一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备dpp-iv抑制肽的方法
【专利摘要】本发明涉及一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-IV抑制肽的方法，包括如下步骤：将新鲜豆渣与水混合后的豆渣悬液放置于30-50℃，当pH为3.0-5.0时取出，悬液分层后收集最下层的豆渣蛋白质，室温晾干，加入蛋白酶制得DPP-IV抑制肽粗品粉末，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-IV抑制肽纯品。本发明豆渣蛋白质的提取方法简单，制备过程中不需要添加任何酸液或碱液，避免了对环境的污染。采用豆渣蛋白质制备DPP-IV抑制肽工艺简单，成本低廉，制备而成的DPP-IV抑制肽的抑制率介于4.1～93.2％之间，半数抑制浓度介于42.70μg/mL～2593.64μg/mL。
【专利说明】—种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-1V抑制肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于保健食品领域，具体涉及一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-1V抑制肽的方法。
【背景技术】
[0002]在豆腐、豆浆和大豆分离蛋白(SPI)的加工中，有大量的副产物豆渣产生，而且豆渣含有15%?20%的蛋白质。国内每年用于加工豆腐或豆奶的大豆约400万吨，用于加工大豆分离蛋白的大豆约为300万吨，产生的豆渣数量是非常庞大的。豆渣是一种纤维状残渣，长期以来，由于新鲜豆渣含水量高(可达75-78% )，容易腐败变质，通常作为废弃物直接丢弃，极少用来食用，只有部分被用作词料或肥料。因此，豆渣利用率低，其潜在营养价值未得到充分的开发利用，甚为可惜。然而，随着人们对食品营养需求的提升，对豆渣的研究也越来越深入。
[0003]目前，豆渣中蛋白质的提取方法通常主要是碱溶酸沉法。碱溶酸沉提取工艺是利用弱碱性水溶液浸泡低变性脱脂豆柏，使豆柏中可溶性蛋白质溶于弱碱性水溶液中，然后采用盐酸溶液滴加进入已溶解蛋白质的弱酸溶液中，调节其PH值到大豆蛋白的等电点(pH=4.2-4.6)，使大豆蛋白质沉淀下来，最后通过过滤、溶解、中和、灭菌和喷雾干燥，得到粉末状大豆分离蛋白产品。采用碱溶酸沉法时，常规使用的酸液和碱液分别为HCl和NaOH，这两种试剂容易造成环境的污染。
[0004]2型糖尿病发病和进展的一个重要原因是胰岛功能的进行性衰退，包括β细胞胰岛素分泌缺陷和α细胞胰升糖素不适当的分泌增加造成的胰岛素与胰升糖素比例失调。胰升糖素样肽I(GLP-1)是一种在食物营养物质刺激下，由肠道内分泌细胞合成分泌的肠促胰素(Incretin)，具有葡萄糖依赖性促胰岛素分泌的特性，可通过促进β细胞的胰岛素分泌、抑制α细胞不适当的胰升糖素分泌、延缓胃排空及抑制食欲等多个途径参与机体血糖稳态调节。同时，GLP-1还可促进β细胞增殖、抑制β细胞凋亡，增加胰岛素合成、改善β细胞功能。
[0005]但内源性活性GLP-1半寿期极短，迅速被二肽基肽酶(DPP-1V)裂解而失活，不能达到2型糖尿病治疗浓度。DPP-1V抑制剂，可以选择性抑制DPP-1V活性，阻止内源性活性GLP-1裂解，延长其半衰期，提高其血浆水平和效能。
[0006]DPP-1V抑制剂通常为酮类化合物和哌嗪类化合物，均具有不同程度的毒副作用。此外，中国专利CNlO 1029081中，公布了重组蛋白Exendin_4多肽具有DPP-1V抑制特性，该多肽通常采用化学合成法和基因工程菌发酵法来生产，工序繁琐，价格也比较昂贵，且产品稳定性也较差。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于:提供一种豆渣蛋白质的简易的提取方法及其用于制备DPP-1V抑制肽的方法。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供:
[0009]一种豆渣蛋白质的提取方法，按如下步骤进行:
[0010](I)将新鲜的豆渣按照料液比为1: 10?1: 100加入水，搅拌均匀；
[0011](2)将豆渣液放置于30-50°C温度条件下，放置时间1.0?24h，在此过程中豆渣液的pH值不断降低，待pH值为3.0-5.0时，将豆渣液取出，室温下冷却降温，此时豆渣液分成三层，最上层为浅黄色漂浮物，中间层为水，最下层为析出的浅黄色蛋白质，采用玻璃容器将最上层的黄色漂浮物弃去；
[0012](3)采用2-12层120目以上纱布过滤，除去水，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，将豆渣蛋白质放置于室温自然晾干。
[0013]采用上述的豆渣蛋白质制备DPP-1V抑制肽的方法，按如下步骤进行:
[0014](I)按料液比为1: 20?1: 200向豆渣蛋白质中加入水，调节pH值至1.5?10.0 ；
