一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用。本发明通过应用tol2-gateway技术，在获得成骨细胞特异性转录因子的启动子后，构建出骨骼报告绿色荧光的转基因斑马鱼，并用该品系斑马鱼建造糖皮质激素诱导的骨质疏松斑马鱼模型，同时应用壮骨补肾中药淫羊藿总黄酮对其进行评估。采用本发明的方法构建的骨质疏松模型方便、可行、有效，与传统的化学染色方法相比更加稳定、省时、高效，适合抗骨质疏松药物的高通量筛选。
【专利说明】一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002]骨质疏松症(Osteoporosis，0P)是以骨量减少、骨的微观结构退化和骨折危险为特征的一类疾病。其引起的危害逐渐受到人们的关注，积极开发防治骨质疏松药物也慢慢成为医学界活跃的领域之一。对于药物的研发，实验模型显得尤为重要。细胞模型，其作用环节单一，难以体现药物整体观，也无法评估药物在体情况；传统的动物如小鼠等作为药物筛选模型因费用高，造模时间长，无法对其在体观察和定位等缺陷，局限了药物高通量筛选的应用。
[0003]斑马鱼，一种热带鲤科鱼。由于它具有体积小，繁殖周期快、胚胎透明、骨骼发育迅速、与人类相关基因和信号通路有高度同源性等特点，而逐渐被应用于骨骼疾病模型的研究。临床上，经常或大量使用糖皮质激素治疗的病人会出现骨质疏松副作用，小鼠等动物应用糖皮质激素也可导致骨质疏松。从鱼类到哺乳动物，糖皮质激素系统具有高度的保守性，因此，糖皮质激素也被应用于斑马鱼骨质疏松模型的建立。骨骼染色是对骨骼最基本的研究方法，传统的染色试剂有韩黄绿素(calcein),槲皮素(quercetin)和菌素红(Alizarinred)等。其中，茜素红染色主要是与钙离子形成螯合物，是目前研究斑马鱼骨矿化情况的主要方法。但该方法存在实验步骤繁琐，花费时间长，染色效果不稳定等缺陷。
[0004]转基因技术是近年来应用于斑马鱼进行疾病模型或基因分子水平研究的新方法。传统转基因斑马鱼技术是通过显微注射将外源DNA如报告基因GFP(green fluorescentprotein)或(RFP, red fluorescent protein)注射到受精卵中，以便其整合到斑马鱼基因组中并在特定组织和器官中表达。这种方法存在转基因效率低，并且亲代遗传率也低的缺点。
【发明内容】
[0005]为了解决以上问题,本发明通过应用tol2_gateway技术(它利用Tol2转座子特性，在构建组织特异性启动子带报告基因如GFP或RFP的表达载体后，将该质粒和体外合成的相应转座酶mRNA共注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中。基于转座子的特性，便可形成高效的基因转移和遗传，大大提高了初代注射成功率及传代稳定性。)构建了骨骼报告绿色荧光的转基因斑马鱼，并用该品系斑马鱼构建了糖皮质激素诱导的骨质疏松斑马鱼模型，进而将该模型应用于抗骨质疏松药物的高通量筛选中。
[0006]因此，本发明的目的在于提供一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其包括以下步骤:
[0007]1、斑马鱼的繁殖；
[0008]2、转基因斑马鱼的构建；
[0009]3、采用药物对转基因斑马鱼进行造模；
[0010]其中，在步骤2所述的转基因斑马鱼的构建过程中，应用tol2-gateway转基因技术分别构建质粒 5’Entry clone:p5E_0sterix, Middle Entry clone:pME-nIs EGFP 和3’Entry clone:p3E-Poly A,并将上述质粒进行三片段LR反应,获得表达质粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA,最后将所述表达质粒与Tol2mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎细胞中。
