种检测人类Y染色体 微缺失的试剂盒，包括PCR反应液I、PCR反应液II、PCR反应液III和PCR反应液IV ;
[0011] 所述PCR反应液I包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体 sY254位点、sY105位点、SY1192位点、sY88位点的引物；
[0012] 所述ZFX/Y位点的序列如：SEQ ID N0 :1 ;
[0013] 所述sY254位点的序列如：SEQ ID NO :2 ;
[0014] 所述sY105位点的序列如：SEQ ID NO :3 ;
[0015] 所述sY1192位点的序列如：SEQ ID NO :4 ;
[0016] 所述sY88位点的序列如：SEQ ID NO :5 ;
[0017] 所述PCR反应液II包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体sY84 位点、sY127位点、sY1065位点、sY153位点的引物；
[0018] 所述sY84位点的序列如：SEQ ID N0 :6 ;
[0019] 所述sY127位点的序列如：SEQ ID NO :7 ;
[0020] 所述sY1065位点位点的序列如：SEQ ID NO :8 ;
[0021] 所述sY153位点的序列如：SEQ ID NO :9 ;
[0022] 所述PCR反应液III包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体sY86 位点、sY160位点、sY121位点、sY255位点的引物；
[0023] 所述sY86位点的序列如：SEQ ID N0 :10 ;
[0024] 所述sY160位点的序列如：SEQ ID NO :11 ;
[0025] 所述sY121位点的序列如：SEQ ID NO :12 ;
[0026] 所述sY255位点的序列如：SEQ ID NO :13 ;
[0027] 所述PCR反应液IV包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体SRY 位点、sY254位点、sY82位点、sY1064位点的引物。
[0028] 所述SRY位点的序列如：SEQ ID N0 :14 ;
[0029] 所述sY254位点的序列如：SEQ ID NO :15 ;
[0030] 所述sY82位点的序列如：SEQ ID NO :16 ;
[0031] 所述sY1064位点的序列如：SEQ ID NO :17。
[0032] 本发明有益效果：目前，现有的Y染色体微缺失检测均只能满足2013版EAA/EMQN 指南的"基本分析"的要求，不能满足2013版EAA/EMQN指南Y染色体微缺失检测流程图及 "拓展分析"的要求，检测结果不够科学全面，有些产品甚至还可检测2013版EAA/EMQN指南 不推荐使用的STS或基因，使检测结果的临床解释复杂化，不利于对临床的指导。
[0033] 本发明在每个AZF微缺失区段除了选择"基本分析"的STS外，还在区段断裂点的 上下游选择就近的STS用于"扩展分析"，本发明确定最优的STS分布及PCR扩增体系，将 15个STS分配到4管中进行多重PCR扩增，建立了一种符合2013版EAA/EMQN指南要求的 Y染色体微缺失检测方法，并开发相应的检测试剂盒，所述试剂盒检测特异性强、灵敏度高 和条带均一性好。实现一次试验即可检测和确证Y染色体的微缺失类型，满足2013版EAA/ EMQN指南的"基本分析"和"拓展分析"要求，可方便快速地为Y染色体微缺失的临床处理 提供科学、全面的依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为本发明试剂盒的正常男性DNA样本检测图；
[0035] 图2为本发明试剂盒的人类Y染色体微缺失AZFc区缺失样本检测图。
【具体实施方式】
[0036] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 并配合附图详予说明。
[0037] 本发明最关键的构思在于：本发明每个AZF微缺失区段除了选择"基本分析"的 STS外，还在区段断裂点的上下游选择就近的STS用于"扩展分析"，选择15个扩增片段的 长度不同的STS区段，确定最优的STS分布及PCR扩增体系，将15个STS分配到4管中进 行多重PCR扩增。
[0038] 实施例1
[0039] 1、技术基础
[0040] 1. 1利用已知的Y染色体微缺失及STS的研究成果进行多重PCR反应液的设计和 实施。
[0041] 其主要研究内容包括：根据2013版EAA/EMQN指南的要求和推荐的STS，选择AZF 微缺失各区域的STS ;根据所选的各STS的扩增片段长度和区域分布设计4管STS PCR扩 增组合；每管STS扩增组合用相应的STS扩增引物进行多重PCR扩增，特异性地获得各STS 的目标片段。每管STS扩增组合均用人类锌指蛋白基因 ZFX/Y作为实验内控，第IV管STS 扩增组合扩增雄性性别决定基因（Sex-determine Region of Y一Chromosome，SRY)作为性 别异常对照。
[0042] 1. 2利用毛细管电泳仪进行多重PCR扩增产物的检测
[0043] 毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE)，是一类以毛细管为分离通道、以 高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。与传统的电泳方法相比，毛细管可实现高效、 快速、微量和自动化检测。
[0044] 将多重PCR扩增获得的4管STS扩增产物置于毛细管电泳仪（YN seplOO)中，设定 电泳程序，毛细管电泳仪将自动进行上样、电泳分离和结果记录，无需人员值守，快速方便。
[0045] 2、具体技术实施方案
[0046] 2. 1STS的选择及其引物的验证
[0047] 根据2013版EAA/EMQN指南的要求，每个AZF微缺失区段除了选择"基本分析"的 STS外，还需在区段断裂点的上下游选择就近的STS用于"扩展分析"，已确证各区段是否发 生区段完整缺失。根据2013版EAA/EMQN指南的推荐，本发明选择的STS见表1。
[0048] 表1本发明选择的各区段检测STS
[0049]
【权利要求】
