一株低温脱氮不动杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】一株低温脱氮不动杆菌及其应用，涉及一株不动杆菌及其应用。本发明提供一株不动杆菌，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年9月1日，保藏编号为CGMCC No.9627。本发明不动杆菌bd-01为异养硝化菌，可在低温6℃条件下进行异养硝化反应，将氨态氮转化为硝态氮、亚硝态氮和细胞内物质。能高效、彻底地去除总氨，在低温6℃条件下在48h内对氮的降解率为100％。本发明低温脱氮不动杆菌用于低温环境地区生活污水、农业废弃物和工业废水的脱氮。CGMCC No.96272014.09.01
【专利说明】一株低温脱氮不动杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株不动杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 氮含量是污水水质的重要指标。近年来，随着我国经济的快速发展，城市生活污水 排放量越来越大，氮含量越来越高，高浓度的氮会引起受纳水体氧亏，滋生有害水生生物， 对农业生产和水产养殖带来极大的损失，已经越来越引起人们的关注。废水的脱氮处理有 生物法和物理化学法。但是由于物化法的成本较高，且容易造成二次污染，因此其推广受到 限制。生物脱氮法具有经济、有效、易操作、无二次污染等特点，被公认为具有发展前途的方 法。
[0003] 目前，生物脱氮法包括传统的生物脱氮法和新型的生物脱氮法。传统的生物脱氮 途径包括好氧硝化和厌氧反硝化两个阶段，分别由硝化菌和反硝化菌完成。由于参与的菌 群和工艺运行参数不同，硝化和反硝化两个过程需要在两个隔离的反应器中进行，或者在 时间或空间上造成交替缺氧和好氧环境的同一个反应器中进行。
[0004] 近年来发现了一些异养硝化细菌、好氧反硝化细菌和异养硝化好氧反硝化细菌， 可在同一个反应容器中完成脱氮全过程。所以与传统工艺相比，SND的工艺优势明显，节省 了反应容器体积，缩短了反应时间，操作管理方便，因而逐渐成为目前生物脱氮研究的热点 之一。
[0005] 但是生物脱氮效率受温度的限制，一般的菌株在低温（<10°C )脱氮能力较弱。尤 其是在广大的北方地区，水温常年维持在8-15°C甚至更低，生物处理系统中的微生物的活 性受到了严重的抑制，并且目前关于低温氨氮降解菌的研究极少。因此，在低温条件下进行 生物脱氮已成为北方地区生活污水处理厂实现达标排放的一大难题。
[0006] 生物脱氮这一技术应用前景广阔，具有良好的社会效益，相信会在今后的含氮污 水的处理上被广泛的应用。但是目前国内外多热衷于对脱氮降解菌株的分离、鉴定、培养和 相关功能基因的克隆等研究，而关于脱氮菌株的安全性研究未见报道，而低温降解菌株的 安全性是菌株应用之前的重要因素。它是居民饮用到合格的水，避免水传播疾病的发生，人 们健康的重要保障。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一株不动杆菌（Acinetobacter sp.)，具有低温高效脱氮能力，可以降 解广泛浓度范围的氨态氮，对低温环境下水体的治理和修复具有重要的意义。
[0008] 本发明低温脱氮不动杆菌为不动杆菌（Acinetobacter sp. )bd_01，保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2014年9月1日，保藏编号为CGMCC No. 9627。
[0009] 本发明不动杆菌bd-ΟΙ为革兰氏阴性杆菌，好氧，无芽孢，细胞大小为 1. 5 μ mX 2. 0 μ m ;菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，在LB培养基上菌落呈乳白色略带黄色， 在基本培养基中培养呈白色透明。
[0010] 本发明不动杆菌bd-ΟΙ，氧化酶阴性，接触酶阳性，生长温度范围6?30°C，最适生 长温度15?25°C;生长pH范围4.0?10.0,最适pH为7.0?9.0 ;生长C/N = 1?20,最 适 C/N = 4 ?10。
[0011] 本发明不动杆菌bd-ΟΙ能够在6°C条件下利用有机和无机碳氮源生长。该菌株能 够在LB培养基和NYD培养基中生长。碳源能够利用柠檬酸、柠檬酸盐、葡萄糖、碳酸钠、醋 酸钠、甘油和蔗糖；氮源能够利用硫酸铵、氯化铵、钥酸铵、柠檬酸铵等铵盐。
[0012] 本发明不动杆菌bd-ΟΙ通过16S rDNA序列比对分析，与不动杆菌属 (Acinetobacter sp.)的鲁氏不动杆菌（Acinetobacter Iwoffii)的 16S rDNA 序列同源性 99%。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定不动杆菌bd-ΟΙ属于不动 杆菌属（Acinetobacter sp·)，为鲁氏不动杆菌（Acinetobacter Iwoffii)。
[0013] 本发明不动杆菌bd-o 1能够在6 °C条件下高效水解水中的低中高浓度的NH4+-N，24 小时对低中高浓度的 ΝΗ4+-Ν(0· 36 ?4. 29mg/L、48. 32 ?159. 98mg/L、489. 98 ?951. 09mg/ L)降解率分别为 66. 68 ?70. 24 %、74· 15 % ?52. 72 %、32· 08 % ?19. 20% ;48 小时对 低中高浓度的ΝΗ/-Ν的降解率分别为70. 70%?72. 91 %、82· 43%?92. 82%、44· 98%? 27. 99%。
[0014] 本发明不动杆菌bd-oi为异养硝化菌，可在低温6°C条件下进行异养硝化反应，将 氨态氮转化为硝态氮、亚硝态氮和细胞内物质。并且该菌株适宜的生长条件宽泛，在温度 6?30°C，C/N在2?20, pH在7?9范围内均能生长良好并能高效、彻底地去除总氨，在 低温6 °C条件下在48h内对氮的降解率为100%。
[0015] 本发明不动杆菌bd-ΟΙ为一级无毒性生物菌株，小鼠一次经口 LD5(l>15000mg/ kg(大约相当体重70kg人的致死剂量>1050g)。