[0011]在本发明优选的实施方案中，步骤2中所述的表达质粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA 的结构如附图1 所不。
[0012]在本发明优选的实施方案中，步骤3中所采用的药物为地塞米松DEX，其最佳浓度为 10 μ M。
[0013]在本发明的技术方案中，还进一步包括对骨质疏松斑马鱼模型进行评估验证的步骤。
[0014]在本发明优选的实施方案中，所述的评估验证包括药物评估验证、骨矿化定量分析、行为学分析和骨相关因子水平变化监测。
[0015]在本发明进一步优选的实施方案中，药物评估验证所采用的药物分别为地塞米松DEX和淫羊藿黄酮FE，其中淫羊藿黄酮FE的最佳拯救浓度为I μ g/ml。
[0016]本发明再一方面还提供了本发明所述的骨质疏松斑马鱼模型在筛选抗骨质疏松药物中的应用。
[0017]在本发明优选的实施方案中，所述药物分别为骨吸收抑制剂类药物、骨形成促进类药物、骨矿化促进类药物以及中药类药物。
[0018]在本发明进一步优选的实施方案中，所述的骨吸收抑制剂类药物为双膦酸盐、降钙素、雌激素、雌激素受体调节剂和依普黄酮，骨形成促进类药物为氟制剂、甲状旁腺激素制剂、活性维生素D制剂，骨矿化促进类药物为钙剂、维生素D及其活性代谢物。
[0019]在本发明进一步优选的实施方案中，所述的中药类药物为淫羊藿、熟地、杜仲、丹参、黄芪和蛇床子。
[0020]本发明通过应用tol2_gateway技术,在获得成骨细胞特异性转录因子(Osterix)的启动子后，构建出骨骼报告绿色荧光的转基因斑马鱼，并用该品系斑马鱼建造糖皮质激素诱导的骨质疏松斑马鱼模型，同时应用壮骨补肾中药淫羊藿总黄酮来进行评估，结果证明该方法构建的模型方便、可行、有效，与传统的骨骼固定染色方法相比更加稳定、省时、高效，适合抗骨质疏松药物的高通量筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1 为表达质粒 pDestTol2CG2_osterix-nls-EGFP-pA 的结构不意图。
[0022]图2为构建骨骼带绿色荧光标记转基因斑马鱼发育变化示意图。
[0023]图3为不同剂量地塞米松DEX诱导斑马鱼骨质疏松导致骨量丢失示意图。
[0024]a:茜素红染色骨量丢失情况示意图；
[0025]b:荧光显示骨量丢失情况示意图；
[0026]c:放大显示b图DMSO组长方形方框成骨细胞示意图；
[0027]d:放大b图10 μ M DEX组长方形方框成骨细胞减少示意图。
[0028]图4为对图3中两种方法图片骨矿化情况进行量化示意图。
[0029]a:菌素红染色面积量化示意图；
[0030]b:突光面积量化不意图；
[0031]c:荧光积分光密度1D量化示意图。
[0032]图5为不同剂量地塞米松DEX处理后,斑马鱼行为学分析示意图。
[0033]a:斑马鱼游泳路线示意图；
[0034]b:游泳路线量化示意图。
[0035]图6淫羊藿总黄酮FE对两种方法的斑马鱼骨质疏松防治效果示意图。
[0036]a:FE对野生型斑马鱼骨质疏松骨量丢失防治作用示意图；
[0037]b:FE对荧光斑马鱼骨质疏松骨量丢失防治作用示意图；
[0038]图7为淫羊藿总黄酮FE对两种方法的斑马鱼骨质疏松防治效果进行量化示意图。
[0039]a:茜素红染色面积量化示意图；
[0040]b:突光面积量化示意图；
[0041]c:荧光积分光密度1D量化示意图。
[0042]图8为淫羊藿总黄酮FE对斑马鱼骨质疏松防治效果行为学分析示意图。
[0043]a:FE对斑马鱼游泳能力影响示意图；
[0044]b:游泳路线量化示意图。
[0045]图9为骨相关因子水平变化情况示意图。
【具体实施方式】
[0046]下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0047]实施例1斑马鱼的繁殖
[0048]斑马鱼(广东医学院附属医院斑马鱼模式动物平台提供)喂养于专门的鱼缸中，控制日照周期(光照14小时，黑夜10小时)。前一天傍晚将雄鱼与雌鱼(1:2)放于繁殖缸中，第二天收集受精卵，置于培养皿中，同时加入胚胎水(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mMCaCl2, 0.33mM MgSO4)，28.5°C恒温培养箱中培养。斑马鱼胚胎一般7天内不用喂食。
