一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用。本发明提供了一株宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)HL，其保藏编号为CGMCC No.9534。本发明的实验证明，本发明的真菌HL，氨氮的去除效果良好，无亚硝酸盐氮积累，有及少量的硝酸盐氮积累；能有效控制粪便氨气的挥发，抑制率最高可达到79％，表现出了较高的应用潜力。
CGMCC No.9534
2014.08.21
【专利说明】一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，具体涉及一株具有氨氮降解能力的真菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前，集约化的规模养殖已使改善畜禽场的环境成为一个紧迫的问题。畜禽生产 和粪便储存过程中会产生了大量的恶臭物质，对人和动物的健康产生严重威胁，这些成分 复杂的恶臭气体中，以氨气的危害最为突出。已有研究证明，大量的氨气挥发直接危害到动 物和人类的健康，影响可入肺颗粒物（PM2. 5)的形成，扩散到大气中与一些酸性物质反应， 形成铵盐气溶胶，导致生态系统富营养化和酸化（NRC，2003)。
[0003] 有调查研究显示，在养殖业密集地区，将近70 %的氨挥发来自于农业生产。因此， 抑制畜禽粪便中氨气的挥发显得尤为重要。
[0004] 氨气的产生是由于粪便铵态氮的挥发造成的，因此可通过降低粪便中铵态氮的含 量达到控制粪便氨气的挥发的目的，而具有硝化功能的微生物在此过程中发挥着至关重要 的作用。近年来，有关异养型硝化微生物的报道较多，与自养型硝化细菌相比，异养型硝化 细菌在自然界的分布更为广泛，包括真菌、放线菌和细菌，甚至一些藻类，其中真菌是数量 最大效率最高的异养硝化微生物，在氨氮降解中发挥着重要的功能。目前实验室研究中 多以具有硝化功能的细菌为主，如 Rhodococcus sp，Acinetobacter sp.，Bacillus sp.， Pseudomonas sp. , Alcaligenes faecalis 等。
[0005] 近些年的研究报告指出真菌在氨氮氧化中发挥着重要作用，显示了完全降解氨氮 的潜能，并且对粪便中的挥发性脂肪酸等有害物质的耐受性强。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一株宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)HL。
[0007] 本发明提供的宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)HL，其保藏编号为CGMCC No.9534。
[0008] 上述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在 降解待测样品中氨氮的应用也是本发明保护的范围；
[0009] 或上述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物 在制备降解待测样品中氨氮的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0010] 上述应用中，所述待测样品为水或粪便，所述氨氮为硫酸铵。
[0011] 上述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在抑制 粪便中氨气挥发中的应用也是本发明保护的范围；
[0012] 或上述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制 备抑制粪便中氨气挥发产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0013] 上述应用中，所述粪便为畜禽粪便，具体为鸡。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种降解氨氮的方法。
[0015] 本发明提供的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的宛氏拟青霉HL的菌丝悬 浊液接种在含有氨氮的样品和/或产品中，培养，实现降解氨氮。
[0016] 上述方法中，
[0017] 上述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1 %的量接种在所述含有 氨氮的样品和/或产品；
[0018] 所述含有氣氣的样品和/或广品为水，
