一种快速提取杉木总rna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从植物组织中快速提取总RNA的方法，特别涉及一种从富含多酚等次生代谢产物的植物组织中提取总RNA的方法。本发明的目的在于提供一种简单、经济、高效的快速提取杉木总RNA的方法，为研究人员在实际工作中提供更多的选择。所提取的RNA质量高，可以满足RT-PCR、Northern杂交等基因分离和表达分析等研究的需要，同时可以大大降低实验的成本。本发明通过将SDS提取液和巯基乙醇混合提取，离心柱纯化，可对杉木组织的RNA进行快速提取，大大缩短时间及降低实验成本，提取的RNA纯度较高，可以满足分子生物学研究的需求。
【专利说明】一种快速提取杉木总RNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从植物组织中快速提取总RNA的方法，特别涉及一种从富含多酚等次生代谢产物的植物组织中提取总RNA的方法。
【背景技术】
[0002]衫木iCunninghamia lanceolata (Lamb.)Hook.)是我国南方重要的用材林树种。近年来，随着分子生物学技术的发展，国内外也逐渐开始利用分子生物学手段来开展杉木的相关研究，而从杉木组织中提取闻质量的总RNA是进行这些研究的基础和关键。
[0003]杉木富含多酚等次生代谢产物，多酚易被氧化成褐色的醌类物质，会使RNA降解，RNase和多酚氧化酶都属于蛋白质，要获得完整的、高质量的总RNA就必须能够去除蛋白，次生代谢产物则易于RNA结合，阻碍RNA的分离。因此，要获得高质量的杉木总RNA，就必须要去除多酚和次生代谢产物，抑制多酚的氧化。
[0004]目前，常见植物材料总RNA的提取方法较多，主要有CTAB法、改良CTAB法、Trizol法、异硫氰酸胍法、热硼酸法等，但尚未有一种能够快速从杉木组织中提取总RNA的方法。我们迫切需要一种成本低廉，操作简单、方便，高效的提取方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种简单、经济、高效的快速提取杉木总RNA的方法，为研究人员在实际工作中提供更多的选择。所提取的RNA质量高，可以满足RT-PCR、Northern杂交等基因分离和表达分析等研究的需要，同时可以大大降低实验的成本。
[0006]本发明所提供的一种快速提取杉木总RNA的方法，包括以下步骤:
(1)在1.5 ml离心管中混匀如下液体:1 ml SDS提取液和40-60 μ I巯基乙醇，记为提取液A ；
(2)取90-120mg新鲜杉木材料放到2ml离心管中，并加入钢珠，迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末；
(3)向研磨后的离心管中迅速加入0.8-1.5 ml提取液A,涡旋混匀，室温静置8-15min，4°C，13000g 离心 10-20 min ；
(4)吸取500-700μ I上清至一新的1.5 ml离心管中，加入200-400 μ I 5 mol/L NaCl和 400-600 μ I 氯仿，混匀，4°C，13000g 离心 4-7 min ；
(5)吸取500-700μ I上清，加入等体积的水饱和酚:氯仿ν/ν=1:1的混合液，混匀，4°C，13000g 离心 4-7 min ；
(6)吸取300-500μ I上清于一新的1.5 ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，于室温下在侧摆摇床上摇勻10 min ；
(7)将上述摇匀后的液体吸入到离心柱中，4°C，13000g离心1-3min ；
(8)加入75%预冷的乙醇洗涤沉淀，4°C，13000g离心1-3min ；
(9)重复步骤(8)； (10)弃液，4°C，13000g空离心 1-3 min ；
(11)更换底部的收集管为新的1.5ml无RNA酶离心管，向上述离心柱中央加入30-50 μ I DEPC 水，静置 2-5 min，4°C，13000g 离心 1-3 min ；
(12)将离心后离心管底部的液体重新吸入离心柱中，静置2?5min, 4°C，13000g离心
1-3 min ；
(13)弃离心柱，将新的收集管_20°C保存备用。
[0007]SDS 提取液配置:0.25M NaCl, 0.05M Tris-HCl、ρΗ=7.5，20mM EDTA、ρΗ=8.0，1%SDSο
[0008]更优选地，一种快速提取杉木总RNA的方法，包括以下步骤:
(1)在1.5 ml离心管中混匀如下液体:1 mlSDS提取液和50μ I巯基乙醇，记为提取液A ；
