一种-20°c保存的2×pcr混合液的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可放-20°C保存的2×PCR混合液，属于生物【技术领域】。100μl2×PCR混合液配置如下：7.5μl二甲基亚砜，7.5μl0.1%牛血清蛋白溶液，10μl10mMdNTP溶液，20μl10×PCRbuffer，50μl30%重量比甘油溶液，5μlrTaq酶，将上述混匀后离心，存放于-20°C冰箱中。该混合液能长期存放于-20°C保存，具有较高的应用价值，能减少PCR扩增体系配置时间以及提高PCR体系配置的准确性和减少PCR扩增过程中的污染。
【专利说明】-种-20° C保存的2X PCR混合液
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可放_20° C保存的2XPCR混合液，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR)是一种体外快速扩增特定 DNA片段的技术，它是现代分子生物学最重要的手段之一。其基本原理是根据获诺贝尔 1953年生理学奖的DNA双螺旋模型所建立的体细胞复制的机制以及双链DNA在体外可随温 度变化发生变性与复性的特点设计。1985年Randll.K. Skaii等利用Klenow DNA聚合酶建 立了聚合酶链式反应技术，并将其应用于镰刀形贫血病的基因诊断。它是80年代分子生物 学领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。此项技术一经 问世就因其操作简单、快速、灵敏度高和特异性强等优点迅速在与分子生物学相关的学科 得到广泛应用，如分子生物学研究、医学检验、动植物检验、法医鉴定及考古等各个领域。
[0003] 在PCR过程中，DNA聚合酶起着关键性作用。目前已有100多个DNA聚合酶的相 关基因被克隆和测序，Thermus aquaticus是一种水生嗜热菌，从该菌中分离出的DNA聚合 酶（Taq DNA聚合酶）具有催化以DNA为模板合成DNA的功能。
[0004] Taq NDA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。研究表 明，Mg2+浓度低于ImM，dNTP过多，鳌合Mg2+作用强时，Mg2+对Taq DNA聚合酶的催化作 用几乎丧失，不产生扩增产物。随着Mg2+浓度的增加，其催化作用增强，扩增产物增多，但 产物浓度增大的同时，背景也明显增强。
[0005] 常规的PCR扩增体系配置，往往是将dNTP、Buffer、rTaq酶等试剂单独保存，待要 进行PCR扩增时，将样品分别加到同一 PCR管中，在操作过程中除了经常忘记加入个别试剂 的缺点外，多次的使用会对试剂造成污染，影响后续使用。因此，研发一种PCR扩增体系对 于减少PCR扩增体系配置时间以及提高PCR体系配置的准确性和减少PCR扩增过程中的污 染有着极其大的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种可放-20° C保存的2XPCR混合液，该混合液能长期存放 于-20° C保存，具有较高的应用价值。
[0007] 本发明的一种-20 ° C保存的2 X PCR混合液： (1)2X PCR混合液的配置：100μ1 2XPCR混合液配置如下：7. 5μ1二甲基亚砜， 7·5μ1 0.1% 牛血清蛋白溶液，10μ1 10mM dNTP 溶液，20μ1 10XPCR buffer，50yl 30% 重量比甘油溶液，5 μ 1 rTaq酶，将上述混匀后离心，存放于-20° C冰箱中。
[0008] 其中 10XPCR buffer 的配置如下：100mM Tris-HCl pH 8. 3,500 mM KC1，15mM MgCl2。
[0009] (2)2X PCR混合液的使用：从冰箱中取出2X PCR混合液，配置PCR体系，以20 μ 1 的PCR体系为例，配置如下：2Χ PCR混合液10μ 1，引物R 1μ 1，引物F 1μ 1，模版1μ 1， 灭菌水7 μ 1。
