一种固态菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种固态菌剂的制备方法。该方法将菌种培养液进行浓缩，浓缩后加入抑制剂再与一定量的固体吸附载体混合均匀，将混合物进行干燥后加入脱氧剂即可制备固态菌剂。本发明方法可提高固态菌剂的保存时间以及存活力，同时能够降低保存和运输成本，由于添加了抑制剂和铁粉脱氧剂不仅可以降低染菌机率，防止菌种培养基残余有机物氧化，也能在一定程度上降低目标菌种的活性，对保存时间的延长起到促进作用。
【专利说明】一种固态菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于菌种保存【技术领域】，具体涉及一种固态菌剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 微生物菌种广泛应用于农业、饲料以及工业废水的处理。制备的菌种培养液如果 不经过特殊处理会面临保存时间短、活力低以及容易变异的问题。目前一般通过降低生物 活性的方式解决该问题。常用的技术有冷冻保存、冷冻干燥保存、向菌液中加入保护剂以 及制备固态菌剂等。冷冻技术的设备成本较高，且适用于少量保存。添加保护剂的方法存 在保存时间短、菌液易变质的情况。因此，当微生物菌液较多时，制备固态菌剂无疑是最方 便有效和节约成本的方式。制备固态菌剂利用多孔性材料作为载体来吸附进行细胞固定 化，从而使微生物细胞活性降低甚至休眠，具有存放时间长、保存及运输成本低的优点。公 开专利CN103449681A介绍了一种用于治理环境污水的微生物制剂的制备方法，公开专利 CN102719383B介绍了解淀粉芽孢杆菌K-8及其菌剂的制备方法，上述专利按照传统方式制 备固态菌剂必然面临菌剂污染杂菌的问题，会给菌剂的应用带来困难。
【发明内容】
[0003] 本发明针对现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种固态菌剂的制备方法，该方 法可以解决菌种保存时间较短、容易污染杂菌的问题。
[0004] 为实现上述的发明目的，本发明固态菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0005] (1)将原始菌种培养液进行浓缩，浓缩倍数为2?4倍，浓缩后调节pH值为3. 0? 5. 0,并按比例加入终浓度为2wt%。?4wt%。的抑制剂，得到浓缩菌种培养液；
[0006] (2)将固体吸附载体过40目筛后，在121°C高温下灭菌20-30min ;
[0007] (3)按照固液比（g/mL)为1 : 3?I : 1向浓缩菌种培养液投加适量固体吸附载 体，混合均匀并进行30-40°C干燥使其含水率为6wt%?10wt%，制备固态菌剂。
[0008] (4)向固态菌剂内加入lwt%。?2wt%。的铁粉脱氧剂，混合均匀后密封保存。
[0009] 所述的抑制剂为山梨酸钾或苯甲酸钠中的一种；所述的固体吸附载体为燕麦糠、 米糠、玉米粉、玉米胚芽柏、豆柏、麦麸、蔗渣、滑石粉、硅藻土、沸石粉中的一种或几种的混 合物。
[0010] 根据本发明上述固态菌剂的制备方法，所述浓缩菌种培养液优选通过离心、沉降、 膜过滤中的任何一种方法制备。
[0011] 所述脱氧剂优选为还原性铁粉、活性炭和氯化钠按照质量比8 : 2 : 1比例混合 的混合物。
[0012] 山梨酸钾和苯甲酸钠作为抑制剂主要通过在合适的pH值条件下抑制微生物酶系 统，从而达到抑制微生物的生长和起防腐作用。脱氧剂使包装环境内的氧含量降至0. 02% 以下，不仅可以抑制好氧微生物的活性而且能有效防止有机物的氧化。因此，在制备固态菌 剂时将抑制剂和脱氧剂加入可以在保存过程中起到抑制微生物活性，降低染菌机率，防止 菌种培养基残余有机物氧化的目的。
[0013] 本发明固态菌剂的制备方法与现有技术相比，其有益效果是：
[0014] 1)本方法制备的固态菌剂可提高菌剂的保存时间以及存活力，同时能够降低保存 和运输成本。制备菌剂过程中培养基并未完全去除，其中残存的有机物可充当保护剂的作 用。另外，由于添加了抑制剂和脱氧剂不仅可以降低染菌机率，防止菌种培养基残余有机物 氧化，也能在一定程度上降低目标菌种的活性，对保存时间的延长起到促进作用。
[0015] 2)该方法制备的菌剂在室温条件下保存时间较长，保存2年后菌种存活率可以达 到85%以上，且能够保持降解性能，培养过程中无杂菌污染，这也说明该固态菌剂可直接用 于菌种活化或者菌种发酵的种子菌种。该制备方法不仅局限于专利所用菌种也可适用于其 他微生物菌种。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 :制备固态菌剂
[0017] 菌种培养液的制备：将除油菌剂BDB-a(购自南洋东华工程科技有限公司）加入 LB培养基中培养16h，培养结束后将菌液通过沉降的方式进行浓缩，浓缩倍数为4倍。
[0018] 固态菌剂的制备：
[0019] (1)将固态吸附载体于121°C灭菌30min后备用；
[0020] (2)调节浓缩菌种培养液的pH至5. 0,加入2wt%。山梨酸钾，混合均匀；
[0021] (3)按照固液比（g/mL)为1 : 3的比例向上述混合液中分别加入麦麸与滑石粉混 合均匀，放于摇床震荡lh，转速设定为50rpm，使菌种充分吸附于载体上；
