一株赭曲霉毒素a的产生菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株赭曲霉毒素A的产生菌，分类命名为：黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：9668，保藏日期为：2014年9月16日，所述菌株的最适产毒pH为7.0，最适产毒温度为25℃，静置培养5d产毒量达到最大。本发明的赭曲霉毒素A的产生菌所产赭曲霉毒素A的最适pH为7.0，最适温度为25℃，发酵5d产量达到最高，其在30℃以上虽然菌体生长良好但不会产生赭曲霉毒素A。本发明筛选的赭曲霉毒素A产生菌具有较高的毒素产量，其发酵液经纯化后可获得赭曲霉毒素A纯品，可作为赭曲霉毒素A标准品的生产菌株；亦可作为模式菌，用于涉及黑曲霉发酵生产各种代谢产物过程中，产赭曲霉毒素A菌株的检测及其产生机理的研究。CGMCC No 966820140916
【专利说明】-株赭曲霉毒素 A的产生菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，具体的说是一株赭曲霉毒素 A的产生菌。 技术背景
[0002] 赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的一类有毒次级代谢产物，该类 物质以异香豆素交联L-苯丙氨酸为基本结构，在此基础上包含多种衍生物，其中赭曲霉 素 A(0chratoxinA, 0ΤΑ)是分布最广、毒性最强的一种真菌毒素，已被国际癌症研究机构 (IARC)定为2B类致癌物。由于OTA产生菌广泛分布于自然界，同时OTA理化性质较稳定， 不易降解，因此，OTA的污染在全球范围内都比较严重，在粮食、饲料和粮谷类食物中均有检 出的报道。鉴于OTA污染的严重性和广泛性，对其生成机制、迁移及降解规律以及早期预警 的研究已成为当今的研究热点。
[0003] 目前对于OTA的生成机制已经有一定的进展，可以确认OTA的苯基丙氨酸部分来 自于莽草酸途径，二氢异香豆素部分来自于聚五酮途径。青霉和曲霉产生OTA的途径并不 相同，相比青霉，目前对于曲霉中OTA的生成机制的研究更为欠缺，对于其中OTA具体的生 成途径和催化反应还远未阐明。为了深入开展OTA的相关研究，筛选并鉴定不同种属的OTA 产生菌是当务之急。目前，已报道的OTA产生菌主要包括：青霉和曲霉这两个属。青霉属中， 鲜绿青霉（Penicillium viridicatum)、产黄青霉（Penicillium chrysogenum)、变幻青霉 (Penicillium variabile)、纯绿青霉（Penicillium polonicum)、圆弧青霉（Penicillium cyclopium)和日耳曼青霉（Penicillium nordicum)等可以产生OTA。曲霉属中，赫曲 霉（Aspergillus °C hraceus)、黑曲霉（Aspergillus niger)、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius)、佩特曲霉（Aspergillus petrakii)、洋葱曲霉（Aspergillus alliaceus)、 硫色曲霉（Aspergillus sulphureus)、蜂蜜曲霉（Aspergillus melleu)及寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus)等也能产生 0ΤΑ。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了以一株赭曲霉毒素 A的产生菌，本发明筛选的赭曲霉毒素 A产生菌 具有较高的毒素产量，其发酵液经纯化后可获得赭曲霉毒素 A纯品，可作为赭曲霉毒素 A标 准品的生产菌株；亦可作为模式菌，用于涉及黑曲霉发酵生产各种代谢产物过程中，产赭曲 霉毒素 A菌株的检测及其产生机理的研究。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一株赭曲霉毒素 A的产生菌，菌名称为：1062,分类命名为：黑曲霉（Aspergillus niger)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 9668,保藏日期为：2014年9月16日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 而且，所述菌株的最适产毒pH为7. 0,最适产毒温度为25°C，静置培养5d产毒量 达到最大。
[0008] 而且，所述菌株在20-40°C及YES固体培养基上pH在5. 0-9. 0之间时均能良好生 长。
[0009] 而且，所述菌株在30°C以上不产生赭曲霉毒素 A。
[0010] 本发明的优点和积极效果：
[0011] 1、本发明的赭曲霉毒素 A的产生菌所产赭曲霉毒素 A的最适pH为7.0,最适温度 为25°C，发酵5d产量达到最高，其在30°C以上虽然菌体生长良好但不会产生赭曲霉毒素 A。 本发明筛选的赭曲霉毒素 A产生菌具有较高的毒素产量，其发酵液经纯化后可获得赭曲霉 毒素 A纯品,可作为赭曲霉毒素 A标准品的生产菌株。
[0012] 2、本发明涉及的菌株在YES培养基中，在较短的时间内（5d)，在适合的环境条件 下，OTA产量在35 μ g/g干菌丝左右；在OTA诱导培养基中，在适当的环境条件下，OTA产量 可达500 μ g/g干菌丝以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为本发明的菌株1062菌丝体电子显微镜照片（X 400);