[0010] 常规性的PCR扩增体系的配置都是将每个实验药品单独加到PCR管中进行PCR扩 增，这样的配置方式不仅费时，同时也增加了实验操作的不稳定性。通过将PCR体系配置 过程中必须的实验药品配成混合体系不仅可以节省大量时间，同时可以防止药品的交叉污 染，单纯地将PCR体系配置中的必须药品混合在一起并无法长期放于-20° C保存。因此本 混合液中加入了 30%甘油溶液对DNA聚合酶的活性进行保护，使其可以长期放于-20° C。 [0011] 本发明的显著优点： 1.能够减少PCR体系配置的时间。
[0012] 2.能够尽量降低PCR的污染。
[0013] 3.能够低温保存，使用方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为PCR扩增结果图，泳道1是DNA mark，泳道2-4是新鲜配置的rTaq酶扩增 结果，泳道5-6是存放于-20° C 6个月的混合液的扩增结果。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 本发明的-20 ° C保存的2 X PCR混合液的试剂盒及方法，具体步骤如下： (1)2X PCR混合液的配置：100μ1 PCR混合液体系配置如下：7. 5μ1二甲亚砜 (DMS0)溶液，7·5μ1 0.1%牛血清蛋白（BSA)溶液，10μ1 lOmMDNTP 溶液，20μ1 10XPCR buffer，50 μ 1 30%甘油溶液，5 μ 1 rTaq酶。将配置好的溶液混匀后离心，存放于-20° C 冰箱中。
[0016] PCR扩增体系的配置：从冰箱中取出2 X PCR混合液，配置PCR体系，20 μ 1的 PCR体系配置如下：2Χ PCR混合液10μ1，引物R Ιμ?，引物F Ιμ?，模版Ιμ?，灭菌 水7μ1。同时配置新鲜的rTaq酶扩增体系（常规配置)，20μ1的PCR体系配置如下：2ul 10XPCR buffer，0.5ul 二甲亚砜（DMS0)溶液，0·5μ1 0.1% 牛血清蛋白（BSA)溶液，Ιμ? 10mM DNTP溶液，引物R 1μ 1，引物F 1μ 1，模版 1μ 1，0,5μ 1 rTaq酶，12.5ul 灭菌水。模 板为水稻cDNA。将以上配置好的体系同时进行PCR扩增，PCR扩增的程序为： 95° C 5min 95° C 30 ! 58 : C 30s ^ 30 times 72° C lmin ； 72° C ΙΟη?ι 将获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0017] 其中 10XPCR buffer 的配置方法如下：100mM Tris-Hcl (PH 8. 3)，500 mM Kcl， 15mM Mgcl2。引物 R :5, -TATAGGGTACCGCGAGGCCGGCCAAGGTGCAGGAGATGTTCG-3' 引物 F: 5' -GGCGACTAGTCTAGTTGGTGAAGTTGTTGAGGCAGGCGTGGG-3， 如图1所示，-20° C保存6个月的2XPCR混合液的扩增结果仍然与常规的PCR体系 配置方法扩增效果相当，且本发明通过添加 DMSO和BSA等物质提高了 PCR扩增过程中的稳 定性和特异性。另外在大批量PCR体系的配置过程中，由于需要加的样品过多经常导致漏 加或多加，对实验的结果产生了很大的影响，通过配置2XPCR混合液可以大大缩减PCR体 系配置的时间，同时进一步提高了实验的准确性。同时由于本混合液可放于-20° C保存， 在最大程度上保护了 DNA聚合酶的活性。因此可以一次配置，多次使用，提高了 PCR扩增体 系配置的便捷性和稳定性。
【权利要求】
1. 一种-20° C保存的2XPCR混合液，其特征在于，100yl2XPCR混合液配置如下： 7·5μ1 二甲基亚砜，7·5μ1 0.1% 牛血清蛋白溶液，10μ1 10mM dNTP 溶液，20μ1 10XPCR buffer，50yl 30%重量比甘油溶液，5μ1 rTaq酶，将上述混匀后离心，存放于-20° C冰箱 中。
2. 根据权利要求1所述的-20° C保存的2XPCR混合液，其特征在于，所述10XPCR buffer 的配置如下：100mM Tris-HCl pH 8. 3,500 mM KCl，15mM MgCl2。
【文档编号】C12N15/10GK104195132SQ201410449320
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】王清水, 余彦 申请人:福建师范大学