[0019] 具体为模拟废水，氨氮初始浓度50mg/l模拟废水配方如下：葡萄糖1. 25g， (NH4)2S040. 25g，NaCl 1. 0g，K2HP04 ? 2H200. 5g，MgS04 ? 7H200. 25g，微量元素溶液 1. 0ml，7jc 1000mL，调pH7. 2-7. 4,其中氨氮含量约为50mg/L，通过改变葡萄糖和硫酸铵的量，维持C/N 为10,调整溶液中氨氮的含量。
[0020] 所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为浊度400NTU。
[0021] 上述方法中，所述培养为37°C，140r/min摇床培养。
[0022] 本发明第三个目的是提供一种抑制粪便中氨气挥发的方法。
[0023] 本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液接种在 粪便中，混匀后静置，实现抑制粪便中氨气挥发。
[0024] 上述方法中，所述粪便为畜禽粪便；
[0025] 所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1%的量接种在所述粪便 中；
[0026] 所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为400NTU。
[0027] 所述静置时间为l-4d。
[0028] 拟青霉HL于2014年8月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号CGMCC No. 9534， 分类命名为宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)。
[0029] 本发明的实验证明，本发明提供了宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)HL，其氨 氮降解能力测定结果表明，氨氮的去除效果良好，无亚硝酸盐氮积累，有及少量的硝酸盐氮 积累；能有效控制粪便氨气的挥发，抑制率最高可达到79%，表现出了较高的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为具有氨氮降解能力的真菌HL菌落图片。
[0031] 图2为真菌HL的氨氮降解效率图。
[0032] 图3为不同初始氨氮浓度对菌HL降解率的影响
[0033] 图4为pH对氨氮降解率的影响
[0034] 图5为温度对氨氮降解率的影响
[0035] 图6为转速对氨氮降解率的影响
[0036] 图7为不同碳源对氨氮降解率的影响
[0037] 图8为不同C/N比对氨氮降解率的影响
[0038] 图9为菌株HL对粪便氨气的抑制效果
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041] 富集培养基：葡萄糖 10. 0g，（NH4)2S042. 0g，NaCl 1. 0g，MgS04 ? 7H201. 0g， K2HP04 ? 2H201. 0g，FeS04 ? 7H200. 4g，微量元素溶液 1. 0ml，水 1000mL，调 pH7. 2-7. 4。
[0042] 分离培养基：葡萄糖 10. 0g，（NH4)2S042. 0g，NaCl 1. 0g，MgS04 ? 7H201. 0g， K2HP04 ? 2H201. Og，微量元素溶液 1. 0ml，琼脂 20. Og，水 lOOOmL，调 pH7. 2-7. 4。
[0043] 氨氮初始浓度 50mg/l 模拟废水：葡萄糖 1. 25g，（NH4)2S040. 25g，NaCl 1. Og， K2HP04 ? 2H200. 5g，MgS04 ? 7H200. 25g，微量元素溶液 1. 0ml，水 lOOOmL，调 pH7. 2-7. 4,其中 氨氮含量约为50mg/L，通过改变葡萄糖和硫酸铵的量，维持C/N(碳氮质量比）为10,调整 溶液中氨氮的含量。
[0044] 微量元素溶液：EDTA 10. 0g，ZnS04l. 2g，CaCl2l. 5g，MnCl2 ? 4H20 1. 0g， FeS04 ? H202. 0g，（NH4)6M〇7024 ? 4H20 1. 0g，CuS04 ? 5H20 lg，CoCl2 ? 6H20 1. 0g，水 1L， PH7. 2-7. 4。
[0045] PDA培养基：PDA培养基：取新鲜马铃薯，去皮后称取200g，加入lOOOmL水，煮沸 20min后，用4层纱布过滤，清液中加入20g葡萄糖，煮沸，补足失水。
[0046] 查氏培养基：葡萄糖2(^，卩65040 . 018，]\%504.71120 0.58，1((：10.58，似勵32.(^，琼 脂 20g，K2HP041. 0g，再加入蒸馏水 1000mL。
[0047] 实施例1、氨氮降解菌HL的分离纯化及鉴定
[0048] 1、HL的分离纯化