[0014] 图2为本发明的菌株1062的电镜照片（X 650);
[0015] 图3为本发明的产赭曲霉毒素 A的最适时间图；
[0016] 图4为本发明的产赭曲霉毒素A的最适pH值图；
[0017] 图5为本发明的产赭曲霉毒素 A的最适温度图。
[0018] 具体的实施方式
[0019] 为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性 的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0020] 本发明筛选的赫曲霉毒素 A的广生囷，名称为1062，分类命名为：黑曲霉 (Aspergillus niger)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏编号 为：CGMCC No. 9668,保藏日期为：2014年9月16日，其最适产毒pH为7. 0,最适产毒温度为 25°C，静置培养5d产毒量达到最大，在20-40°C及YES固体培养基上pH在5. 0-9. 0之间时 均能良好生长，其在30°C以上虽然菌体生长良好但不会产生赭曲霉毒素 A。
[0021] 本发明赭曲霉毒素 A的产生菌的筛选鉴定方法如下：
[0022] 1、菌株的分离和筛选：将从发霉的葡萄中分离纯化的霉菌转接到PDA平板中， 25°C培养5d，三点接种法将菌株接种到CYA和YES培养基，25°C避光培养7d，用打孔器从 菌落中心到外沿依次取直径为9mm的3块带有菌丝体的培养物放入2mL离心管中，加入 500 μ L甲醇震荡lmin，避光静置lh，用孔径0.22 μ L滤器过滤，通过HPLC-FLD及HPLC-MS 进行检测和鉴定筛选出能产赭曲霉毒素 A的菌株。
[0023] 2、菌株的初步鉴定：
[0024] ⑴根据菌落形态及显微特征鉴定，菌株在察氏培养基上整体成棕色，最外围有一 圈白色菌丝，中间颜色最深为棕色孢子，表面干燥，整体较薄无褶皱。该菌株在YES培养基 上整体呈黄色，质地薄，中心稍有凸起，菌落表面有大量褶皱呈辐射状沟纹，干燥，从内向外 分为四个部分，最中间一圈颜色呈淡黄色，向外一圈为白色，第三圈为鲜黄色，最外一圈为 白色菌丝，菌落边缘不齐，菌落表面长有大量菌丝并带有灰白色孢子；其在CYA培养基上整 体呈棕色，有大量的棕色孢子并有少许小水珠状渗出液，整体薄有大量褶皱，中间有一圆形 褶皱，褶皱从中间向外沿呈放射状，菌落最外围呈黄色乳黄色菌丝，菌落边缘整齐。菌株的 分生孢子梗细长，菌丝中存在隔膜，菌丝顶端连接分生孢子头，上面有大量孢子，属于典型 的曲霉属细胞形态。
[0025] ⑵根据ITSDNA序列通过NCBI网站上的Blast程序与Genbank中核酸数据库进行 比对，发现1062的ITSDNA序列和Aspergillus niger NJA-I的同源性达100%。菌株的 ITS DNA序列GenBank登录号为KM259827。菌株的ITS DNA序列为：>1062
[0026] TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGT CTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGC CCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTC AACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAG TGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGC CCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGC GTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCAT TCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
[0027] 结合菌株的菌落形态，微观形态及ITS DNA同源性分析等方面的区别特征，初步鉴 定菌株 1062 为黑曲霉（Aspergillus niger)。
[0028] ⑶菌株的发酵：
[0029] 孢子悬液的制备：用适量的无菌生理盐水洗下平板上新鲜、生长旺盛的孢子，然后 移入装有玻璃珠的三角瓶中，在振荡器上充分振荡，使孢子均勻分散。
[0030] 将孢子悬液以2%。的接种量接种到含有IOOmL发酵液（YES液体培养基）的锥形瓶 中，置于恒温培养箱中25°C避光培养4-7d。
[0031] ⑷HPLC-FLD检测及HPLC-MS鉴定方法：
[0032] 用孔径0· 22 μ L滤器过滤发酵液，采用Kromstar?HPLC反相C18柱（250X4. 6mm， 5 μ m);柱温：30°C ;激发波长330nm，发射波长460nm ;流动相：V (乙腈）：V (水）：V (乙 酸）=99 : 99 : 2;流速：1.0mL/min;进样量：20μ?。质谱条件：大气压电喷雾离子源 (API-ESI)，正离子扫描，多反应监测（multi-resolution mesh, MRM);毛细管电压4kV;干 燥气体温度300°C。
[0033] 本发明的赭曲霉毒素A的产生菌在YES培养基中所产赭曲霉毒素A的最适pH为 7.0,最适温度为25°C。发酵5d产量达到最高。在30°C以上虽然菌体生长良好但不会产生 赭曲霉毒素 A。
