一种木聚糖酶的液态深层发酵方法
【专利摘要】本发明提供了一种木聚糖酶的液态深层发酵方法，属于生物酶制剂生产【技术领域】。本发明以玉米芯为主要原料，利用玉米芯稀酸汽爆料水浸液为诱导物来源，采用黑曲霉液态深层发酵法，包括：a）菌种的制备及扩大培养，b）补料发酵培养，c）木聚糖酶的提纯和d）发酵液残渣的处理，特别地，在b）补料发酵过程中连续流加玉米芯稀酸汽爆料水浸液为诱导的培养基，同时在一个发酵周期内间歇排出发酵醪液，经板框过滤，超滤浓缩，添加防腐剂后，得液体木聚糖酶产品。本发明所得木聚糖酶酶活力提高60~70%，产量提高40~50%，在原料消耗及能耗不增加的情况下，大幅度提高产品酶活力和出产率，增加产能，提高设备利用率，降低单位酶活力发酵成本。
【专利说明】一种木聚糖酶的液态深层发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物酶制剂生产【技术领域】，具体地涉及一种木聚糖酶的液态深层发酵方法。
【背景技术】
[0002]木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括外切β-1，4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和β_木聚糖酶。木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织、医药及能源等领域有着广泛的应用。木聚糖酶用作饲料酶制剂，可以有效解除木聚糖的抗营养作用，促进畜禽对粗饲料的消化吸收。木聚糖酶作为新型的纸浆漂白助剂，降低漂白用氯，解决纸浆工业中的环境污染问题。在纤维素燃料乙醇的生产实践中，添加木聚糖酶可剥离木质素与纤维素之间的聚合态，易于酶解过程中的酶与底物的充分接触，利于酶解反应的发生，同时能够分解半纤维素成为酵母可利用的单糖，提高出酒率，降低纤维乙醇的成本。随着纤维素乙醇产业化进程的加快，木聚糖酶的开发研究更加备受关注。
[0003]木聚糖酶的生产菌种主要由细菌、真菌和霉菌。其中，霉菌具有许多表达木聚糖酶的基因，产酶水平高于酵母菌和细菌，在木聚糖酶的发酵方面应用最为广泛。木聚糖酶主要通过以上微生物发酵生产获得，根据发酵工艺的不同，可分为固态发酵和液态发酵两种。固态发酵是传统的发酵方式，菌种大多是霉菌，具有控制简单、成本较低、无污染、产率较高等优点，但是固态发酵同时也存在以下缺点:不易控制，酶系复杂，纤维素等酶含量高，难以精酶化等。液态深层发酵是液态发酵的常用发酵方式，已经成为发酵工业的主导方式，该方法便于在生产过程中进行实时检测、控制，易于扩大生产规模。同时，由于液体输送方便，便于机械化操作，产品也易于提取精制。
[0004]CN 101182470 A公开了一种制备木聚糖酶的液态深层发酵方法，采用黑曲霉发酵法，其特征在于将适量黑曲霉菌株无菌条件下接入不锈钢母罐中，生产发酵罐加入发酵培养基至罐体积70?75% ;培养发酵:30°C，15(T200r/min，通风0.Γ?.5VVM，70?80Η，在发酵中后期4(Γ60Η之间补充营养物质；停止发酵:发酵至7(Γ80Η，依据镜检菌体形态，若菌体开始自溶即停止发酵；发酵液主要有三种处理方式:酶粗品的盐析法和喷雾干燥法，絮凝-超滤法制得精制固体酶和精制液态酶。液态深层发酵比固态发酵的酶活力要高出1(Γ30%，粗酶每吨生产成本降低20%以上。该发明所得木聚糖酶的酶活力提高有限，可能是由于产酶阶段发酵罐中的诱导物对木聚糖酶合成的促进作用不明显导致的。
[0005]高效生产木聚糖酶的因素有很多，关键因素是选择合适的诱导底物和最佳培养基组成。在发酵过程中，还有一些因素影响着木聚糖酶的产生，如底物的可接近性、低聚木糖的释放速率和数量及化学特性，还有所能产生的木糖量等。若酶与底物结合得紧密，则会有一部分木聚糖酶因结合在不溶性底物上而在处理酶液时被丢失。因此酶与底物结合的紧密程度也会影响到木聚糖酶的产量。另外，微生物菌体本身产生的代谢酶(如蛋白酶、糖苷转移酶等)都会影响到木聚糖酶的产量。
[0006]我国具有丰富的玉米芯、甘蔗渣、小麦麸、秸杆等富含半纤维素类自然资源的农林废弃物，长期以来未受到充分重视和开发利用。而现有技术生产木聚糖酶的成本仍比较高，而大多数合成原料价格又比较贵，如何利用廉价的纤维素材料高效生产木聚糖酶是研究者和生产者关注的重点。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种木聚糖酶液态深层发酵方法，在原料消耗及能耗不增加的情况下，大幅度提高产品酶活力和出产率，增加产能，提高设备利用率，降低单位酶活力发酵成本。