[0049] 采集常温保存3天的鸡粪样品20g接种于装有100ml生理盐水的锥形瓶中，震荡 30min，静置10min，取上清液lml接种于100ml的富集培养基中，37°C 140r/min培养2天 后，再次取lml培养液接种于新的富集培养基中，如此反复10代。取富集10代后的培养液 lml，经10- 1梯度稀释后，取200ul涂布于分离平板上，于37°C培养24?72h，24h后开始观 察菌的生长情况，选取生长快、菌落大、数量多的菌落采用三线法进行纯化。将纯化后的单 囷落接种到I旲拟废水中，24h后测定氣氣含量，选取氣氣降解率最_的囷株，作为实验囷株， 命名为HL。
[0050] 2、形态观察
[0051] 在PDA培养基上，HL菌株生长迅速，37°C培养3天，直径4-5cm，无固定大小，可延 至整个培养基。菌落呈毯状，较致密，初为淡黄色，后期中间呈土黄色，四周为淡黄色。菌丝 分隔，透明，光滑，培养基背面呈淡黄色，培养基颜色不改变。分生孢子梗光滑，瓶梗基部膨 大，向上形成一细的长颈，分生孢子成熟后表面呈粉末状，干燥，单孢，形成离散型链状，单 个孢子多为椭圆形，淡黄色（图1)。
[0052] 3、分子生物学鉴定
[0053] 从分离平板上挑取单克隆HL，接种于PDA培养基中，在37 °C，140rmp条 件下震荡24h，离心，收集菌体，提取总DNA。以菌株HL的总DNA作为模板，以 NS1(5' GTAGTCATATGCTTGTCTC3'）与 NS8(5' TCCG2CAGGITCACCTACGGA3'）为引物进行 18S rDNA的扩增。得长度为1800bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物的核苷酸序列为序列表 中序列1，将该序列进行blast比对分析，发现菌株HL与Paecilomyces variotii的相似度 最_，为99%。
[0054] 综合菌株形态特征和18SrDNA序列，鉴定HL为宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)〇
[0055] 拟青霉HL于2014年8月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号CGMCC No. 9534， 分类命名为宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)。
[0056] 实施例2、宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)HL的降解氨氮功能研究
[0057] -、菌株HL降解氨氮研究
[0058] 菌丝悬浊液：挑取实施例1获得的真菌HL的单菌落接种于PDA液体培养基进行活 化。48h后将培养液用灭过菌的4层纱布过滤，得到的菌体，用无菌生理盐水冲洗2次，之后 将转移到手动匀浆器中，加无菌去离子水进行轻微匀浆，制成均匀的菌丝悬浊液（浊度为 400NTU(浊度单位）），备用。
[0059] 向模拟废水中（C/N比为10,葡萄糖和硫酸铵分别为唯一碳源）中接种体积百分含 量为1%的上述菌丝悬浊液，37°C，140r/min摇床培养，分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24h 采集培养液，测定各个时间段内氨氮、硝态氮以及亚硝态氮的含量。
[0060] 氨氮的测定方法采用水杨酸-次氯酸盐光度法（GB7481-87)。硝酸盐氮测定采用 酚二磺酸分光光度法（GB7480-87)。亚硝酸盐氮采用N-(l-萘基）-乙二胺分光光度法（GB 7493-87)。菌丝悬浊液浊度采用散射法一福尔马肼标准（生活饮用水检验方法感官性状和 物理指标（GB/T 5750. 4-2006)。
[0061] 结果如图2所示，可以看出，菌体细胞进入新的培养体系后出现一段适应期，此时 培养液中氨氮的浓度下降的较为缓慢，12h后开始快速下降，到21h以后再次呈现缓慢降低 趋势，经24h培养，NH4+-N浓度由初始的51. 06mg/l，下降到1. 33mg/l，去除率为97. 39%。 整个降解过程中未检测到亚硝酸盐积累，硝态氮稍有积累，24h的积累浓度为0. 26mg/L，整 体呈现先生高后下降的趋势
[0062] 二、不同初始氨氮浓度对菌株HL降解氨氮的影响
[0063] 氨氮初始浓度10mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄糖 浓度替换成〇? 25g/l、（NH4)2S04浓度替换成0? 05g/l;
[0064] 氨氮初始浓度100mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄 糖浓度替换成2. 5g/l、（NH4)2S04浓度替换成0. 5g/l;