(2)取10mg新鲜杉木材料放到2ml离心管中，并加入2个5 mm钢珠,迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末；
(3)向研磨后的离心管中迅速加入Iml提取液A，涡旋混匀，室温静置10 min，4°C，13000g 离心 15 min ；
(4)吸取600μ I上清至一新的1.5 ml离心管中，加入300 μ I 5 mol/L NaCl和500 μ I氯仿，混勻，4°C, 13000g离心5 min ；
(5)吸取600μ I上清，加入等体积的水饱和酚:氯仿v/v=l:1的混合液，混匀，4°C，13000g 离心 5 min ；
(6)吸取400μ I上清于一新的1.5 ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，于室温下在侧摆摇床上摇匀10 min ；
(7)将上述摇匀后的液体吸入到离心柱中，4°C，13000g离心Imin ；
(8)加入500μ I 75%预冷的乙醇洗涤沉淀，4°C，13000g离心I min ；
(9)重复步骤(8)；
(10)弃液，4°C，13000g空离心 I min ；
(11)更换底部的收集管为新的1.5ml无RNA酶离心管，向上述离心柱中央加入50 μ IDEPC 水，静置 2 min，4°C，13000g 离心 I min ；
(12)将离心后离心管底部的液体重新吸入离心柱中，静置2min，4°C，13000g离心I
min ；
(13)弃离心柱，将新的收集管_20°C保存备用。
[0009]本的发明优点在于，可对杉木组织的RNA进行快速提取，大大缩短时间及降低实验成本。例如，Iml提取液A可有效提取10mg杉木叶片和根的总RNA (附图1)，0D26(I/28Q在1.9-2.1之间，提取的RNA纯度较高，可以满足分子生物学研究的需求；用传统的CTAB法或改良CTAB法来提取杉木组织的总RNA，步骤比较繁琐，耗时较长(过夜沉淀);还需要有去除DNA的步骤才能得到质量比较高的RNA，也因增加了此步骤，导致最终所得到的RNA的含量比较低。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为琼脂糖凝胶电泳检测杉木组织总RNA，电泳后用凝胶成像系统拍照所得的效果图:a为加样孔，b为28S RNA，c为18S RNA，d为5S RNA ;A、B为杉木叶片，C、D为杉木根。
[0011]图2为杉木总RNA电泳图(CTAB法:M为marker，A为杉木叶，B为杉木根)。
【具体实施方式】
[0012]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0013]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0014]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1
1、溶液的配制
(1)0.1% (v/v) DEPC水:1000 ml超纯水中加入I ml焦炭酸二乙酯(DEPC)，于磁力搅拌器上搅拌4h以上，121°C高压灭菌20 min，摇匀，冷却后备用，以下用到的所有溶液都需要用0.1% (v/v) DEPC水配制。
[0015](2) IM Tris-HCl (pH=7.5) 50 ml:称取 12.11 g Tris 碱溶于约 80 ml DEPC 水中，用浓盐酸调节pH至7.5，定容至100 ml ο
[0016](3)5M NaCl 100 ml:称取29.22 g NaCl 溶于约80 ml DEPC水中，定容至 100 ml。
[0017](4) 0.5M EDTA (ρΗ=8.0) 100 ml:称取 18.61 g Na2EDTA.2H20 溶于 80 ml DEPC水中，加热溶解，用NaOH调节pH至8.0。
[0018](5)SDS 提取液:0.25M NaCl,0.05M Tris-HCl (pH=7.5),20mM EDTA, 1%(M/V)SDS。称取 Ig SDS 溶于 20 ml DEPC 水中，再加入 5 ml 5M NaCl，5ml IM Tris-HCl,4 ml 0.5MEDTA，用DEPC水定容至100 ml。由于β -巯基乙醇易降解，使用前现加(提取液A:1ml SDS提取液和40-60 μ I β -巯基乙醇涡旋混匀)。
[0019]2、实验用品处理
提取过程中的玻璃器皿在180°C连续烘烤6h ;塑料离心管及枪头均121°C高压灭菌20min，然后80°C烘干。
[0020]3、实验操作
提取液A法提取杉木叶片和根总RNA的步骤:
(1)在1.5 ml离心管中混匀如下液体:1 ml提取液和50 μ I巯基乙醇，记为提取液A ；(CTAB法需要将提取液在65 °C水浴锅中预热Ih)；
(2)取10mg新鲜杉木叶片及根分别放到2ml离心管中，并各加入2个5 mm钢珠，迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末；
(3)向研磨后的离心管中迅速加入Iml提取液A，涡旋混匀，室温静置10 min，4°C，13000g离心15 min ; (CTAB法需要于65°C水浴放置20 min，期间需要每隔5 min颠倒混匀I次。)
(4)取步骤(3)获得的上清600μ I于一新的1.5 ml离心管中，加入300 μ I 5 mol/LNaCl 和 500 μ I 氯仿，混匀，4°C，13000g 离心 5 min ；
(5)取步骤(4)获得的上清600μI于一新的1.5 ml离心管中，加入等体积的水饱和酹:氯仿(1:1，v/v)，混勻，4°C, 13000g 离心 5 min ； (6)取步骤(5)获得的上清400 μ I于一新的1.5 ml离心管中,加入等体积预冷的异丙醇，于侧摆摇床上摇匀10 min (室温进行)；(CTAB法用LiCl沉淀需要4°C沉淀至少6h，甚至过夜)。
[0021](7)将步骤(6)所述液体吸入到离心柱中，4°C, 13000g离心I min,弃液；
(8)向步骤(7)所述的离心柱中加入500μI 75%预冷的乙醇洗沉淀，4°C，13000g离心I min ；
(9)弃液，重复步骤(8)；
(10)弃液，4°C，13000g空离心 I min ；
(11)更换步骤(10)中底部的收集管为新的1.5 ml无RNA酶离心管，向上述离心柱中央加入 50 μ I DEPC 水，静置 2 min, 4°C，13000g 离心 I min ；
(12)将离心后离心管底部的液体重新吸入离心柱中，静置2min，4°C，13000g离心I
min ；
(13)弃离心柱，并做好标记_20°C保存备用。
[0022]4、RNA完整性检测
取上述本发明的方法制备的5 μ I RNA溶液与I μ I 6 X loading buffer混匀，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。通过凝胶成像可以观测到比较完整的RNA，其中28S RNA的亮度大约是18S RNA的两倍，加样孔正常，无发亮拖尾现象(图1)。CTAB法提取的杉木叶和根的电泳结果见图2，可以看到明显的DNA污染，无5S RNA。
[0023]5、RNA质量检测
取上述方法制备的2 μ I RNA溶液，加入到TECAE酶标仪中测量RNA浓度和0D26(I/28(I的比值，分析RNA质量。结果表明本方法在含酚类较高的杉木叶片和根中提取的RNA具有较高的质量和产量，其中OD2607280值分别为2.06,2.04,2.06、1.97 (从左到右)，产量为67.3、61.26,58.58,63.62 μ g/g (从左到右)。
[0024]注:CTAB法提取杉木叶片和根总RNA的步骤:
(1)将600ul的2%CTAB加入至1.5ml离心管中，并加入50uL的β -巯基乙醇，振荡混匀，65 °C水浴预热；
(2)取100mg新鲜杉木叶片及根分别放到2 ml离心管中，并各加入2个5 mm钢珠，迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末；
(3)将材料粉末转移至于65°C水浴预热的2%CTAB离心管中，混匀，并于65°C水浴20min,期间每隔5 min温柔颠倒一次；
(4)加入600ul的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，振荡均匀，4°C，12000 g离心10
min ；
(5)转移上清到另一1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)后颠倒混勻，4。。，12000 g 离心 10 min ；
(6)将上清转移到另一1.5 ml离心管中，加入1/4体积的10 M LiCl，使其终浓度为2mol/L，温柔颠倒混匀后，4°C沉淀过夜；
(7)4°C，12000g 离心 20 min，弃上清；
(8)加入500μ I SSTE溶解沉淀，加入500 μ I氯仿抽提；
(9)4°C,12000 g 离心 10 min ； (10)取上清，加入无水乙醇使其终浓度为70%，-20°c放置Ih ；
(11)4°C, 12000 g 离心 20 min ；
(12)弃上清，加入75%乙醇洗涤沉淀，4°C，12000g离心10 min ；