[0008]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种木聚糖酶的液态深层发酵方法，以玉米芯为主要原料，采用黑曲霉液态深层发酵法，具体包括以下步骤:
a)菌种的制备及扩大培养:将黑曲霉菌株Aspergillusniger CGMCC N0.5833转接至PDA斜面培养基上，30 0C，培养4天，得到斜面孢子；然后用无菌水洗涤所述斜面孢子，得到孢子洗涤液；在无菌条件下将所述孢子洗涤液接入已灭菌的三角瓶种子培养基(121?124。。，灭菌30min)中，于180?220r/min，28?32°C条件下，培养18?24h，得活化菌种；将所述活化菌种以0.3、.5% (v/v)的接种量接入一级种子罐中，于28?32°C，通气比1:
0.6、.8 (v/v)的条件下，培养If 20h，得到一级种子液；将所述一级种子液以8?10% (v/V)的接种量接入二级种子罐，于28?32°C，通气比1:0.6、.8 (v/v)的条件下，培养8?12h，得到二级种子液；
b)补料发酵培养:在发酵罐中加入发酵基础培养基，装料系数为5(Γ60%(ν/ν)，调节pH值为4.5^5.0,于12f 124°C，灭菌30min ;待培养基温度降至30°C，在无菌条件下，以发酵培养基体积的10?15%的接种量接入所述二级种子液，接种后(TlOh，通气比为1:0.6?1.5(v/V)，搅拌转速为15(T200r/min，培养温度为30?32°C;接种1h以后，通气比1:0.5?1.0 (v/V)，搅拌转速10(T200r/min，培养温度28?30°C ;当还原糖浓度在0.1% (w/w)以下时，开始加入补料培养基进行补料，补料速率为每小时补料量为发酵培养基的1.2^1.6%(w/w)，控制还原糖的浓度在0.2% (w/w)以下；当发酵液体积达到发酵罐体积的80%时进行排料，至发酵液体积达发酵罐体积的70%时停止排料，一个发酵周期内重复排料操作，发酵周期为5?7天;
c)木聚糖酶的提纯:发酵结束，将发酵液经板框压滤机进行过滤，所得过滤液用有机膜进行超滤，浓缩至所需倍数；然后加入防腐剂，得液体木聚糖酶产品；
d)发酵液残渣的处理:将经过板框压滤机所得的发酵液残渣进行烘干处理，使之含水量为10?15% (w/w)，作为饲料添加剂使用。
[0009]步骤a)中所述三角瓶种子培养基、一级种子罐及二级种子罐的组成均为，以质量百分比计，葡萄糖1.5%，麸皮4%，玉米浆1%，酵母粉0.5%，余量为水；
步骤b)中所述发酵基础培养基组成为，以质量百分比，玉米芯5.(Γ7.0%，麸皮
1.0?2.0%，玉米浆1.5?3.0%，硫酸铵0.4?0.6%，磷酸二氢钾0.2?0.4%，硫酸镁0.1?0.3%，氯化钙0.05、.15%，微量元素0.05、.2%，余量为水。
[0010]进一步的，所述玉米芯的粒度小于0.5mm。
[0011]步骤b)中所述补料培养基组成为，质量百分比计，葡萄糖3.(Γ5.0%，玉米浆
2.0?3.0%，硫酸铵0.6?0.8%，磷酸二氢钾0.4?0.8%，硫酸镁0.2?0.4%，氯化钙0.1?0.3%，微量元素0.05、.1%，其余为玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
[0012]进一步的，所述微量元素的组成为，质量百分比计，钥酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%，余量为水。
[0013]进一步的，所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通过如下制备方法获得的:将粒度小于1mm的玉米芯，于0.5?1.0% (w/w)的硫酸溶液中浸泡,6?1kg压力下保持10?15min,进行汽爆处理，然后添加水分，使汽爆处理后的玉米芯固形物含量保持在6?10% (w/w)，浸泡f2h，利用板框压滤机进行过滤，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
[0014]进一步的，步骤c)中所述有机膜为膜分子量为10000道尔顿的有机膜。
[0015]进一步的，步骤c)中所述防腐剂的组分配比为:氯化钠7g?10g，苯甲酸钠
0.1g?0.3g。