[0065] 氨氮初始浓度160mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄 糖浓度替换成4. 0g/l、（NH4)2S04浓度替换成0? 8g/l;
[0066] 氨氮初始浓度200mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄 糖浓度替换成5. 0g/l、（NH4)2S04浓度替换成1. 0g/l;
[0067] 氨氮初始浓度400mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄 糖浓度替换成10. 〇g/l、（NH4)2S04浓度替换成2. 0g/l;
[0068] 氨氮初始浓度600mg/l模拟废水为仅将氨氮初始浓度50mg/l模拟废水中的葡萄 糖浓度替换成15. 0g/l、（NH4)2S04浓度替换成3. 0g/l。
[0069] 将菌丝悬浊液按1%的体积比接种到氨氮初始浓度分别为10、50、100、160、200、 400、600mg/l模拟废水中进行培养，在培养后的24、36h采集培养液，测定氨氮浓度。
[0070] 结果如图3,在C/N比为10,硫酸铵为唯一氮源的培养体系中，接种1%的HL菌丝 悬浊液，氨氮的最终去除率如表一所示；从图3(a)中可以看出，在营养水平较低的环境下 "浓度〈20〇11^/1),当氨氮浓度小于5〇11^/1时,2411内氨氮的去除率可达到95%以上，随着 氨氮浓度的增加，氨氮的降解率开始下降，24h内的降解率保持在60%以上；从图3 (b)中可 以看出，在营养水平较高的环境下（N浓度> 200mg/l)，氨氮浓度在前48h内快速下降，之后 下降速度极为缓慢，无法完全降解，可能是由于代谢产物积累积累过多、营养物质匮乏以及 菌体开始进入衰亡期等因素造成的。
[0071] Zhang等，研究氨氮初始浓度对Bacillus methylotrophicus L7降解能力的影响， 结果显示氨氮的去除效率随着氨氮浓度的增加而增加，初始浓度为78. 75mg/L、427. 44mg/ L、1121. 24mg/L的去除速率分别为11. 08,41. 22,90. 95mg/d，但最终降解率偏低，分别为 63. 33%、46. 43%、36. 50%。Taylor 等分离出一株 Providencia rettgeri YL，研究表明， 氨氮浓度为40和180mg/l时，去除率分别为98%和100%，该菌对氨氮浓度的最大耐受力 为300mg/L。Chen等研究一株红球菌CPZ24,在氨氮浓度为50mg/L时，20h的去除率可达到 100%。本研究中所用的真菌HL，表现出了较高的氨氮耐受性，并且去除率始终在65%以 上，但需要进一步优化培养条件，以达到氨氮的完全去除的目的。
[0072] 三、培养条件对菌株HL氨氮降解特性的影响
[0073] 设计单因素方差实验，研究不同培养条件下（包括温度、pH、C/N、转速、碳源），菌 株HL的氨氮降解特性。
[0074]温度：温度设定为 20、25、30、37、42°C，pH 为 7, C/N 为 10,140r/min 培养。
[0075] pH :用 lmol/L 的 HC1 或 NaOH 将培养基的 pH 分别调至 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0， C/N 为 10,温度 37°C，140r/min 培养。
[0076] C/N:氮源为硫酸铵，用葡萄糖将C/N比分别调整为5,10,15, 20, pH为7,温度为 37°C，140r/min 培养。
[0077]转速：设定为40、70、120、150、180、2001'/1^11邛11为7，温度为371：培养。
[0078] 碳源：氨氮初始浓度为50mg/L，C/N为10,分别向培养基中加入葡萄糖、蔗糖、淀 粉、乙酸钠、朽 1檬酸钠、甘露醇、麦芽糖作为唯一碳源，其添加量分别为1. 25,1. 18,1. 125， 1. 71，1. 572，1. 26，1. 187g/l，pH 为 7,温度为 37°C，140r/min 培养。
[0079] 上述处理组均培养24h后，采集培养液测定氨氮浓度。
[0080] 如图4所示，在pH小于7条件下，菌株HL的氨氮降解率都在88%以上，表明菌株 HL对pH的要求不严格，在酸性和中性的条件下能够很好的降解氨氮。
[0081] 从图5可以看出，培养温度为25、30、37°C时，氨氮的降解率均保持较高水平，20°C 时，氨氮的降解率明显下降，当经过一段时间后，降解率于37°C并无区别，说明较低的温度 仅仅延迟了菌株HL的降解时间，但并不影响最终的降解结果。菌株HL对环境温度和pH要 求不严格，有很强的适应能力，因此，菌株HL在实际应用中具有一定的应用潜力。
