Fish制片再次杂交的方法
【专利摘要】本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种FISH制片再次杂交的方法。该方法主要包括以下步骤：制片在首次荧光原位杂交后，浸泡于2×SSC中以洗掉盖片，然后在2×SSC中浸泡3×5min；随后把制片放入90℃的2×SSC中10min，期间不断摇动；再放入78℃的70％去离子甲酰胺中4min，期间不断摇动；随后迅速放入-20℃的70％酒精中。该过程可把杂交信号洗脱掉，随后观测制片，检测不到杂交信号。处理后的制片再次用相同的探针进行荧光原位杂交实验，在染色体的相同位置可再次检测到杂交信号。本发明所述的方法使得原位杂交后的制片可重复多次使用，有效得节约了资源，降低了成本，减少了对环境的污染。
【专利说明】FISH制片再次杂交的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉FISH制片再次杂交的方法。
【背景技术】
[0002]荧光原位杂交技术始于20世纪60年代末，是利用碱基互补配对原则在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段。荧光原位杂交最初使用的探针为DNA重复序列和多拷贝基因家族，后来随着该技术的不断改进和完善，逐渐开始使用单低拷贝序列作为探针，使其检测的分辨率和灵敏性都得到了大幅的提高。目前，荧光原位杂交技术广泛应用在基因物理定位、染色体识别、物理图谱的构建、亲缘关系研究和转基因检测等方面，在现代分子细胞遗传学领域有着举足轻重的作用。
[0003]荧光原位杂交实验中，制片的质量往往是实验是否成功的关键要素。可荧光原位杂交的制片往往不易获得，需要消耗大量的实验材料。而在通常情况下，由于制片在首次杂交后杂交信号很难洗掉，以及不知如何正确处理制片在观察后表面留有的试剂而又不影响制片上染色体的完整等因素，制片往往使用一次便被丢弃，这造成了资源的巨大浪费，并且很容易污染环境。尤其对于一些珍贵的相对稀少的材料，制片更显得尤为宝贵。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种FISH制片再次杂交的方法。
[0005]根据本发明的【具体实施方式】，所述的方法包括以下步骤:
[0006]I)荧光原位杂交后的制片，在2XSSC浸泡下洗掉盖片，然后2XSSC浸泡制片3X5min,以洗掉盖片及制片上残留的试剂。
[0007]2)随后把制片放入90°C的2 X SSC下lOmin，期间不断摇动，把制片上的试剂彻底洗涤干净，初步变性制片上的染色体。
[0008]3)再放入78°C的70%去离子甲酰胺中4min，期间不断摇动，变性制片上的染色体，使其双链打开，轻微摇动，把首次杂交中的探针序列从靶序列上洗涤掉。温度过低或时间过短则染色体变性不彻底，导致首次杂交中的杂交信号洗涤不彻底，温度过高或时间过长会使染色体形态变得蓬松，影响观察。
[0009]4)随后迅速放入-20°C的70%酒精中。
[0010]5)用DAPI在暗室染色1min。
[0011]6)荧光显微镜观察，观测信号的洗脱情况。
[0012]7)再次利用该制片进行荧光原位杂交实验。
[0013]荧光原位杂交技术如今在染色体鉴定、物理图谱构建、基因组比较研究等方面起着重要的作用，利用本发明提供的FISH制片再次杂交的方法，可彻底洗脱掉荧光原位杂交中的杂交信号，从而可使制片得到多次使用。这对于研究较珍贵的材料有很大的帮助，同时减少了环境污染，节约了实验成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1以雷蒙德氏棉I号染色体特异BAC克隆(Wang K，2007)为探针，荧光原位杂交雷蒙德氏棉的有丝分裂中期染色体的杂交图像。染色体显示为蓝色，特异BAC克隆为红色信号。Bar = 5ym0 A:首次杂交的图像。B:洗脱制片后的图像。C:再次杂交后的图像。
[0015]图2以雷蒙德氏棉I号染色体特异BAC克隆(Wang K, 2007)为探针，荧光原位杂交雷蒙德氏棉的有丝分裂间期染色体的杂交图像。染色体显示为蓝色，特异BAC克隆为红色信号。Bar = 5ym0 A:首次杂交的图像。B:洗脱制片后的图像。C:再次杂交后的图像。
[0016]图3以陆地棉中棉所12号的中期染色体为靶DNA的杂交图像。A:初次荧光原位杂交时中期染色体形态。B:洗脱制片后的中期染色体形态。
【具体实施方式】
[0017]实施例1以雷蒙德氏棉I号染色体特异BAC克隆为探针，雷蒙德氏棉(D5)有丝分裂中期染色体为靶染色体，进行FISH制片再次杂交实验。
[0018]I材料和方法
[0019]1.1实验材料
[0020]实验材料是雷蒙德氏棉，来自于中国农业科学院棉花研究所。所用的BAC为雷蒙德氏棉I号染色体特异BAC克隆(Wang K, 2007)。实验试剂:纤维素酶Onazuka R-1O和果胶酶Pectolyase Y-23购自Solarb1公司，地高辛探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。
[0021]1.2实验方法
