一种检测人类y染色体微缺失的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、PCR反应液Ⅲ；所述PCR反应液Ⅰ包括：特异性扩增ZFX/Y、sY254、sY134和SRY位点的引物和荧光探针；所述PCR反应液Ⅱ包括：特异性扩增ZFX/Y、sY84和Y127位点的引物和荧光探针；所述PCR反应液Ⅲ包括：特异性扩增ZFX/Y、sY255和sY86位点的引物和荧光探针；本发明试剂盒通过设计不同STS的特异性荧光探针，并优化组合3管反应体系，实现一次试验即可检测Y染色体的微缺失类型，并通过ZFX/Y对不同反应体系进行有效监控。
【专利说明】一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及染色体缺失检测领域，具体涉及一种检测人类γ染色体微缺失的试剂 盒。
【背景技术】
[0002]人类Υ染色体长臂上存在与精子生成密切相关的无精子因子（Azoospermia factor，AZF)，无精子因子发生微小的DNA片段缺失称之为Y染色体微缺失。发生Y染色体 微缺失，会引起精子生成障碍，导致少、弱、畸形精子症甚至无精子症。据 W!10统计，男性原 发性无精子症与少精子症患者中约10% -15%存在Y染色体微缺失。在精子生成障碍引起 的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率是居于第二位的遗传因素。
[0003] 目前，AZF被划分为3个区，即AZFa、AZFb和AZFc，这些区域的任何一个或多个缺 失都将导致精子发生障碍，造成少、弱、畸形精子症甚至无精子症，最终导致不育。在AZF 的3个区中，每个区域均有明确的序列标签位点（Seciuence tagged site, STS)可供识 别；每个区域的缺失机理和缺失的断裂点均已明确。由欧洲男科协会（European Academy of Andrology，EM)和欧洲分子遗传质控网（European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)联合发布的1999版、2004版和2013版《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》 均推荐使用多重PCR-琼脂糖凝胶检测STS的方法来检测Y染色体的微缺失。同时，指南推 荐每个区域检测2个STS，分别为AZFa检测sY84和sY86, AZFb检测sY127和sY134, AZFc 检测sY254和sY255,若每个区域的2个STS同时发生缺失时，则代表该区域发生缺失；并 指出通过以上6个STS可以检测出几乎所有临床相关的微缺失或95%文献报道的AZF微缺 失，足以满足常规诊断。
[0004] 现有的产品均能检测指南推荐的6个STS,即：sY84、sY86、SY127、sY134、sY254、 sY255,但现有包含ZFX/Y和SRY双内控的产品均是不同管内扩增不同的内控。在进行多管 多重PCR扩增时，要对每一管反应体系的正常扩增进行监控，而不同内控不能有效地监控 多管反应体系检测的稳定性和可靠性。
[0005] 另外，现有产品采用的技术平台也具有局限性。
[0006] υ多重pcr-琼脂糖凝胶电泳。首先，琼脂糖凝胶电泳的检测方法，检测灵敏度低， 产物量（上样量）较少时条带不易判别，难以区分弱阳性与阴性，容易造成假阳性或假阴 性；其次，该方法的分辨率低，扩增片段之间必须达到30bp以上，才能较好区分；再者，琼脂 糖凝胶电泳从制胶、上样到信号读取，均需人工操作，工作量大。
[0007] 2)其他平台，如北京阅微（CN102912028A)采用测序仪进行检测，北京海斯特 (CN103571 957A)采用DHPLC进行检测。测序仪和HPLC价格昂贵，仪器操作和结果判读专业 性要求高，不利于推广。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种在一次试验中所有PCR反应体系采用同 一个内控ZFX/Y进行监测，能方便、快速、可靠地检测人类Y染色体微缺失的试剂盒。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种检测人类Υ染色体 微缺失的试剂盒，包括PCR反应液 1、PCR反应液11、PCR反应液111 ;
[0010] 所述PCR反应液I包括：
[0011] 特异性扩增ZFX/?位点的引物，序列如：SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；ZFX/ Y位点荧光探针，序列如SEQ ID N0 :3 ;
[0012] 特异性扩增Y染色体sY254位点的引物，序列如：SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所 示；sY254位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :6 ;
[0013] 特异性扩增Y染色体sY134位点的引物，序列如：SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所 示；sY134位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :9 ;
[0014] 特异性扩增Y染色体SRY位点的引物，序列如：SEQ ID NO :1〇和SEQ ID NO :11所 示；SRY位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :12 ;