1. 一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液I、PCR反应 液II、PCR反应液III和PCR反应液IV ; 所述PCR反应液I包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体sY254位 点、sY105位点、SY1192位点、sY88位点的引物； 所述ZFX/Y位点的序列如：SEQ ID NO :1 ; 所述sY254位点的序列如：SEQ ID NO :2 ; 所述sY105位点的序列如：SEQ ID NO :3 ; 所述sY1192位点的序列如：SEQ ID NO :4 ; 所述sY88位点的序列如：SEQ ID NO :5 ; 所述PCR反应液II包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体sY84位 点、sY127位点、SY1065位点、sY153位点的引物； 所述sY84位点的序列如：SEQ ID NO :6 ; 所述sY127位点的序列如：SEQ ID NO :7 ; 所述sY1065位点位点的序列如：SEQ ID NO :8 ; 所述sY153位点的序列如：SEQ ID NO :9 ; 所述PCR反应液III包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体sY86位 点、sY160位点、sY121位点、sY255位点的引物； 所述sY86位点的序列如：SEQ ID NO :10 ; 所述sY160位点的序列如：SEQ ID NO :11 ; 所述sY121位点的序列如：SEQ ID NO :12 ; 所述sY255位点的序列如：SEQ ID NO :13 ; 所述PCR反应液IV包括：特异性扩增ZFX/Y位点的引物，特异性扩增Y染色体SRY位 点、sY254位点、sY82位点、SY1064位点的引物； 所述SRY位点的序列如：SEQ ID NO :14 ; 所述sY254位点的序列如：SEQ ID NO :15 ; 所述sY82位点的序列如：SEQ ID NO :16 ; 所述sY1064位点的序列如：SEQ ID N0:17。
2. 根据权利要求1所述检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于， 所述PCR反应液I包括： 特异性扩增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特异性扩增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特异性扩增Y染色体sY254位点的引物，序列如：SEQ ID N0:22和SEQ ID N0:23所 示； 特异性扩增Y染色体sY105位点的引物，序列如：SEQ ID NO :24和SEQ ID NO :25所 示； 特异性扩增Y染色体sY1192位点的引物，序列如：SEQ ID NO :26和SEQ ID NO :27所 示； 特异性扩增Y染色体sY88位点的引物，序列如：SEQ ID NO :28和SEQ ID NO :29所示； 所述PCR反应液II包括： 特异性扩增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特异性扩增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特异性扩增Y染色体sY84位点的引物，序列如：SEQ ID NO :30和SEQ ID NO :31所示； 特异性扩增Y染色体sY127位点的引物，序列如：SEQ ID NO :32和SEQ ID NO :33所 示； 特异性扩增Y染色体sY1065位点的引物，序列如：SEQ ID NO :34和SEQ ID NO :35所 示； 特异性扩增Y染色体sY153位点的引物，序列如：SEQ ID NO :36和SEQ ID NO :37所 示； 所述PCR反应液III包括： 特异性扩增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特异性扩增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特异性扩增Y染色体sY86位点的引物，序列如：SEQ ID NO :38和SEQ ID NO :39所示； 特异性扩增Y染色体sY160位点的引物，序列如：SEQ ID NO :40和SEQ ID NO :41所 示； 特异性扩增Y染色体sY121位点的引物，序列如：SEQ ID NO :42和SEQ ID NO :43所 示； 特异性扩增Y染色体sY255位点的引物，序列如：SEQ ID NO :44和SEQ ID NO :45所 示； 所述PCR反应液IV包括： 特异性扩增ZFX的引物，序列如：SEQ ID NO :18和SEQ ID NO :19所示； 特异性扩增ZFY的引物，序列如：SEQ ID NO :20和SEQ ID NO :21所示； 特异性扩增Y染色体短臂SRY位点的引物，序列如：SEQ ID NO :46和SEQ ID NO :47所 示； 特异性扩增Y染色体sY254位点的引物，序列如：SEQ ID NO :48和SEQ ID NO :49所 示； 特异性扩增Y染色体sY82位点的引物，序列如：SEQ ID NO :50和SEQ ID NO :51所示； 特异性扩增Y染色体sY1064位点的引物，序列如：SEQ ID NO :52和SEQ ID NO :53所 /_J、1 o
3. 根据权利要求1所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 的每个PCR反应液还分别包括：10XPCR Buffer，5XQ Solution，25mM MgCl2,25mM dNUTP， lOOmM dUTP，lU/yL UNG 酶，HotStart Taq 和 250XM 染料。
4. 根据权利要求3所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 的每个PCR反应液中每条引物的起始浓度为100 μ Μ。
【文档编号】C12Q1/68GK104152573SQ201410425722
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】林斯里, 滕乐, 田洁 申请人:亚能生物技术（深圳）有限公司