用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及其制备方法。该培养基以DMEM/F12为基础培养基，针对微囊化细胞培养特点，加入成分明确的小分子物质铁盐、锌盐、亚砸酸钠、乙酸钠、谷氨酰胺、葡萄糖。本发明培养基不影响微胶囊的稳定性，不存在传统无血清培养基中的胰岛素和转铁蛋白，减少了下游工艺和成本，并且产物表达接近价格昂贵的特定培养基培养水平，而价格不到后者十分之一。说明本发明的无蛋白培养基可以用于微囊化重组CH0细胞的培养和蛋白表达，并大幅降低培养成本。
【专利说明】用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基及 其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及用于微囊化重组中国仓鼠卵巢 细胞（Chinese Hamster Ovary，CH0)细胞培养的无蛋白培养基和相应的培养方法。
【背景技术】
[0002] 微囊化细胞培养 1964 年由 Chang TMS (文献 I. Chang TMS, 1964. Semipermeable microcapsules. Science 146, 524-525)最先提出，是一种应用广泛的培养技术，已开始用 于细胞大规模培养、重组蛋白生产等领域。微胶囊可以调高细胞对物理和化学环境所造成 的胁迫耐受性，实现细胞的高密度培养（文献2，Rokstad AM, 2002. Microencapsulation of celIs producing therapeutic proteins:Optimizing cell growth and secretion. Cell Transplant 11:313-324)，显著提高产物表达（文献 3. Zhang Y，2008. Optimization of microencapsulated recombinant CHO cell growth,endostatin production, and stability of microcapsule in vivo. J Biomed Mater Res B Appl 8101^^1^.84(1):79-881中国仓鼠卵巢细胞（CHO)是一种成纤维细胞，也是哺乳动物细胞 生产重组蛋白的主要细胞系，具有准确的转录后修饰功能和重组基因的高效扩增和表达能 力，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子。 现在已经有多种重组蛋白药物在CHO细胞中得到高效表达并投入市场，例如促红细胞生成 素（Erythropoietin),依那西普（Enbrel)。因此，采用微囊化CHO细胞生产重组蛋白具有 广阔的应用前景。
[0003] 传统的微囊化培养重组CHO培养基中含有血清，通常是在DMEM/F12基础培养基中 添加5-10%的小牛血清或胎牛血清。血清为细胞生长提供营养成分，并且提供了细胞增殖 必须的生长因子，促使细胞DNA的合成，促进细胞增殖。但是，哺乳动物的血清不仅价格昂 贵不适于大规模工业化生产，并且作为动物来源的补加物存在很多问题。无血清培养基要 求找到适当的具有血清功能的因子，如胰岛素、转铁蛋白几乎是所有细胞株在无血清培养 时需要的必需补充因子。但生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较 复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋 势而出现的。如Gibco公司生产的无蛋白培养基⑶OptiCHO价格昂贵，每升1000元，用于 培养重组CHO细胞时占据生产的大部分成本。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术存在的上述不足之处，提供一种适于微囊化培养重 组CHO细胞培养和重组蛋白表达的无蛋白细胞培养基。本发明需要解决的问题是提供一种 低成本的可用于重组中国仓鼠卵巢细胞微囊化培养的无蛋白培养基来有效生产重组蛋白。
[0005] 本发明上述目的是通过以下技术方案予以实现的：
[0006] 用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于所述无蛋白 培养基是在基础培养基中加入无机盐类、小分子营养物质和调控细胞生长的小分子物质， 所述培养基中无蛋白成分。
[0007] 如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋 白培养基含有DMEM/F12培养基和铁盐及锌盐。
[0008] 如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋 白培养基中无机盐类是铁盐柠檬酸铁。
[0009] 如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋 白培养基中无机盐类是锌盐硫酸锌。
[0010] 如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋 白培养基添加的小分子营养物质是葡萄糖和谷氨酰胺。
[0011] 如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋 白培养基中含有调控细胞生长的小分子物质是乙酸钠和亚硒酸钠。
[0012] 如所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其中所述无蛋 白培养基中含有DMEM/F12培养基和以下基本成分：
[0013]
【权利要求】
1. 用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特征在于：所述无蛋白 培养基是在基础培养基中加入无机盐类、小分子营养物质和调控细胞生长的小分子物质， 所述培养基中无蛋白成分。
2. 如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特 征在于：所述无蛋白培养基含有DMEM/F12培养基和铁盐及锌盐。
3. 如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特 征在于：所述无蛋白培养基中无机盐类是铁盐柠檬酸铁。
4. 如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特 征在于：所述无蛋白培养基中无机盐类是锌盐硫酸锌。
5. 如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特 征在于：所述无蛋白培养基添加的小分子营养物质是葡萄糖和谷氨酰胺。
6. 如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特 征在于：所述无蛋白培养基中含有调控细胞生长的小分子物质是乙酸钠和亚硒酸钠。
7. 如权利要求1所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基，其特 征在于：所述无蛋白培养基中含有DMEM/F12培养基和以下基本成分：
8. 权利要求1-7中所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基在 制备根据聚电解质络合原理制备的含有重组CHO细胞的生物微胶囊，以及微囊化重组CHO 细胞培养中的应用，其中所述微胶囊为海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠APA微胶囊。
9. 权利要求1-7中所述的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基在 制备APA微囊化重组CHO细胞中的应用，其特征在于：将适量细胞悬于无菌的海藻酸钠溶 液，利用微囊制备仪将细胞悬液滴入CaCl 2溶液形成海藻酸钙胶珠，钙化20分钟后海藻酸 钙凝胶珠与适量的聚赖氨酸溶液发生电解质络合反应形成微胶囊膜，成膜后的海藻酸钙凝 胶珠用柠檬酸钠溶液液化微囊内的海藻酸钙凝胶，形成液化核心的微胶囊，用生理盐水洗 去微胶囊和细胞碎屑，制备出微囊化重组CHO细胞；微囊化重组CHO细胞在37°C，5% CO2培 养箱，在本发明的用于培养微囊化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基中培养7天测定 DSPA表达量，与对照例对比。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于：将适量细胞悬于无菌的1.5% (w/v)海藻 酸钠溶液，细胞密度为2X106/ml，利用微囊制备仪将细胞悬液滴入1. 1% (WZV)CaCl2溶液 形成海藻酸钙胶珠，钙化20分钟后海藻酸钙凝胶珠与适量的聚赖氨酸溶液发生电解质络 合反应形成微胶囊膜，成膜后的海藻酸钙凝胶珠用55mmol/l的柠檬酸钠溶液液化微囊内 的海藻酸钙凝胶，形成液化核心的微胶囊，用生理盐水洗去微胶囊和细胞碎屑，制备出实验
所需的微囊化重组CHO细胞；微囊化细胞在37°C，5% CO2培养箱，在本发明的用于培养微囊 化重组中国仓鼠卵巢细胞的无蛋白培养基中培养7天测定DSPA表达量，与对照例对比。
【文档编号】C12N11/04GK104212768SQ201410482949
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】马小军, 王雨, 张英, 李娜, 陈立, 于炜婷, 李珅 申请人:中国科学院大连化学物理研究所