[0016]由于本发明一种木聚糖酶的液态深层发酵方法，包括a)菌种的制备及扩大培养，
b)补料发酵培养，c)木聚糖酶的提纯和d)发酵液残渣的处理，该方法无废弃物排出，环保无污染，具有以下有益效果:
(O该方法能够在原料消耗及能耗不增加的情况下，增加产能，提高设备利用率，降低单位酶活力发酵成本，所得产品的酶活力提高6(Γ70%，出产率提高4(Γ50% ；
(2)本发明以玉米芯为主要原料通过液态深层发酵生产木聚糖酶，为玉米芯的综合开发与利用提供了新方法和新途径；
(3)本发明在补料过程中所采用的玉米芯稀酸汽爆料水浸液中含有一定量的低聚木糖，在木聚糖酶的发酵过程中有利于诱导黑曲霉菌株产酶；与以往直接以粉碎后的玉米芯补料相比，降低了玉米芯的粉碎成本，同时以液体方式补料避免了玉米芯颗粒堵塞管道的风险；
(4)本发明所采取的连续流加、间歇放料模式，可有效解除发酵过程中营养物质的匮乏及产物的反馈抑制，提高木聚糖酶的发酵水平；
(5)本发明所用原料玉米芯为可再生资源，且来源广泛，价格低廉，以其为原料发酵生产木聚糖酶，不仅能够变废为宝，而且还降低了木聚糖酶的生产成本，所得残渣还可做饲料添加剂使用。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明做一步的说明。
[0018]实施例一
下面以1m3发酵罐为例对本发明做进一步详细地说明。
[0019]本发明木聚糖酶的液态深层发酵方法，以玉米芯为主要原料，采用黑曲霉液态深层发酵法，可按以下步骤进行:
a)菌种的制备及扩大培养:将黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833转接至PDA斜面培养基上，于30°C条件下培养4天，得到斜面孢子；然后用无菌水洗涤所述斜面孢子，得到孢子洗涤液；在无菌条件下将所述孢子洗涤液接入已灭菌的三角瓶种子培养基(121?124°C下，灭菌30 min)中，摇床转速为180r/min，28°C条件下培养24h，得活化菌种；将所述活化菌种以0.3% (v/v)的接种量接入一级种子罐中，于28°C,通气比1:0.8 (v/v)的条件下，培养20h，得到一级种子液；将所述一级种子液以8% (v/v)的接种量接入二级种子罐，于28°C，通气比1:0.6 (v/v)的条件下，培养10h，得到二级种子液；此步骤中，所述的三角瓶种子培养基、一级种子罐及一级种子罐的组成均为，以质量百分比，葡萄糖1.5%，麸皮4%，玉米浆1%，酵母粉0.5%，余量为水；
b)补料发酵培养:在1m3发酵罐中，装入5m3发酵基础培养基(以质量百分比计，粒度小于0.5mm的玉米芯6.0%，麸皮1.0%，玉米浆2.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.12%，微量元素0.05%，余量为水)，将所述发酵基础培养基的pH值调节为5.0，于12f 124°C下灭菌30min ;待培养基温度降至30°C，在无菌条件下，以发酵培养基体积10%的接种量接入所述二级种子液，接种后6h，通气比为1:0.6(v/v)，搅拌转速为200r/min，培养温度为320C ;接种后20h，通气比为1:0.5 (v/v)，搅拌转速为150r/min，培养温度为29°C ;发酵35h时，还原糖浓度为0.05%(w/w)，加入补料培养基进行补料，补料速率为60L/h,还原糖的浓度控制在0.15% (w/w);当发酵液体积达到8m3时,开始进行排料,至发酵液体积达7m3时，停止排料；一个发酵周期内重复排料操作，发酵周期为6天；
其中，所述补料培养基的质量百分比组成为，葡萄糖3.0%，玉米浆2.5%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.3%，氯化钙0.1%，微量元素0.08%,其余为玉米芯稀酸汽爆料水浸液，调节PH值为4.7，于12fl24°C下灭菌30min。所述微量元素的质量百分比组成为，钥酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通过如下制备方法获得的:将粒度小于1mm的玉米芯，于0.7%(w/w)硫酸溶液中浸泡，8kg压力下保持12min，进行汽爆处理，然后添加一定量的水分，使处理后的玉米芯固形物含量保持在8% (w/w)，浸泡1.5h，利用板框压滤机进行过滤，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提纯:发酵结束，将发酵液经板框压滤机进行过滤，所得过滤液用膜分子量为10000道尔顿的有机膜进行超滤，浓缩至所需倍数；然后加入防腐剂，其组分配比为氯化钠7g，苯甲酸钠0.lg，得液体木聚糖酶产品；