[0015](2)按蛋白酶与加水之前的豆渣蛋白质比为1: 200?1: 20再加入蛋白酶，调节温度至20?60°C,进行水解反应0.5?6h，水解反应结束后，灭酶得到水解液；
[0016](3)将水解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得DPP-1V抑制肽粗品粉末；
[0017](4)将DPP-1V抑制肽粗品粉末配成浓度为20-200mg/ml的溶液，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-1V抑制肽纯品。
[0018]所述的步骤(2)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种的复配。
[0019]所述的步骤(3)中干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
[0020]所述的步骤(4)中膜分离采用的膜孔径有10kDa、5kDa和3kDa，柱层析填料有:SP-葡聚糖凝胶C-25，CM-葡聚糖凝胶C-25，葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15，葡聚糖凝胶G-1O ;当采用葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15和葡聚糖凝胶G-1O时，DPP-1V抑制肽粗品粉末需要用水溶解；当采用SP-葡聚糖凝胶C-25和CM-葡聚糖凝胶C-25，DPP-1V抑制肽粗品粉末需要用乙酸缓冲液溶解。
[0021]本发明的有益效果在于:本发明豆渣蛋白质的提取方法简单，通过将豆渣液置于30-50°C温度条件下，放置时间1.0?24h，由于豆渣中的油脂和蛋白质等营养成分，在遇到氧气时被氧化或经微生物作用或高温氧化，会产生小分子酸。在此过程中豆渣液的PH值不断降低，不需要添加任何酸液或碱液就能实现对豆渣液体PH值的控制，避免了对环境的污染。
[0022]采用豆渣蛋白质制备DPP-1V抑制肽工艺简单，制备而成的DPP-1V抑制肽的抑制率介于4.1?93.2%之间，半数抑制浓度介于42.70 μ g/mL?2593.64μ g/mL。本发明提供的技术方案为豆渣蛋白质的利用开辟了新途径，符合精深加工范畴，通过采用废弃的豆渣蛋白质制备DPP-1V抑制肽，较传统的制备方法而言，大大降低了生产成本，且产品无毒副作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明的工艺流程图
【具体实施方式】
[0024]以下将结合实施例，对本发明进行进一步、详细的说明，所有原料均购自于市场或依现有技术制备。
[0025]一种豆渣蛋白质的提取方法，按如下步骤进行:
[0026](I)将新鲜的豆渣按照料液比为1: 10?1: 100加入水，搅拌均匀；
[0027](2)将豆渣液放置于30_50°C温度条件下，放置时间1.0?24h，在此过程中豆渣液的pH值不断降低，待pH值为3.0-5.0时，将豆渣液取出，室温下冷却降温，此时豆渣液分成三层，最上层为浅黄色漂浮物，中间层为水，最下层为析出的浅黄色蛋白质，采用玻璃容器将最上层的黄色漂浮物弃去；
[0028](3)采用2-12层120目以上纱布过滤，除去水，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，将豆渣蛋白质放置于室温自然晾干。
[0029]采用上述的豆渣蛋白质制备DPP-1V抑制肽的方法，按如下步骤进行:
[0030](I)按料液比为1: 20?1: 200向豆渣蛋白质中加入水，调节pH值至1.5?10.0 ；
[0031](2)按蛋白酶与加水之前的豆渣蛋白质比为1: 200?1: 20再加入蛋白酶，调节温度至20?60°C,进行水解反应0.5?6h，水解反应结束后，灭酶得到水解液；
[0032](3)将水解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得DPP-1V抑制肽粗品粉末；
[0033](4)将DPP-1V抑制肽粗品粉末配成浓度为20-200mg/ml的溶液，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-1V抑制肽纯品。
[0034]所述的步骤⑵中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种的复配。
[0035]所述的步骤(3)中干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