[0022]I)取材及预处理:取雷蒙德氏棉的种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至I?2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25°C下处理2h，然后用蒸馏水冲洗I次，用95%乙醇:冰乙酸(3:1)固定液固定4h以上；
[0023]2)酶解:取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗I次，在37°C下用4%纤维素酶+2%果胶酶混合液处理根尖45min ；
[0024]3)制片:酶解好的根尖用60%乙酸进行压片，保留下好的制片在_80°C下保存4h以上，然后在_80°C下揭掉盖片，迅速置于80°C烤干，在60°C烘箱中烘干10h，最后放在4°C保存备用；
[0025]4)标记探针:探针的标记采用Dig-Nick Translat1n Mix系统标记。首先提取特异BAC克隆(299N22)的质粒，然后参考Roche公司的说明，先取I μ L相应浓度的质粒溶解于 ddH20 中，配成 16yL,#WA4yL Dig-Nick Translat1n Mix 混合,短暂离心,然后15°C保温90min，最后是65°C温浴lOmin，以灭活体系中的酶活性，最后放在_20°C保存备用。
[0026]5)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法。地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示为红色。染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。
[0027]6)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-1sis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。采用Photoshop作图软件处理图片。
[0028]7)杂交后的制片在观察后，在2X SSC浸泡下洗掉盖片，然后2X SSC浸泡制片3X5min。
[0029]8)随后把制片放入90°C的2XSSC下lOmin，期间不断摇动。
[0030]9)再放入78°C的70%去离子甲酰胺中4min，期间不断摇动。
[0031]10)随后迅速放入_20°C的70%酒精中。
[0032]11)用 DAPI 在暗室染色 1min。
[0033]12)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号。
[0034]13)随后的再次荧光原位杂交洗脱后的制片，同样以雷蒙德氏棉I号染色体特异BAC克隆为探针,采用Dig-Nick Translat1n Mix系统标记,突光原位杂交具体流程依旧参照王春英等(2001)介绍的方法。
[0035]14)荧光显微镜观察，用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号。
[0036]2实验结果
[0037]实验结果显示(图1)，首次荧光原位杂交后，用荧光显微镜观察可发现清晰的杂交信号。经过洗脱处理制片后，杂交信号被洗脱干净，而当再次用同样的探针荧光原位杂交后，杂交信号再次出现在染色体相同的位置。
[0038]照片上可明显看出，首次杂交后，在染色体上有明显红色杂交信号；经过对制片洗脱处理后，杂交信号被洗脱干净；当再一次用同样的探针做荧光原位杂交时，杂交信号再次在染色体的相同位置被观测到。
[0039]实施例2以陆地棉中棉所12的有丝分裂中期染色体为靶染色体，进行FISH制片再次杂交实验。
[0040]I材料和方法
[0041]1.1实验材料
[0042]实验材料是陆地棉中棉所12号，来自于中国农业科学院棉花研究所。实验试剂:纤维素酶Onazuka R-1O和果胶酶Pectolyase Y-23购自Solarb1公司，地高辛探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。
[0043]1.2实验方法
[0044]在第9步时，延长在78 °C的70 %去离子甲酰胺中的时间至5分钟。其他步骤同上。
[0045]2实验结果
[0046]实验结果发现，当延长第9步中的处理时间时，染色体形态明显出现膨胀现象(图3)。时间越长，膨胀程度越严重，会严重影响对杂交信号的观测。而时间偏少，则会导致杂交信号洗涤不彻底。
【权利要求】
1.^18?制片再次杂交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 1)荧光原位杂交后的制片，在2X3%浸泡下洗掉盖片，然后2X3%浸泡制片3X501！！，以洗掉盖片及制片上残留的试剂； 2)随后把制片放入901的2X3%下10-！！，期间不断摇动，把制片上的试剂彻底洗涤干净，初步变性制片上的染色体。； 3)再放入781的70%去离子甲酰胺中細化，期间不断摇动。
【文档编号】C12Q1/68GK104313138SQ201410534116
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】崔兴雷, 刘玉玲, 刘方, 王星星, 蔡小彦, 彭仁海, 周忠丽, 王春英, 王玉红, 王坤波 申请人:中国农业科学院棉花研究所