[0015] 所述PCR反应液II包括：
[0016] 特异性扩增ZFX/Υ位点的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/ Y位点荧光探针,序列如SEQ ID NO :3 ;
[0017] 特异性扩增sY84位点的引物，序列如：SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14所示sY84 位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :15 ;
[0018] 特异性扩增sY127位点的引物，序列如：SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17所示； sY127位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :18 ;
[0019] 所述PCR反应液III包括：
[0020] 特异性扩增ZFX/Y位点的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/ Y位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :3 ;
[0021] 特异性扩增sY255位点的引物，序列如：SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20所示； sY255位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :21 ;
[0022] 特异性扩增sY86位点的引物，序列如：SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23所示；sY86 位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :24。
[0023] 本发明有益效果：目前，市场上的现有产品虽然符合EAA/EMQN指南的检测要求， 但不是所有产品都包含ZFX/Υ和SRY双内控，而包含双内控的产品均是不同管内扩增不同 的内控。本发明在进行多管多重荧光PCR扩增时，对每一管反应体系的正常扩增进行内部 控制，采用ZFX/Υ作为每一管反应体系的内控，有效地监控多管反应体系检测的稳定性和 可靠性。且本发明试剂盒通过设计不同STS的特异性荧光探针，优化组合3管反应体系，实 现一次试验即可检测Y染色体的微缺失类型，并能保证对不同反应体系的有效监控，从而 避免实验过程中的假阴性现象，使用本发明试剂盒，还可以有效地减少操作人员的工作量， 降低污染风险。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明试剂盒第I管正常男性DNA样本检测图；
[0025] 图2为本发明试剂盒第II管正常男性DNA样本检测图；
[0026] 图3为本发明试剂盒第III管正常男性DNA样本检测图；
[0027] 图4为本发明试剂盒第I管AZFc区缺失样本检测图；
[0028] 图5为本发明试剂盒第II管AZFc区缺失样本检测图；
[0029] 图6为本发明试剂盒第III管AZFc区缺失样本检测图。
【具体实施方式】
[0030] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 并配合附图详予说明。
[0031] 本发明最关键的构思在于：在每个PCR反应体系采用同一个内控ZFX/Y进行监测， 并实现一次试验即可检测Y染色体的微缺失类型，方便、快速、结果可靠。 W
[0032] ZFX/Y是位于性染色体上的锌指蛋白基因，在χ、γ染色体上均有其同源序列，该位 点在男性和女性样本中都可以正常扩增。选择ZFX/Y基因作为每个PCR反应体系的内控，可 以同时监控PCR反应体系的扩增效果，避免操作误差造成的假阴性现象。本发明采用多重 多色荧光PCR技术，每个反应体系中多增加1个检测位点，就会增加反应体系的扩增难度， 对整个反应体系的有效扩增产生较大的影响。但本发明通过对ZFX/Y基因引物和探针的设 计、筛选，优化每个反应体系的扩增条件，实现每个PCR反应体系采用同一个内控ZFX/Y进 行监测，确保每个反应体系检测的稳定性和可靠性。
[0033] 实施例1
[0034] 1、技术基础
[0035] 1· 1利用已知的Υ染色体微缺失及STS的研究成果进行多重PCR反应液的设计和 实施。
[0036] 其主要研究内容包括：根据1999版、2004版和2013版EM/EMQN指南的要求和 推荐的STS，设计不同荧光标记的STS检测探针；根据不同区域STS的特点和探针标记基 团，分别设计3管PCR反应体系，每管反应体系用相应的STS扩增引物和探针进行多重荧 光PCR扩增，特异性地检测不同的STS。每管反应体系均用人类锌指蛋白基因 ZFX/Y作为 头验内控，弟I管反应体系问时扩增雄性性别决定基因（Sex-determine Region of Y- Chromosome，SRY)作为性别异常对照。
[0037] 1. 2利用实时荧光PCR仪进行多重荧光PCR扩增的检测
[0038] 实时荧光PCR(real-time PCR，RT-PCR)，是一种以荧光化学染料为发光基团，通过 PCR扩增，以及探针与目的片段的杂交来对整个PCR扩增过程进行实时检测的技术。与传统 的PCR方法相比，实时荧光PCR可以实现高效、快速、实时的自动化检测。