[0036]所述的步骤⑷中膜分离采用的膜孔径有10kDa、5kDa和3kDa，柱层析填料有:SP-葡聚糖凝胶C-25，CM-葡聚糖凝胶C-25，葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15，葡聚糖凝胶G-1O ;当采用葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15和葡聚糖凝胶G-1O时，DPP-1V抑制肽粗品粉末需要用水溶解；当采用SP-葡聚糖凝胶C-25和CM-葡聚糖凝胶C-25，DPP-1V抑制肽粗品粉末需要用乙酸缓冲液溶解。
[0037]实施例1
[0038]一、豆渣蛋白质的提取方法
[0039]取1g新鲜豆渣与500ml水混合均匀，将豆渣悬液放置于35°C的恒温箱内，8h后，测量PH值为4.5，取出，室温冷却，取出上层漂浮层后，将剩余的混合液采用12层纱布过滤，待过滤完成后，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，进行室温自然晾干，得到5.83g蛋白，该蛋白含水率为12.31%。
[0040]二、采用上述的豆渣蛋白质制备DPP-1V抑制肽的方法
[0041]取5g豆渣蛋白，与10ml水混合，调节pH值到9.0,添加0.05g碱性蛋白酶进行酶解，酶解过程中维持pH值为9.0±0.5，温度维持在20?60°C，进行水解反应6h后，采用沸水灭酶lOmin，冷却后，调节pH值到中性,经离心后,获得上清液,采用冷冻干燥法,获得DPP-1V抑制肽粗品粉末。DPP-1V抑制肽的浓度为2.0mg/nL时，其DPP-1V抑制率为35.81 ± 1.04%，半数抑制浓度为 1790.23 μ g/mL。
[0042]三、采用上述DPP-1V抑制肽粗品粉末纯化获得高纯度肽
[0043]DPP-1V抑制肽粗品粉末2g，溶于10mL去离子水中后进行超滤膜过滤，分别采用膜孔径为 10000Da，5000Da，3000Da 进行截留分子量，获得 > lOOOODa，10000_5000Da，5000-30000&和< 3000Da的四个组分。DPP-1V抑制肽浓度为2mg/mL时，四个组分的DPP-1V抑制率分别为 22.59%,31.37%,45.03%和 67.92%。
【权利要求】
1.一种豆渣蛋白质的提取方法，其特征在于，按如下步骤进行: (1)将新鲜的豆渣按照料液比为1: 10?1: 100加入水，搅拌均匀； (2)将豆渣液放置于30-50°C温度条件下，放置时间1.0?24h，在此过程中豆渣液的pH值不断降低，待pH值为3.0-5.0时，将豆渣液取出，室温下冷却降温，此时豆渣液分成三层，最上层为浅黄色漂浮物，中间层为水，最下层为析出的浅黄色蛋白质，采用玻璃容器将最上层的黄色漂浮物弃去； (3)采用2-12层120目以上纱布过滤，除去水，收集纱布上残留的豆渣蛋白质，将豆渣蛋白质放置于室温自然晾干。
2.根据权利要求1所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-1V抑制肽的方法，其特征在于，按如下步骤进行: (1)按料液比为1: 20?1: 200向豆渣蛋白质中加入水，调节pH值至1.5?10.0; (2)按蛋白酶与加水之前的豆渣蛋白质比为1: 200?1: 20再加入蛋白酶，调节温度至20?60°C,进行水解反应0.5?6h，水解反应结束后，灭酶得到水解液； (3)将水解液离心去除残渣，获得的上清液经干燥制得DPP-1V抑制肽粗品粉末； (4)将DPP-1V抑制肽粗品粉末配成浓度为20-200mg/ml的溶液，然后经过膜分离或柱层析进行进一步的纯化得到DPP-1V抑制肽纯品。
3.根据权利要求2所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-1V抑制肽的方法，其特征在于:所述的步骤⑵中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种的复配。
4.根据权利要求2所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-1V抑制肽的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
5.根据权利要求2所述的豆渣蛋白质用于制备DPP-1V抑制肽的方法，其特征在于:所述的步骤(4)中膜分离采用的膜孔径有10kDa、5kDa和3kDa，柱层析填料有:SP_葡聚糖凝胶C-25，CM-葡聚糖凝胶C-25，葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15，葡聚糖凝胶G-1O ；当采用葡聚糖凝胶G-25，葡聚糖凝胶G-15和葡聚糖凝胶G-1O时，DPP-1V抑制肽粗品粉末需要用水溶解；当采用SP-葡聚糖凝胶C-25和CM-葡聚糖凝胶C-25，DPP-1V抑制肽粗品粉末需要用乙酸缓冲液溶解。
【文档编号】A23J1/14GK104256047SQ201410455009
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】谢宁宁, 黄晶晶, 程江华, 王灼琛, 余丽, 王晓莉, 王苗苗, 李迪龙, 赵友成, 殷俊峰, 闫晓明 申请人:安徽省农业科学院农产品加工研究所