一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于蔬菜分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用。本发明通过选择合适的亲本杂交得到F1植株，播种该F1种子，将F1植株套袋自交和回交得到F2及BC1分离群体，通过构建萝卜叶浅裂基因池和叶全裂基因池、设计特异引物、PCR以及回收、克隆、测序等步骤，筛选得到与萝卜叶缘缺裂基因紧密连锁的分子标记HY-18，该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了该分子标记的制备方法。本发明制备的分子标记可用于萝卜叶缺裂群体分析，为萝卜分子育种提了实用标记和方法。
【专利说明】-种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蔬菜分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种适用于检测萝卜叶缘裂刻 性状的分子标记及应用。所述的分子标记可以作为萝卜叶缘裂刻性状育种的标记，为培育 遗传稳定的叶缘裂刻萝卜新品种提供分子标记。
【背景技术】
[0002] 叶片是植物进行光合作用、呼吸作用和蒸腾作用的主要器官，影响植物的光合效 率、产量及其品质等。植物叶片形态由叶形、叶尖、叶基及叶缘等几个部分组成，其中叶缘具 有全缘、锯齿、裂刻、波浪等形状。叶缘的适度裂刻可改变植株的株型，提高群体的通风性、 透光性及整个植株的光能利用率，同时在一定程度上抑制病虫害的发生，并且有利于植物 对高温、干旱等逆境的适应性。
[0003] 萝卜（Raphanus sativus L.)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，是重要的蔬 菜作物。传统的萝卜叶形主要分为全缘叶和羽状裂叶，而叶缘裂刻全裂的萝卜叶形是萝卜 种质资源多样性的表现，由于全裂叶对全缘叶的为显性表现，其可以作为萝卜杂交育种中 假杂种筛选的辅助性状进行利用。与传统表型选择相比，可在植物生长的任何时期，不受环 境条件的影响，并且可以排除等位基因互作而造成的干扰，具有快速、经济，高效，准确等优 点。在萝卜叶缘全裂育种过程中，将分子标记技术和回交育种相结合是一种全新的萝卜育 种途径，可以借助分子标记对叶缘全裂性状的基因型进行直接而快速地前景选择，排除环 境和外界因素的影响。同时对背景进行选择，加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻 连锁累赘。
[0004] 植物叶缘裂刻目的性状的定位方面，主要集中在拟南芥和番茄等植物上，而对芸 薹属植物中叶缘裂刻性状的研究还较少。惠麦侠等（惠麦侠等.白菜叶缘裂刻近等基因 系的CDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化.中国农业科学，2010,43(21) :4447-4454)利用 cDNA-ALP技术，开发了一条与裂刻紧密连锁的SCAR标记用于裂叶纯合和杂合的分子辅助 选择。邓杰等（邓杰等.控制大白菜和白菜型油菜叶缘裂刻的QTL定位及分析.园艺学 报，2012.，39 (4) : 661-668)通过构建白叶缘裂刻BC2DH群体，在A03和AlO上各存在一个 与白菜叶缘裂刻相关的QTL。然而目前关于萝卜叶缘裂刻的分子标记尚未见报道，目前也没 有利用分子标记辅助选择对萝卜叶缘裂刻的育种选择也未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于获得一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记。所述的分 子标记可以作为萝卜叶缘裂刻育种标记，为培育遗传稳定的叶缘裂刻萝卜新品种提供分子 记。
[0006] 本发明利用分子标记与集团混合法（BSA)相结合，寻找叶缘裂刻萝卜的AFLP标 记，并将其转化为更稳定的显性SCAR标记，为萝卜叶缘裂刻性状的筛选提供一种简单、快 速和有效的辅助选育方法。
[0007] 本发明通过以下方案实现：
[0008] 申请人:通过试验获得一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的SCAR分子标记，它的 核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。
[0009] 申请人:提供了一种制备萝卜叶缘裂刻性状检测的SCAR分子标记的方法，其按照 以下步骤：
[0010] DF2分离群体的获得：以叶缘浅裂萝卜"武青一号"为母本（购自武汉市武蔬种 业），以叶缘全裂萝卜"新洲花叶"（购自武汉市新洲区惠农种子批发部）为父本，进行杂交 得到F1，将F1植株套袋自交、回交，得到F2和BC1分离群体；
[0011] 2)构建F2分离群体的基因池：
[0012] 米用集团混合法（bulked segregation analysis,简称BSA，参见文献Michelmore R W等，Identification of markers linked to disease resistance gene by bulked segr egant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions usi ng segregating population, Pro. Natl. Acad. Sci. , USA, 88:9829-9832)，构建叶浅裂 DNA 池和叶全裂DNA池两个基因池；
[0013] 3)将两亲本间有差异的引物对，对上述步骤2)构建的两个基因池进行PCR扩增， 选择在两个基因池中表现有差异的引物组合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4进一步对基因池 间各单株的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测，确定筛选出的引物组合EA1/MC8为叶缘 裂刻性状的连锁标记，再对F 2分离群体的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测；
[0014] 其中：
[0015] 两亲本间有差异的引物对的DNA序列如下所示：
[0016] EAl: 5，-GAC TGC GTA CCAATT CAAA-35 MC8; Si-GAT GAG TCC TOA GTAACT 0-35 ；
[0017]
【权利要求】
1. 一种适用于检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。
2. -种扩增权利要求1所述的分子标记的引物对，其DNA序列如下所示： 正向引物 5 ' -ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3 '， 反向引物 5' -AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3'。
3. -种制备检测萝卜叶缘裂刻性状的分子标记的方法，其特征在于下列步骤： 1) 以萝卜"武青一号"为母本，以萝卜"新洲花叶"为父本进行杂交得到杂种F1，将所得 的F1植株套袋自交、回交，得到F 2和BC1分离群体； 2) 采用集体混合法构建萝卜叶浅裂DNA池和叶全裂DNA池； 3) 将两亲本间有差异的引物对，对上述步骤2)构建的两个基因池进行PCR扩增，选择 在两个基因池中表现有差异的引物组合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4进一步对基因池间各 单株的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测，确定筛选出的引物组合EA1/MC8为叶缘裂刻 性状的连锁标记，再对F 2分离群体的DNA样品进行PCR扩增和电泳检测； 其中： 两亲本间有差异的引物对的DNA序列如下所示： EAl :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM A-3' MC8 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3'； EA2 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM T-3' MG7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGT 03'； EA2 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA2 