[0016] 本发明不动杆菌（Acinetobacter sp. )bd_01，属于不动杆菌属（Acinetobacter sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址是：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年9月1日，保藏编号为CGMCC No. 9627。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明不动杆菌bd-ΟΙ在LB培养基上的菌落照片；图2为本发明不动杆菌 bd-ΟΙ在无机培养液生长的照片；图3为本发明不动杆菌bd-ΟΙ与GenBank中的相近菌株 的16SrDNA序列进行同源性比对所构建的系统进化树。
【具体实施方式】
[0018] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0019] 一：本实施方式低温脱氮不动杆菌为不动杆菌（Acinetobacter sp. )bd-〇l，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址 是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年9月1日，保藏编号为CGMCC No.9627。
[0020] 本实施方式不动杆菌bd-ΟΙ由黑龙江省3月份的松花江水中分离筛选得到。分 离方法按以下步骤进行：取IOOmL江水放入500mL三角瓶中，添加50mg硫酸铵、300mg醋酸 钠和5mL微量元素溶液，于6°C、160r/min富集培养5天，取ImL富集培养液加入含有50mL 基本培养基的三角瓶中，3个平行样，于6°C、160r/min震荡培养3天，将培养液倍比稀释至 1000倍，取100 μ L培养液涂布在基本培养基的固体平板上，将平板放在6°C培养箱中培养 直至长出单菌落，将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到低温氨氮降解菌 株--不动杆菌bd-01。
[0021] 基本培养基配方（IOOOmL):由0. 5g/L硫酸铵、5g/L醋酸钠、50mL微量元素溶液和 950mL水组成，121°C灭菌20min。所述微量元素溶液（g/L):由磷酸氢二钾5g、硫酸镁2. 5g、 氯化钠2. 5g、硫酸铁0. 05g、硫酸锰0. 05g和IL水组成。
[0022] 对菌株进行形态、培养特性和生理生化特性鉴定，具体步骤如下：将低温培养48 小时的菌体进行革兰氏染色后在1000倍显微镜下观察菌体大小和菌体颜色；将菌液倍比 稀释后涂布在基本培养基和有机物培养基（NYD)平板上，观察菌落形态和颜色；将液体菌 液培养4-7天，观察有无色素产生；将菌株进行氧化酶，接触酶，精氨酸双水解酶，葡萄糖和 蔗糖发酵，V.P，M. R和明胶液化试验。结果该菌株为革兰氏阴性杆菌，好氧，无芽孢，细胞大 小为1. 5 μ mX 2. 0 μ m ;菌落圆形，表面光滑，边缘整齐，在LB培养基上菌落呈乳白色略带黄 色（如图1)，在基本培养基中培养呈白色透明（如图2)。氧化酶阴性，接触酶阳性，精氨酸 双水解酶阳性，利用葡萄糖和蔗糖，V. P阴性，M. R阴性，明胶液化，生长温度范围6-30°C，最 适生长温度15-25°C。
[0023] 对菌株进行16S rDNA序列分析：取ImL菌液离心收集菌体，加入100 μ L无菌水， 悬浮后煮沸l〇min，离心后收集上清液获得总DNA，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩 ±曾，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小在1500bp处的单一 DNA条带进行测序，结果 得到1388bp DNA序列，在GenBank中进行同源序列比对，用Mega 4. 0软件构建系统发育 树（如图3)，结果与不动杆菌属（Acinetobacter sp.)的鲁氏不动杆菌（Acinetobacter Iwoffii)的16S rDNA序列同源性99%，结合形态、培养特性和生理生化特性，鉴定为鲁氏不 动杆菌（Acinetobacter Iwoffii)。
【具体实施方式】 [0024] 二：本实施方式不动杆菌（Acinetobacter sp. )bd_01用于低温环 境地区生活污水、农业废弃物和工业废水的脱氮，所述低温为6°C。
[0025] 本实施方式不动杆菌bd-01具有低温（6°C )高效脱氮能力，可以降解广泛浓度范 围的氨态氮（〇.50mg/L-951.09mg/L)，可应用于低温环境地区生活污水、农业废弃物和工 业废水等水体的脱氮，对低温环境下水体的治理和修复具有重要的意义。
[0026] 为验证本发明不动杆菌bd-ΟΙ的效果，进行以下实验：
[0027] -、低温脱氮不动杆菌的培养条件。将菌液以相同的接菌量接种于基本培养基中， 分别在6°C、8°C、KTC、15°C、20°C、25°C、30°C，160r/min震荡培养2天，用分光光度计测定 菌浊度（〇D 6J。结果见表1，6-30°C菌体均能生长，15°C、20°C和25°C菌体生长最快，6°C、 8°C、10°C和30°C菌体生长较快，48h内氮的降解率均达到100%。
[0028] 表1菌株在不同温度下的生长情况
[0029]
【权利要求】
1. 一株低温脱氮不动杆菌，其特征在于该菌株为不动杆菌（Acinetobacter sp.) bd-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年9月1日，保藏编号为CGMCC No. 9627。
2. 权利要求1所述低温脱氮不动杆菌用于低温环境地区生活污水、农业废弃物和工业 废水的脱氮，所述低温为6°C。
【文档编号】C12N1/20GK104263686SQ201410513118
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】姜威, 张淑梅, 李晶, 陈静宇, 孟利强, 胡基华, 曹旭, 刘宇帅 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所