一种实时定量荧光rt-pcr检测马尾松ggpps基因相对表达量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法，通过马尾松GGPPS基因特异性上、下游引物：P-GGPPS-F:5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'；P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'，采用实时定量荧光RT-PCR技术检测样本中GGPPS基因相对表达量。本发明建立的检测马尾松GGPPS相对表达量的方法，可以特异性的检测分析马尾松针叶、茎、根系等类型组织样本中的GGPPS基因相对表达量，重复性好，可为选育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基础和技术支持。
【专利说明】-种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达 量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种通过逆转录mRNA样品得到cDNA(RT)，再设计 特异引物结合实时定量荧光PCR检测技术检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法。
【背景技术】
[0002] 针叶树可分泌大量以萜烯类化合物为主要成分的有特定气味的树脂，也称之为松 月旨，是重要的工业原料，长期以来为人们所研究和开发利用。马尾松是我国最主要的采脂树 种，我国有90 %以上的松脂是采自马尾松。
[0003] 萜烯类的生物合成途径有两条。一条为甲羟戊酸途径，另一条途径为甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径。其中栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合酶（GGPPS)是萜烯类物质合成的一 个重要分支酶，催化GPP与2个IPP缩合成GGPP，GGPP为二萜、类胡萝卜素、赤霉素及叶绿 素侧链等的形成提供C20骨架。在松脂成分中，松香含量占70 % -75 %，而松香的主要成分 树脂酸正是一类二萜化合物，GGPP是树脂酸的直接前体。在松脂合成部位的显微观察中发 现，松脂的主要合成部位是质体，结合萜类合成途径分析，细胞质、线粒体、质体中分别侧重 不同的萜类合成，其中质体中特有的萜类合成途径包括GGPP的合成以及GGPP下游的二萜 合成，这与松脂的主要成分为二萜树脂酸相符。此外，萜类的合成为次级代谢，在植物代谢 旺盛时次级代谢才会相应的增强，叶绿素是植物光合作用的主要功能基团，并且有研究发 现松树针叶中叶绿素的含量与松树产脂力存在着密切的关系，与普通马尾松类型相比较， 马尾松高产脂无性系的叶绿素含量极显著提高，而GGPP是叶绿素的骨架，直接影响叶绿素 和合成。综合以上研究结果，GGPPS基因的表达丰度在一定程度上反映了植物二萜合成链 的活跃程度，GGPPS基因表达水平相对较高的马尾松植株，其体内的二萜化合物合成相对 较多，产脂力可能相对较高GGPPS很可能与产脂力具有相关性。本发明建立的检测马尾松 GGPPS相对表达量的方法，可为选育高产脂力马尾松优良品种提供分子辅助育种的理论基 础和技术支持。
[0004] 荧光定量PCR利用荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通 过荧光信号和反应循环数计算比较样品模板的初始浓度。荧光定量PCR对扩增过程中的应 该信号进行全程实时检测，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰，是一种便 捷可靠的新定量检测技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的提供一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量 的方法。该方法针对目的基因序列设计特异引物，并采用实时定量荧光RT-PCR方法检测， 具有灵敏度高，特异型强、快速准确易于标准化等优点。
[0006] 本发明是这样实现的：
[0007] -种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法，包括引物的 设计、总RNA的提取与纯化、cDNA第一链的合成、实时荧光定量PCR和相对表达量的计算， 得到马尾松GGPPS基因相对表达量，具体操作步骤如下：
[0008] (1)引物的设计：针对马尾松GGPPS基因（KF278944. 1)设计用于检测的目的基因 特异性引物序列如下：
[0009] P-GGPPS-F:5,-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3，；
[0010] P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3' 。
[0011] 根据马尾松actin基因（KF910086. 1)设计用于检测的内参基因特异性引物，序列 如下：
[0012] P-actin-F:5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3' ；
[0013] P-actin-R:5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3' 。
[0014] (2)总RNA的提取与纯化：采用常规的RNA提取和纯化的方法，从马尾松的植物组 织样本中提取得到纯化的总RNA。
[0015] (3)cDNA第一链的合成：以马尾松的组织样品的总RNA为模板，采用常规方法合成 cDNA第一链。
[0016] (4)实时荧光定量PCR:采用ABISybrGreenPCRMasterMix(2X)试剂盒按常 规方法进行，以上述步骤（3)合成的cDNA第一链为模板，采用步骤（1)中的P-GGPPS-F、 P-GGPPS-R、P-actin-F、P-actin-R为引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个样品设3 个平行重复。
[0017] 实时荧光定量PCR扩增体系参数详见表1。
[0018] 表1 :实时荧光定量PCR扩增体系参数
[0019]
【权利要求】
1. 一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达量的方法，其特征在于：采用针对马尾松GGPPS基因和actin基因序列设计特异引物进行实时定量荧光PCR检测， 包括引物的设计、总RNA的提取与纯化、cDNA第一链的合成、实时荧光定量PCR和相对表达 量的计算，得到马尾松GGPPS基因相对表达量。
2. 根据权利要求1所述的一种实时定量荧光RT-PCR检测马尾松GGPPS基因相对表达 量的方法，特征在于：所述的特异引物由符合荧光定量PCR反应特点的马尾松GGPPS基因特 异性上、下游引物和马尾松actin基因特异性上、下游引物组成，两对引物序列分别是： P-GGPPS-F: 5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'； P-GGPPS-R: 5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'； P-actin-F: 5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3' ； P-actin-R: 5，-AACCGCCACTGAGCACAATA-3,。
【文档编号】C12Q1/68GK104357556SQ201410556826
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】陈博雯, 杨章旗, 贾婕, 刘海龙, 覃子海 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院