[0039] 将3管PCR反应体系加入模板DNA后，置于实时焚光PCR仪（Applied Biosystems 7500)中，设定PCR反应程序，即可完成对样本的检测和分析。
[0040] 2、具体技术实施方案
[0041] 2. 1 STS和内控的引物、探针设计
[0042] 根据EAA/EMQN指南的要求，选择指南推荐的STS和内控位点，在NCBI (National Center of Biotechnology Information)上查找各个位点的扩增片段和扩增引物序列，根 据引物和扩增片段的位置关系设计相应的Taqman荧光探针序列，由英潍捷基（上海）贸易 有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。通过各 STS的扩增检测，验证引物、探针的扩增特异性。根据EAA/EMQN指南的推荐，本发明试剂和 选择的位点的引物、探针序列见表1。
[0043] 表 1
[0044]
【权利要求】
1. 一种检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液I、PCR反应 液II和PCR反应液III ; 所述PCR反应液I包括： 特异性扩增ZFX/Y位点的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/Y位 点荧光探针，序列如SEQ ID NO :3 ; 特异性扩增Y染色体sY254位点的引物，序列如：SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示； sY254位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :6 ; 特异性扩增Y染色体sY134位点的引物，序列如：SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示； sY134位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :9 ; 特异性扩增Y染色体SRY位点的引物，序列如：SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11所示； SRY位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :12 ; 所述PCR反应液II包括： 特异性扩增ZFX/Y位点的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/Y位 点荧光探针，序列如SEQ ID NO :3 ; 特异性扩增sY84位点的引物，序列如：SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :14所示sY84位点 荧光探针，序列如SEQ ID NO :15 ; 特异性扩增sY127位点的引物，序列如：SEQ ID NO :16和SEQ ID NO :17所示；sY127 位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :18 ; 所述PCR反应液III包括： 特异性扩增ZFX/Y位点的引物，序列如：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；ZFX/Y位 点荧光探针，序列如SEQ ID NO :3 ; 特异性扩增sY255位点的引物，序列如：SEQ ID NO :19和SEQ ID NO :20所示；sY255 位点荧光探针，序列如SEQ ID NO :21 ; 特异性扩增sY86位点的引物，序列如：SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :23所示；sY86位 点荧光探针，序列如SEQ ID NO :24。
2. 根据权利要求1所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述ZFX/Y 位点突光探针5'端标记FAM，3'端标记BHQ ; 所述sY254位点荧光探针5'端标记HEX，3'端标记BHQ1 ; 所述sY134位点荧光探针5'端标记R0X，3'端标记BHQ2 ; 所述SRY位点荧光探针5'端标记CY5, 3'端标记BHQ3 ; 所述sY84位点荧光探针5'端标记HEX，3'端标记BHQ1 ; 所述sY127位点荧光探针5'端标记R0X，3'端标记BHQ2 ; 所述sY255位点荧光探针5'端标记HEX，3'端标记BHQ1 ; 所述sY86位点荧光探针5'端标记R0X，3'端标记BHQ2。
3. 根据权利要求1所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 的每个 PCR 反应液还分别包括：10XPCR Buffer，5XQ Solution，25mM MgCl2,25mM dNTP， 1U/ μ L UNG 酶，HotStart Taq。
4. 根据权利要求3所述的检测人类Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 的每个PCR反应液中每条引物和荧光探针的起始浓度为100 μ M。
【文档编号】C12Q1/68GK104232779SQ201410489611
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】滕乐, 林斯里, 田洁 申请人:亚能生物技术（深圳）有限公司