[0022] (4)将上述混合样品放于35°C烘箱内进行恒温干燥后含水率达到6wt% ;
[0023] (5)取固态菌剂Ig加入IOOml生理盐水中震荡lh，转速设定为150rpm。震荡结束 后取上清液采用平板稀释法计数达到8. 7 X 109cfu/g，且未发现杂菌；
[0024] (6)向固态菌剂内加入lwt%。的铁粉脱氧剂，混合均匀后放于样品袋内密封放于 室温保存。
[0025] 实施例2 :制备固态菌剂
[0026] 菌种培养液的制备：将除油菌剂BDB-a(购自南洋东华工程科技有限公司）加入 LB培养基中培养16h，培养结束后将菌液通过离心的方式进行浓缩，浓缩倍数为3倍。
[0027] 固态菌剂的制备：
[0028] (1)将固态吸附载体于121°C灭菌30min后备用；
[0029] (2)调节浓缩菌种培养液的pH至4. 0,加入3wt%。苯甲酸钠，混合均匀；
[0030] (3)按照固液比（g/mL)为1 : 2的比例向上述混合液中加入燕麦糠和蔗渣混合均 勻，放于摇床震荡Ih,转速设定为50rpm，使菌种充分吸附于载体上；
[0031] (4)将上述混合样品放于35°C烘箱内进行恒温干燥后含水率达到8wt% ;
[0032] (5)取固态菌剂Ig加入IOOml生理盐水中震荡lh，转速设定为150rpm。震荡结束 后取上清液采用平板稀释法计数达到9. 2 X 109cfu/g，且未发现杂菌；
[0033] (6)向固态菌剂内加入I. 5wt%。的铁粉脱氧剂，混合均匀后放于样品袋内密封放 于室温保存。
[0034] 实施例3 :制备固态菌剂
[0035] 菌种培养液的制备：将除油菌剂BDB-a(购自南洋东华工程科技有限公司）加入 LB培养基中培养16h，培养结束后将菌液通过陶瓷膜过滤的方式进行浓缩，浓缩倍数为2 倍。
[0036] 固态菌剂的制备：
[0037] (1)将固态吸附载体于121°C灭菌30min后备用；
[0038] (2)调节浓缩菌种培养液的pH至3. 0,加入4wt%。山梨酸钾，混合均匀；
[0039] (3)按照固液比（g/mL)为I : 1的比例向上述混合液中加入玉米粉混合均勻，放 于摇床震荡Ih,转速设定为50rpm，使菌种充分吸附于载体上；
[0040] (4)将上述混合样品放于35°C烘箱内进行恒温干燥后含水率达到IOwt % ;
[0041] (5)取固态菌剂Ig加入IOOml生理盐水中震荡lh，转速设定为150rpm。震荡结束 后取上清液采用平板稀释法计数达到I. lXl〇1(lcfu/g，且未发现杂菌；
[0042] (6)向固态菌剂内加入2wt%。的铁粉脱氧剂，混合均匀后放于样品袋内密封放于 室温保存。
[0043] 实施例4 :固态菌剂保存效果的考察
[0044] 保存2年后，分别取实施例1、2、3所制备的固态菌剂Ig加入IOOml生理盐水中震 荡lh，转速设定为150rpm。震荡结束后取上清液采用平板稀释法计数。实施例2所得固态 菌剂计数达到7. 4 X 109cfu/g，实施例3所得固态菌剂计数达到7. 9 X 101(lcfu/g，实施例4所 得固态菌剂计数达到9. 6 X 109cfu/g，菌种存活率可达到85%以上，且培养过程中均未发现 杂菌。该固态菌剂可直接用于菌种活化或者菌种发酵的种子菌种。
[0045] 将保存前的菌种培养液按照5 X 108cfu/ml的接种量加入油含量为23. lmg/L含油 废水中，降解24h后油去除率可达到73. 8 %。保存2年后，将实施例1、2、3所制备的固态菌 剂投加到LB培养基培养16h后，仍按照5 X 108cfu/ml的接种量加入油含量为22. 7mg/L含 油废水中，降解24h后考察降解效果。
[0046] 表1菌剂降解性能考察
[0047]
【权利要求】
1. 一种固态菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： ⑴将原始菌种培养液进行浓缩，浓缩倍数为2?4倍，调节pH值为3. 0?5. 0,按比 例加入终浓度为2wt%。?4wt%。的抑制剂，得到浓缩菌种培养液； (2) 将固体吸附载体过40目筛后，在121°C高温下灭菌20min-30min ; (3) 按照固液比为1:3?1:1的比例向浓缩菌种培养液投加固体吸附载体，混合均匀并 进行30°C -40°C恒温干燥其含水率为6wt%?10wt%得到固态菌剂，其中固液比单位为g/ mL ； (4) 向所述固态菌剂内加入lwt%。?2wt%。的铁粉脱氧剂，混合均匀后密封保存； 所述的抑制剂为山梨酸钾或苯甲酸钠中的一种； 所述的固体吸附载体为燕麦糠、米糠、玉米粉、玉米胚芽柏、麦麸、蔗渣、滑石粉、硅藻 土、锯末、膨润土、沸石粉中的一种或几种的混合物。
2. 如权利要求1所述的一种固态菌剂的制备方法，其特征在于：所述浓缩菌种培养液 可通过离心、沉降、膜过滤中的任何一种方法制备。
3. 如权利要求1所述一种固态菌剂的制备方法，其特征在于：所述铁粉脱氧剂为还原 性铁粉、活性炭和氯化钠按照质量比为8:2:1比例混合的混合物。
【文档编号】C12N1/04GK104371925SQ201410551305
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】官赟赟, 顾锡慧, 雷太平, 张艳芳, 滕厚开, 陈军, 李立峰 申请人:中国海洋石油总公司, 中海油天津化工研究设计院, 中海油能源发展股份有限公司