[0082] 研究转速对菌株HL氨氮降解率的影响，结果如图6所示，40- 150r/min范围内， 随着震荡速度的增加，氨氮的去除率逐渐增加，但转速从150r/min增至200r/min时，氨氮 的去除率出现下降趋势。
[0083] 在C/N比为10的培养基中，研究不同碳源对菌株HL氨氮降解率的影响，结果表明 (见图7)，不同的碳源对菌株利用氨氮的能力影响很大，细胞优先利用葡萄糖和麦芽糖进 行生长代谢和氨氮氧化，其次是淀粉、蔗糖和乙酸钠，对甘露醇的利用率非常低，几乎不能 利用柠檬酸钠。
[0084]图8所示，C/N比为10、20、40，氨氮在2411内的降解率均达到90%以上，只有在才 C/N比为5时，氨氮的降解率才明显低于其他各组。
[0085]从上述可以看出，废水中比大于等于10、C源为葡萄糖或麦芽糖，且菌株培养转速 为120-150r/min、培养温度为25、30、37°C时，降解效果最佳。
[0086]实施例3、菌株HL在抑制粪便氨气挥发中应用
[0087]菌株HL在实验室条件下，能够很好降解培养基中的氨氮，但实际应用当中，环境 极其复杂、影响因素众多，该菌能够在实际粪便中发挥主导作用，以及对粪便的耐受程度， 直接关系到其应用前景。为此，在实验室的条件下，就该菌株对粪便氨气抑制效果进行了验 证。
[0088] 称取鸡新鲜粪样100g放入1L烧杯中，将实施例1培养得到的HL菌丝悬浮液按体 积百分含量5%的接种量与烧杯中的粪便样品充分混匀，以10ml无菌水作为空白对照，以 0.01mol/L硫酸溶液作为氨气吸收液，在每个烧杯中放入装有20ml的吸收液的小烧杯。将 大烧杯用6层保鲜膜密封，于室温下分别放置l、2、3、4d，随后测定氨气的发散量。实验设3 个重复。
[0089]结果如图9所示，与对照组相比，接种5%菌液的实验组在粪便堆放期间能够有效 抑制粪便氨气的散发量（菌体利用氨氮生长，同时抑制氨气产生），抑制率最高可达79%， 并且随着接种时间的增加，粪便氨气抑制率呈现升高趋势，表明菌株HL对外界复杂环境有 良好的适应性，易于发挥优势作用。
【权利要求】
1. 一株宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii)HL，其保藏编号为 CGMCC No. 9534。
2. 权利要求1所述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代 谢产物在降解待测样品中氨氮的应用； 或权利要求1所述的宛氏拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代 谢产物在制备降解待测样品中氨氮的产品中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述待测样品为水或粪便，所述氨氮为硫 酸铵。
4. 权利要求1所述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产 物在抑制粪便中氨气挥发中的应用； 或权利要求1所述的拟青霉HL和/或其菌丝悬浊液和/或其发酵液和/或其代谢产 物在制备抑制奠便中氣气挥发广品中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述粪便为畜禽粪便。
6. -种降解氨氮的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的宛氏拟青霉HL的菌丝悬 浊液接种在含有氨氮的样品和/或产品中，培养，实现降解氨氮。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1 %的量接种在所述含有氨氮 的样品和/或产品； 所述含有氨氮的样品和/或产品为水； 所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为浊度400NTU。
8. -种抑制粪便中氨气挥发的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的宛氏拟青霉 HL的菌丝悬浊液接种在粪便中，混匀后静置，实现抑制粪便中氨气挥发。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述粪便为畜禽粪便； 所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液按照体积百分含量为1 %的量接种在所述粪便中； 所述宛氏拟青霉HL的菌丝悬浊液的浊度为浊度400NTU。
【文档编号】C12N1/14GK104328055SQ201410514960
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】刘国华, 刘志云, 石鹏君, 郑爱娟 申请人:中国农业科学院饲料研究所