d)发酵液残渣的处理:将经过板框压滤机所得的发酵液残渣进行烘干，使之含水量在10% (w/w)，作为饲料添加剂使用。
[0020]木聚糖酶的酶活力单位统一定义(U):在pH=4.8，50°C条件下，每分钟降解底物生成I μ moL木糖所需的酶量为I个活力单位。
[0021]经测定，本实施例所得木聚糖酶的酶活力为2568.35U/mL，单罐单批发酵液总量12.4吨；与现有的木聚糖酶液态深层发酵工艺相比，木聚糖酶的酶活力提高了 60%，出产率提高40%，单位酶活力发酵成本降低8%。
[0022]实施例二
下面以20m3发酵罐为例对本发明做进一步详细地说明。
[0023]本发明木聚糖酶的液态深层发酵方法，以玉米芯为主要原料，采用黑曲霉液态深层发酵法，可按以下步骤进行:
a)菌种的制备及扩大培养:将黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833转接至PDA斜面培养基上，于30°C条件下培养4天，得到斜面孢子；然后用无菌水洗涤所述斜面孢子，得到孢子洗涤液；在无菌条件下将所述孢子洗涤液接入已灭菌的三角瓶种子培养基(121?124°C下，灭菌30 min)中，摇床转速为200r/min，30°C条件下培养20h，得活化菌种；将所述活化菌种以0.5% (v/v)的接种量接入所述一级种子罐中，于30°C，通气比1:0.7的条件下，培养18h，得到一级种子液；将所述一级种子液以10% (v/v)的接种量接入二级种子罐，于30°C，通气比1:0.7的条件下，培养12h，得到二级种子液。其中，所述的三角瓶种子培养基、一级种子罐及二级种子罐的组成均为:以质量百分比，葡萄糖1.5%，麸皮4%，玉米浆1%，酵母粉0.5%，余量为水；
b)补料发酵培养:在20m3发酵罐中，装入发酵基础培养基12m3(以质量百分比，粉碎粒度小于0.5mm的玉米芯7.0%，麸皮1.5%，玉米浆3.0%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.2%，氯化钙0.05%,微量元素0.1%，余量为水)，将上述培养基调节pH值为4.8，于12f 124°C下灭菌30min，；待培养基温度降至30°C，在无菌条件下，以发酵培养基体积的12% (v/v)的接种量接入所述二级种子液,接种后9h,通气比为1:1，搅拌转速为160r/min,培养温度为30°C;接种后15h，通气比为1:0.8，搅拌转速为110r/min，培养温度为28°C;发酵32h，还原糖浓度为0.08%，加入补料培养基进行补料，补料速率为每小时补料量为发酵基础培养基1.4% (w/w),还原糖控制在0.1% (w/w);当发酵液体积达到发酵罐体积的80%时进行排料，至发酵液体积达发酵罐体积的70%时停止排料，一个发酵周期内重复排料操作，维持发酵液体积在发酵罐体积的70%之间，发酵周期为7天；
其中，所述补料培养基的质量百分比组成为，葡萄糖4.0%，玉米浆2.0%，硫酸铵0.7%，磷酸二氢钾0.7%，硫酸镁0.4%，氯化钙0.2%，微量元素0.06%,其余为玉米芯稀酸汽爆料水浸液，调节PH值为4.5，于12f 124°C下灭菌30min。所述微量元素的质量百分比组成为，钥酸铵0.04%,硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通过如下制备方法获得的:将粒度小于1mm的玉米芯，于0.5%(w/w)硫酸溶液中浸泡，6kg压力下保持lOmin，进行汽爆处理，然后添加一定量的水分，使处理后的玉米芯固形物含量保持在6% (w/w)，浸泡lh，利用板框压滤机进行过滤，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提纯:发酵结束，将发酵液经板框压滤机进行过滤，所得过滤液用膜分子量为10000道尔顿的有机膜进行超滤，浓缩至所需倍数；然后加入防腐剂，其组分配比为氯化钠8g，苯甲酸钠0.2g，得液体木聚糖酶产品；
d)发酵液残渣的处理:将经过板框压滤机所得的发酵液残渣进行烘干，使之含水量在13% (w/w)，作为饲料添加剂使用。
[0024]经测定，本实施例所得木聚糖酶的酶活力为2968.04U/mL，单罐单批发酵液总量32.5吨；与现有的木聚糖酶液态深层发酵工艺相比，木聚糖酶的酶活力提高了 65%，出产率提高46%，单位酶活力发酵成本降低6%。