(13)弃上清，用移液器吸走多余乙醇，干燥5?10min，加入50μ1 DEPC水溶解沉淀。
[0025]CTAB法提取的杉木叶和根的0D26Q/28Q值分别为2.10,2.12，产量为45.3,39.9 μ g/
g°
【权利要求】
1.一种快速提取杉木总RNA的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)在1.5 ml离心管中混匀如下液体:1 ml SDS提取液和40-60 μ I巯基乙醇，记为提取液A ； (2)取90-120mg新鲜杉木材料放到2ml离心管中，并加入钢珠，迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末； (3)向研磨后的离心管中迅速加入0.8-1.5 ml提取液A,涡旋混匀，室温静置8-15min，4°C，13000g 离心 10-20 min ； (4)吸取500-700μ I上清至一新的1.5 ml离心管中，加入200-400 μ I 5 mol/L NaCl和 400-600 μ I 氯仿，混匀，4°C，13000g 离心 4-7 min ； (5)吸取500-700μ I上清，加入等体积的水饱和酚:氯仿ν/ν=1:1的混合液，混匀，4°C，13000g 离心 4-7 min ； (6)吸取300-500μ I上清于一新的1.5 ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，于室温下在侧摆摇床上摇勻10 min ； (7)将上述摇匀后的液体吸入到离心柱中，4°C，13000g离心1-3min ； (8)加入75%预冷的乙醇洗涤沉淀，4°C，13000g离心1-3min ； (9)重复步骤(8)； (10)弃液，4°C，13000g空离心 1-3 min ； (11)更换底部的收集管为新的1.5ml无RNA酶离心管，向上述离心柱中央加入30-50 μ I DEPC 水，静置 2-5 min，4°C，13000g 离心 1-3 min ； (12)将离心后离心管底部的液体重新吸入离心柱中，静置2-5min，4°C，13000g离心1-3 min ； (13)弃离心柱，将新的收集管_20°C保存备用。
2.根据权利要求1的所述的快速提取杉木总RNA的方法，其特征在于:步骤(I)所述SDS 提取液的配置:0.25M NaCl, 0.05M Tris-HCl、pH=7.5,20mM EDTA、pH=8.0,1%SDS。
3.根据权利要求1的所述的快速提取杉木总RNA的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)在1.5 ml离心管中混匀如下液体:1 mlSDS提取液和50μ I巯基乙醇，记为提取液A ； (2)取10mg新鲜杉木材料放到2ml离心管中，并加入2个5 mm钢珠,迅速放到液氮中速冻，用高通量组织研磨仪研磨成粉末； (3)向研磨后的离心管中迅速加入Iml提取液A，涡旋混匀，室温静置10 min，4°C，13000g 离心 15 min ； (4)吸取600μ I上清至一新的1.5 ml离心管中，加入300 μ I 5 mol/L NaCl和500 μ I氯仿，混勻，4°C, 13000g离心5 min ； (5)吸取600μI上清，加入等体积的水饱和酚:氯仿ν/ν=1:1的混合液，混匀，4°C，13000g 离心 5 min ； (6)吸取400μ I上清于一新的1.5 ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，于室温下在侧摆摇床上摇匀10 min ； (7)将上述摇匀后的液体吸入到离心柱中，4°C，13000g离心Imin ； (8)加入500μ I 75%预冷的乙醇洗涤沉淀，4°C，13000g离心I min ； (9)重复步骤(8)； (10)弃液，4°C，13000g空离心 I min ； (11)更换底部的收集管为新的1.5ml无RNA酶离心管，向上述离心柱中央加入50 μ IDEPC 水，静置 2 min，4°C，13000g 离心 I min ；(12)将离心后离心管底部的液体重新吸入离心柱中，静置2min，4°C，13000g离心Imin ； (13)弃离心柱，将新的收集管_20°C保存备用。
【文档编号】C12N15/10GK104313014SQ201410523493
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】马志慧, 林思祖, 陈宇, 许珊珊, 曹光球, 李树斌, 丁国昌 申请人:福建农林大学