[0034] 本发明涉及的菌株在YES培养基中，在较短的时间内（5d)，在适合的环境条件下， OTA产量在35 μ g/g干菌丝左右；在OTA诱导培养基中，在适当的环境条件下，OTA产量可 达500yg/g干菌丝以上。与国内外文献中的报道相比，该菌株有两个显著的特点：一是产 毒速度快，5d即可达到最高产毒水平，而大部分报道的产毒菌的最高产毒时间都在7d甚至 14d ;二是产毒量高，远高于国内文献中普遍报道的OTA产量范围（0. 001 μ g/g干菌丝-几 十μ g/g干菌丝）。
[0035] 实施例1
[0036] ⑴菌株的筛选
[0037] 将实验室已从葡萄中分离纯化的真菌转接到PDA平板中，25°C培养5d，三点接种 法将菌株接种到CYA和YES培养基，25°C避光培养7d，用打孔器从菌落中心到外沿依次取直 径为9mm的3块带有菌丝体的培养物放入2mL离心管中，加入500 μ L甲醇震荡lmin，避光 静置lh，用孔径0. 22 μ L滤器过滤，通过HPLC-FLD及HPLC-MS进行检测和鉴定筛选出能产 赫曲霉毒素 A的囷株。
[0038] 所用培养基
[0039] PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水IOOOmL ;YES培养基：蔗糖 15g，酵母提取物20g，硫酸镁0. 5g，琼脂20g，蒸馏水IOOOmL ;CYA培养基：酵母提取物5g， 蔗糖30g，K2HP04 lg，察氏浓缩液10mL，琼脂15g ;察氏培养基：蔗糖30g，NaN03 2g，K2HP04 lg，KC10. 5g，MgS04 · 7H20 0· 5g，FeS04 · 7H20 0· Olg，琼脂 15 ?25g，蒸馏水 IOOOml。
[0040] OTA诱导培养基：葡萄糖70g，果糖30g，酒石酸7g，苹果酸10g，（NH4) 2S040 . 67g， (NH4)2HPO4O. 67g,KH2PO4L 5g, MgSO4 ·7Η200. 75g, NaClO. 75g, CaCl2O. 15g, CuCl2O. 0015g, FeSO 4 · 7H200. 021g, ZnSO4O. 0075g,儿茶素 0· 05g.
[0041] ⑵菌株的鉴定
[0042] 根据菌落形态，微观特征及ITSDNA序列分析进行系统分类
[0043] 菌株为黑曲霉（Aspergillus niger)，在察氏培养基上整体成棕色，最外围有一圈 白色菌丝，中间颜色最深为棕色孢子，表面干燥，整体较薄无褶皱。该菌株在YES培养基上 整体呈黄色，质地薄，中心稍有凸起，菌落表面有大量褶皱呈辐射状沟纹，干燥，从内向外分 为四个部分，最中间一圈颜色呈淡黄色，向外一圈为白色，第三圈为鲜黄色，最外一圈为白 色菌丝，菌落边缘不齐，菌落表面长有大量菌丝并带有灰白色孢子；其在CYA培养基上整体 呈棕色，有大量的棕色孢子并有少许小水珠状渗出液，整体薄有大量褶皱，中间有一圆形褶 皱，褶皱从中间向外沿呈放射状，菌落最外围呈黄色乳黄色菌丝，菌落边缘整齐。菌株的分 生孢子梗细长，菌丝中存在隔膜，菌丝顶端连接分生孢子头，上面有大量孢子。菌株的ITS DNA序列分析对比与黑曲霉（Aspergillus niger)的亲缘性最高。
[0044] 3、菌株的发酵
[0045] 孢子悬浮液的制备：用适量的无菌生理盐水洗下平板上新鲜、生长旺盛的孢子，然 后移入装有玻璃珠的三角瓶中，在振荡器上充分振荡，使孢子均勻分散。
[0046] 将孢子悬液以2%。的接种量接种到含有IOOmL发酵液（YES液体培养基）的锥形瓶 中，置于恒温培养箱中25°C避光培养4-7d。
[0047] 4、赭曲霉毒素 A的检测及鉴定方法
[0048] 1、用孔径0. 22 μ L滤器过滤发酵液，通过HPLC-FLD及HPLC-MS进行检测和鉴定 赭曲霉毒素 Α。所用方法如下：采用KromstarTM HPLC反相C18柱（250X4. 6mm，5ym); 柱温：30°C;激发波长330nm，发射波长460nm;流动相：V(乙腈）：V(水）：V(乙 酸）=99 : 99 : 2;流速：1.0mL/min;进样量：20μ?。质谱条件：大气压电喷雾离子源 (API-ESI)，正离子扫描，多反应监测（multi-resolution mesh, MRM);毛细管电压4kV;干 燥气体温度300°C。
【权利要求】
1. 一株赭曲霉毒素A的产生菌，其特征在于：菌名称为：1062,分类命名为：黑曲霉 (Aspergillus niger)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏编号 为：CGMCC No. 9668,保藏日期为：2014年9月16日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号。
2. 根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的产生菌，其特征在于：所述菌株的最适产毒 pH为7. 0,最适产毒温度为25°C，静置培养5d产毒量达到最大。
3. 根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的产生菌，其特征在于：所述菌株在20-40°C及 YES固体培养基上pH在5. 0-9. 0之间时均能良好生长。
4. 根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的产生菌，其特征在于：所述菌株在30°C以上 不产生赭曲霉毒素A。
【文档编号】C12N1/14GK104388318SQ201410577019
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】张健, 王小霞, 张颖, 高强, 王德培 申请人:天津科技大学