[0025]实施例三
下面以50m3发酵罐为例对本发明做进一步详细地说明。
[0026]本发明木聚糖酶的液态深层发酵方法，以玉米芯为主要原料，采用黑曲霉液态深层发酵法，可按以下步骤进行:
a)菌种的制备及扩大培养:将黑曲霉菌株niger CGMCC N0.5833转接至PDA斜面培养基上，于30°C条件下培养4天，得到斜面孢子；然后用无菌水洗涤所述斜面孢子，得到孢子洗涤液；在无菌条件下将所述孢子洗涤液接入已灭菌的三角瓶种子培养基(121?124°C下，灭菌30 min)中，摇床转速为220r/min，32°C条件下培养18h，得活化菌种；将所述活化菌种以0.4% (v/v)的接种量接入所述一级种子罐中，于32°C，通气比1:0.6的条件下，培养20h，得到一级种子液；将所述一级种子液以9% (v/v)的接种量接入二级种子罐，于32°C，通气比1:0.8的条件下，培养8h，得到二级种子液。其中，所述三角瓶种子培养基、一级种子罐及二级种子罐的组成均为:以质量百分比，葡萄糖1.5%，麸皮4%，玉米浆1%，酵母粉0.5%，余量为水；
b)补料发酵培养:在60m3发酵罐中，装入发酵基础培养基36m3(以质量百分比，粉碎粒度小于0.5mm玉米芯5.0%，麸皮2.0%，玉米浆1.5%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.3%，氯化钙0.15%，微量元素0.2%，余量为水)，将上述培养基调节pH值为4.5，于12f 124°C下灭菌30min ;待培养基温度降至30°C，在无菌条件下，以发酵培养基体积的15%(v/v)的接种量接入所述二级种子液,接种后4h,通气比为1:1.5,搅拌转速为150r/min,培养温度为32°C ;接种后llh，通气比为1:1，搅拌转速为100r/min，培养温度为29°C ;发酵30h，还原糖浓度为0.02%,加入补料培养基进行补料，补料速率为每小时补料量为发酵基础培养基1.6% (w/w),还原糖控制在0.12% (w/w);当发酵液体积达到发酵罐体积的80%时进行排料，至发酵液体积达发酵罐体积的70%时停止排料，一个发酵周期内重复排料操作，维持发酵液体积在发酵罐体积的80%之间，发酵周期为5天；
其中，所述补料培养基的质量百分比组成为，葡萄糖5.0%，玉米浆3.0%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.4%，氯化钙0.3%，微量元素0.1%，其余为玉米芯稀酸汽爆料水浸液，调节PH值为4.5，于12fl24°C下灭菌30min。所述微量元素的质量百分比组成为，钥酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通过如下制备方法获得的:将粒度小于1mm的玉米芯，于1.0% (w/w)硫酸溶液中浸泡，1kg压力下保持15min，进行汽爆处理，然后添加一定量的水分，使处理后的玉米芯固形物含量保持在10% (w/w)，浸泡2h，利用板框压滤机进行过滤，即得玉米芯稀酸汽爆料水浸液；
c)木聚糖酶的提纯:发酵结束，将发酵液经板框压滤机进行过滤，所得过滤液用膜分子量为10000道尔顿的有机膜进行超滤，浓缩至所需倍数；然后加入防腐剂，其组分配比为氯化钠10g，苯甲酸钠0.3g，得液体木聚糖酶产品；
d)发酵液残渣的处理:将经过板框压滤机所得的发酵液残渣进行烘干，使之含水量在15% (w/w)，作为饲料添加剂使用。
[0027]经测定，本实施例所得木聚糖酶的酶活力为3485.65U/mL，单罐单批发酵液总量97.6吨；与现有的木聚糖酶液态深层发酵工艺相比，木聚糖酶的酶活力提高了 70%，出产率提高50%，单位酶活力发酵成本降低7.5%。
【权利要求】