[0049]实施例2转基因斑马鱼的构建
[0050]一、实验方法
[0051]应用tol2_gateway 转基因技术构建质粒 5’ Entry clone:p5E-0sterix, MiddleEntry clone:pME-nIs EGFP 和 3’Entry clone:p3E-Poly A。将上述三个质粒进行三片段LR 反应,获得表达质粒 pDestTol2CG2-osterix-nls_EGFP-pA。
[0052]早上，收集受精卵胚胎后，将其固定于放有琼脂凝胶的平皿中，把表达质粒pDestTol2CG2-osterix-nls_EGFP-pA 与 Tol2mRNA 混合(最终浓度为 50ng/ μ I),显微注射入一个细胞期的斑马鱼胚胎细胞中。隔天，荧光显微镜下进行筛选报告绿色荧光的鱼，培养至成鱼为H)代。之后用H)代与野生型杂交得Fl代，如此循环，F3代开始用于实验。
[0053]二、实验结论
[0054]表达质粒pDestTol2CG2-osterix_nls EGFP-pA示意图如附图1所示,将表达质粒与Tol2mRNA —起混合，注射入一个细胞期的斑马鱼胚胎细胞中，由于有Tol2跳跃基因的帮助，会大大提高初代注射转基因的成功率，随后进行筛选，便可得到骨骼报告绿色荧光的转基因斑马鱼，具体参见附图2。最初，可发现绿色荧光出现在头部和环绕身体尾鳍部分(第I天)，之后头部荧光明显增加(第8天)，到中期，荧光会在脊椎及鳍中表现(第15天)，后期荧光覆盖整个身体的骨骼(第30天)，甚至鳞片(第42天)。这样骨骼有荧光标记的斑马鱼对于骨骼的发育与骨骼疾病的研究相当直观，也相当方便。
[0055]实施例3不同剂量DEX对野生型与转基因斑马鱼骨骼的影响(Glucocorticoid-1nduced osteoporosis, G1P 模型的构建)
[0056]一、实验方法
[0057]1、骨质疏松模型的设计
[0058]取受精后3天的野生型与转基因斑马鱼胚胎放入盛有胚胎水(野生型需加入PTU，N-Phenylth1urea用来抑制色素形成，以免影响染色结果)的12孔培养板中，每孔放6_8条幼鱼，实验分DMSO阴性对照组和地塞米松DEX (Dexamethasone，MP公司)模型组。地塞米松模型组设5，10，20μΜ三个浓度以便选取最佳的造模浓度。实验最少重复3次以上，保证科学性和可靠性。每孔加入2mL (含溶媒或是药物)的胚胎水，28.5°C恒温培养箱中培养。每天进行半量换液，连续培养5天，结束实验。
[0059]2、骨矿化定量分析
[0060]实验结束，将斑马鱼置于MS-222 (sigma)中麻醉致死，去除MS-222麻醉剂，PBS清洗一遍，后将幼鱼固定于4%多聚甲醛中。野生型斑马鱼用茜素红(Alizarin red，MP)对其进行染色。转基因斑马鱼直接用I %低熔点琼脂糖凝胶固定于共聚焦玻底皿中，于激光共聚焦显微镜扫描3D荧光图片。
[0061]3、行为学分析
[0062]实验结束当天，在实施例三和四实验的各分组中随机挑出I条斑马鱼放于6孔板中，观察其游泳能力。实验前，先把斑马鱼静置15-30分钟，让其安静、稳定，后放入Noldus (Holland)行为学分析系统观察箱中进行5分钟的游泳能力行为学观察，包括I分钟准备，2次I分钟光照和I分钟黑暗，同时应用Ethovis1n XT (VIS1N 11)软件对实验过程进行监测和数据处理。其中6孔板中每孔直径设置为5cm。
[0063]4、数据处理与统计学计算
[0064]茜素红染色的斑马鱼用体视显微镜(Leica)对其捕获采集图像，转基因斑马鱼则采用激光共聚焦显微镜扫描3D荧光图片，所有的图像均统一采用相同拍摄参数包括，体位、放大倍数、光强度、吸收度和曝光设置等，以确保可比性。然后采用图像分析软件ImagePro Plus 6.0分别计算染色面积和荧光面积及荧光积分光密度。数值用平均值土标准偏差表示。统计学分析采用Excel软件(Microsoft Office)中的双尾t检验，P〈0.05认为组间差异有统计学意义。
[0065]二、实验结论