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3' MC7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACTC-3'； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3' MC3 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA 03'； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC2 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T_3' ； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3' MC4 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G_3'； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA3 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC12 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACC G_3'； EA3 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC14 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACG T_3'； EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MCI :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA A_3' EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MC2 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T_3'； EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3' MC4 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G_3'； EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MC5 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT A_3' ； EA4 :5, -GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3， MCll :5, -GAT GAG TOC TGA GTA ACC 03,； EA4 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MC16 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACG G_3'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MC7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT 03'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MC8 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G_3'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MG16 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGG G_3'； EA6 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3' MC14 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACG T_3'； EA6 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3' MC15 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACG 03'； EA6 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3' MG8 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGT G_3'； EA6 :5, -GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3， MG13 :5, -GAT GAG TCC TGA GTA AGG T_3,； EA7 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT C-3' MG13 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGG T_3'； EA7 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT C-3' MG15 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGG 03'； EA8 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT G-3' MC7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C_3'； EA8 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT G-3' MG9 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGC A_3'； EAll:5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAC C-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA14 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAG T-3' MG16 :5'_GAT GAG TCC TGA GTA AGG G. -3' 4) 将步骤3)筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状紧密连锁的AFLP标记引物组合EA1/MC8 的片段进行回收、克隆、测序，所得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所 示； 其中：EA1/MC8引物组合的序列如下： EAl :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CAA A-3'， MC8 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3'。 5) 通过对步骤4)测序结果进行特异引物的设计，将筛选得到的与萝卜叶缘缺刻性状 紧密连锁的AFLP标记转化为SCAR标记引物，该SCAR标记引物的DNA序列如下所示； 正向引物 5 ' -ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3 '， 反向引物 5' -AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3'。
4. 权利要求1所述的分子标记在辅助选择萝卜叶缘裂刻性状中的应用。
5. 权利要求2所述的引物对在辅助选择萝卜叶缘裂刻性状中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK104313149SQ201410566923
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】熊秋芳, 张雪丽, 张小康, 张雪清, 徐长城 申请人:武汉市蔬菜科学研究所