1.一种木聚糖酶的液态深层发酵方法，以玉米芯为主要原料，采用黑曲霉液态深层发酵法，其特征在于，它具体包括以下步骤: a)菌种的制备及扩大培养:将黑曲霉菌株nigerCGMCC N0.5833转接至PDA斜面培养基上，300C，培养4天，得到斜面孢子；然后用无菌水洗涤所述斜面孢子，得到孢子洗涤液；在无菌条件下将所述孢子洗涤液接入于12f 124°C，灭菌30min的三角瓶种子培养基中，于18(T220r/min，28?32°C条件下，培养18?24h，得活化菌种；将所述活化菌种以0.3^0.5% (v/v)的接种量接入所述一级种子罐中，于28?32°C，通气比1:0.6^0.8的条件下，培养18?20h，得到一级种子液；将所述一级种子液以8?10% (v/v)的接种量接入二级种子罐，于28?32°C，通气比1:0.6^0.8的条件下，培养8?12h，得到二级种子液； b)补料发酵培养:在发酵罐中加入发酵基础培养基，装料系数为5(Γ60%(ν/ν)，调节pH值为4.5^5.0,12Γ124°0，灭菌30min ;待培养基温度降至30°C，在无菌条件下，以发酵培养基体积的1(Γ?5%(ν/ν)的接种量接入所述二级种子液，接种后(TlOh，通气比为1:0.6?1.5，搅拌转速为15(T200r/min，培养温度为3(T32°C;接种1h以后，通气比1:0.5?1.0，搅拌转速10(T200r/min，培养温度28?30°C;当还原糖含量在0.1% (w/w)以下时，开始加入补料培养基进行补料，补料速率为每小时补料量为发酵培养基1.2^1.6%(w/w)，控制还原糖的含量在0.2% (w/w)以下；当发酵液体积达到发酵罐体积的80%时进行排料，至发酵液体积达发酵罐体积的70%时停止排料，一个发酵周期内重复排料操作，发酵周期为5?7天； c)木聚糖酶的提纯:发酵结束，将发酵液经板框压滤机进行过滤，所得过滤液用有机膜进行超滤，浓缩至所需倍数；加入防腐剂，得液体木聚糖酶产品； d)发酵液残渣的处理:将经过板框压滤机所得的发酵液残渣进行烘干，使之含水量在10?15% (w/w)，作为饲料添加剂使用。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:步骤a)中所述三角瓶种子培养基、一级种子罐及二级种子罐的质量百分比组成均为，1.5%葡萄糖，4%麸皮，1%玉米浆，0.5%酵母粉，余量为水。
3.如权利要求1所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:步骤b)中所述发酵基础培养基的质量百分比组成为，玉米芯5.(Γ7.0%，麸皮1.(Γ2.0%，玉米浆1.5^3.0%，硫酸铵0.4?0.6%，磷酸二氢钾0.2?0.4%，硫酸镁0.1?0.3%，氯化钙0.05?0.15%，微量元素0.05?0.2%，余量为水。
4.如权利要求3所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:所述玉米芯的粒度小于0.5mmο
5.如权利要求1所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:步骤b)中所述补料培养基的质量百分比组成为，葡萄糖3.(Γ5.0%，玉米浆2.(Γ3.0%，硫酸铵0.6^0.8%，磷酸二氢钾0.4?0.8%，硫酸镁0.2?0.4%，氯化钙0.1?0.3%，微量元素0.05?0.1%，其余为玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
6.如权利要求5所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:所述微量元素的质量百分比组成为，钥酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。
7.如权利要求5所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:所述玉米芯稀酸汽爆料水浸液是通过如下制备方法获得的:将粒度小于1mm的玉米芯,于0.5"?.0% (w/w)硫酸溶液中浸泡，6?10kg压力下保持l(Tl5min，进行汽爆处理，然后添加一定量的水分，使处理后的玉米芯固形物含量保持在6?10% (w/w)，浸泡f2h，利用板框压滤机进行过滤，SP得玉米芯稀酸汽爆料水浸液。
8.如权利要求1所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:步骤c)中所述有机膜为膜分子量为10000道尔顿的有机膜。
9.如权利要求1所述的木聚糖酶的液态深层发酵方法，其特征在于:步骤c)中所述防腐剂的组分配比为:氯化钠7g?10g，苯甲酸钠0.lg^0.3g。
【文档编号】C12R1/685GK104357428SQ201410638530
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】王林风, 赵子高, 闫德冉, 杨付伟, 王蕊 申请人:河南天冠纤维乙醇有限公司