[0066]显微成像表明，茜素红染色与荧光转基因斑马鱼结果基本一致，与阴性对照组相t匕，5、10和20 μ M的DEX模型组茜素红染色面积及荧光面积明显减少，具体参见附图3中a, b 图。
[0067]应用IPP6图像软件对DEX诱导斑马鱼骨丢失程度进行量化，具体参见附图4。5 μ MDEX组的斑马鱼骨骼矿化量与阴性对照组相比，差异具有统计学意义(P〈0.05)，当剂量增加至10、20μΜ时，差异也具有统计学意义(Ρ〈0.01)。说明DEX对斑马鱼骨矿化程度影响呈浓度依赖性，浓度越高矿化面积减少越明显；这在茜素红染色和转基因斑马鱼是一致，具体参见附图4中a，b图。但对于转基因斑马鱼，荧光1D在一定程度上还可以代表斑马鱼骨矿化(骨密度)程度的变化。从附图4中c图数据可以看出，DEX对1D的影响也呈浓度依赖性，DEX作用浓度越高骨密度减少越明显(P〈0.05)。另外，转基因斑马鱼的另一个优势是，它还能清楚直接观察到骨细胞等的变化，参见附图3中c与d图。(η = 5-6)
[0068]行为学游泳实验表明，具体参见附图5a。相对于DMSO组，DEX 3个浓度组斑马鱼的游泳能力明显下降，也呈剂量依赖性。数据统计分析见附图5b，与阴性对照组相比5 μ M DEX组的斑马鱼游泳能力明显减弱，差异具有统计学意义(Ρ〈0.05)，当剂量增加至10、20 μ M时，差异也具有统计学意义，且更加明显(Ρ〈0.01)。(η = 5)
[0069]以上说明，DEX既能引起斑马鱼的骨量丢失，还减少斑马鱼的游泳活动能力，能成功诱导斑马鱼造成骨质疏松。下述的所有实验中我们选取10 μ M的DEX作为造模浓度。
[0070]实施例4淫羊藿总黄酮对斑马鱼骨质疏松的防治作用
[0071]一、实验方法
[0072]1、药物对模型评估验证的设计
[0073]取受精后3天的野生型与转基因斑马鱼胚胎放入盛有胚胎水(野生型加入PTU)的12孔培养板中，每孔放6-8条幼鱼，分DMSO阴性对照组、地塞米松造模组和地塞米松造模组 + 淫羊藿黄酮 FE (Flavonoids derived from Epimedium,纯度 >90% )药物组，同样 FE设1，0.5,0.1 μ g/ml三个浓度以便选取最佳药物拯救浓度。实验最少重复3次以上,每天半量换液，连续培养5天，结束实验。
[0074]2、骨矿化定量分析
[0075]具体实验方法与实施例三中相同。
[0076]3、行为学分析
[0077]具体实验方法与实施例三中相同。
[0078]4、数据处理与统计学计算
[0079]具体实验方法与实施例三中相同。
[0080]二、实验结论
[0081]为了评估模型的效果，我们选取了传统的补肾壮骨中药提取物FE来验证。从附图6a，b，可以看出与DEX模型组相比，应用FE作用的药物组骨矿化面积及骨矿化密度有明显的增加趋势。数据量化统计分析见附图7，与DEX模型组相比，当FE浓度为0.1 μ g/ml时无显著性差异，而剂量增至0.5、I μ g/ml时，差异具有统计学意义(P〈0.05)。说明FE能预防DEX诱导的斑马鱼骨量丢失，促进斑马鱼骨矿化面积和骨密度的增加。(η = 5-6)
[0082]行为学游泳实验同样表明，具体参见附图8a，相对于DEX模型组，FE药物组斑马鱼的游泳能力有所提高。数据统计分析见附图8b，FE浓度为lyg/ml组能改善DEX造成斑马鱼游泳能力的下降，差异具有统计学意义(P〈0.05)。(η = 7)
[0083]实施例5骨相关因子水平变化情况的研究
[0084]一、实验方法
[0085]在上述实验结束时，分别收集阴性对照组、最佳造模组和最佳药物拯救组斑马鱼12-15条，应用trizol法进行总RNA的提取，去基因组DNA后反转录为cDNA，实时荧光定量 PCR 检测成骨因子 Osterix, osteocalcin, osteopontin 和破骨因子 tracp (TartrateResistant Acid Phosphatase),及 eGFP 等基因的水平变化。
[0086]二、实验结论
[0087]为了观察斑马鱼骨骼基因水平的变化情况，本发明选择了 DMSO阴性对照组，10 μ M DEX造模组和I μ g/ml FE药物预防组,检测其成骨因子Osterix, osteocalcin和osteopontin,破骨因子tracp及荧光报告基因eGFP等的水平变化。荧光定量PCR结果显不见附图9,与DMSO阴性对照相比,DEX模型组下调Osterix, osteocalcin和osteopontin等成骨因子水平，而上调tracp破骨因子水平，具有统计学意义(P〈0.01)。与DEX模型组相比，FE药物预防组上调Osterix, osteocalcin和osteopontin等成骨因子水平,具有统计学意义(P〈0.01)，但对tracp破骨因子水平没有影响，无统计学意义(P>0.05)。考虑到eGFP作为转基因斑马鱼骨骼的一个重要报告基因，我们也对其进行了分子水平上变化的检测。结果表明，其与图片显示结果相符，与DMSO组比，DEX模型组使其水平降低；而FE药物预防组则能使其水平显著升高，都具有统计学意义(P〈0.01)，相对于DEX模型组。(η = 4)
【权利要求】
1.一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其包括以下步骤: (1)斑马鱼的繁殖； (2)转基因斑马鱼的构建； (3)采用药物对转基因斑马鱼进行造模； 其特征在于，在步骤(2)所述的转基因斑马鱼的构建过程中，应用tol2-gateWay转基因技术分别构建质粒5’Entry clone:p5E-0sterix,Middle Entry clone:pME-nIs EGFP和3’Entry clone:p3E-Poly A,并将上述质粒进行三片段LR反应,获得表达质粒pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA，最后将所述表达质粒与Tol2mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎细胞中。
2.根据权利要求1所述的骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其中步骤(2)中所述的表达质粒 pDestTol2CG2_osterix-nls-EGFP-pA 的结构如图1 所不。
3.根据权利要求1所述的骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其中步骤(3)中所采用的药物为地塞米松DEX，其最佳浓度为10 μ M。
4.根据权利要求1所述的骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其中还进一步包括对骨质疏松斑马鱼模型进行评估验证的步骤。
5.根据权利要求4所述的骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其中所述的评估验证包括药物评估验证、骨矿化定量分析、行为学分析和骨相关因子水平变化监测。
6.根据权利要求5所述的骨质疏松斑马鱼模型的构建方法，其中药物评估验证所采用的药物分别为地塞米松DEX和淫羊藿黄酮FE，其中淫羊藿黄酮FE的最佳拯救浓度为I μ g/ml ο
7.权利要求1-6所述的骨质疏松斑马鱼模型在筛选抗骨质疏松药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述药物分别为骨吸收抑制剂类药物、骨形成促进类药物、骨矿化促进类药物以及中药类药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的骨吸收抑制剂类药物为双膦酸盐、降钙素、雌激素、雌激素受体调节剂和依普黄酮，骨形成促进类药物为氟制剂、甲状旁腺激素制剂、活性维生素D制剂，骨矿化促进类药物为钙剂、维生素D及其活性代谢物。
10.根据权利要求7所述的应用，其中所述的中药类药物为淫羊藿、熟地、杜仲、丹参、黄芪和蛇床子。
【文档编号】C12N15/63GK104313043SQ201410515404
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】张晶晶, 黄洪新, 萧崇德, 曾荣 申请人:广东医学院附属医院