一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明的公开了一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供的新型杀虫蛋白对水稻褐飞虱有高毒力，为水稻抗稻褐飞虱提供了新的策略，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因 与应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界范围内重要的粮食作物，然而水稻的病虫害严重影响了水稻的生产。 随着转CrylAb及Cry1AC等Bt蛋白水稻株系的推广种植预期可有效的防治鳞翅目和鞘 翅目害虫的危害（Shu,Yeetal. 2000,Breitler,Vassaletal. 2004,Cohen,Chenet al. 2008)。但是，也不可避免的促进了非靶标害虫昆虫如褐飞虱的种群数量和危害程度 (Chenetal. 2011)。因此，创制发展对稻褐飞虱等害虫有高毒力的新型杀虫基因迫在眉 睫。
[0003] 苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis简称Bt)是一种土壤杆菌，它在 逆境条件下会形成芽孢并产生伴胞晶体，伴孢晶体由不同种Cry蛋白组成（亦被称为 S内毒素；S-Endotoxins)，其对多鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫具有杀虫活性 (Bravo,Likitvivatanavongetal. 2011)。Cry蛋白的杀虫活性区通常由三个结构域组成， 其中结构域I主要负责在昆虫中肠膜上形成孔洞，结构域II主要负责与昆虫中肠膜上受体 结合，由此确定毒素特异性，结构域III的功能比较复杂，包括维持蛋白质的稳定性、协助 结构域I在膜上穿孔及协助结构域II与膜上受体结合等等。通过对不同Cry蛋白的结构域 II互换，会产生对某种害虫毒性增强的新的杀虫蛋白，因此通过结构域互换产生新的杀虫 蛋白的方法被广泛的应用于Cry蛋白的改造（SaraswathyandKumar2004,Florez,Osorio etal.2012) 〇
[0004] Cry蛋白的对害虫的毒力非常高，且杀虫谱很窄，某一特定的Cry蛋白通常只对 一种或几种昆虫起作用而对非靶标害虫及人畜完全无害。鉴于Cry蛋白的高效性和安全 性，Cry基因也成为目前应用最广的用于抗虫转基因作物的杀虫基因（Romeis，Meissleet al. 2006,Sanahuja,Banakaretal. 2011)。然而，目前所发现的Cry蛋白主要是针对鳞翅 目、鞘翅目和双翅目等害虫，对具有刺吸式口器的半翅目昆虫没有明显毒性（Chouguleand Bonning2012)。鉴于稻褐飞虱对水稻生产的重大危害，迫切的需要研发针对此类害虫的新 型抗性基因。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因。
[0006] 本发明提供的蛋白质，为HY151，其为用Cry54Aal的结构域II替换掉CrylAc的 结构域II得到的蛋白质，其包括CrylAc的结构域I、Cry54Aal结构域II及CrylAc结构域 III。
[0007] 根据本发明，如在此定义的通过交换CrylAc及Cry54Aal的结构域II,设计了相比 于CrylAc及Cry54Aal具有实质上改变的生化特性及杀虫活性的HY151蛋白。
[0008] 本发明所创制HY151蛋白全长为614位氨基酸，其序列1到254位氨基酸来源于 CrylAc，具有强的在昆虫中肠膜上形成空洞的能力；255到462位氨基酸来源于Cry54Aal， 具有与水稻褐飞虱中肠膜上受体特异结合的能力；463到614位氨基酸来源于CrylAc，具有 稳定蛋白空间结构等功能。其序列经NCBIBlastp分析第36-254位氨基酸具有S内毒素 结构域I特征，其序列第259-452位氨基酸具有S内毒素结构域II特征；其序列463-607 位氨基酸具有S内毒素结构域III特征。本发明所创制蛋白分子量为69037.IDa，等电点为 4. 85。本发明所创制HY151蛋白序列与NCBI数据库中已知序列比对，同源性最高为74%。
[0009] 上述蛋白质为如下a)或b)的蛋白质：
[0010] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011]b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。
[0012] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过一个或几个氨 基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0013] 编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。
[0014] 上述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
[0015] 1)其编码序列是序列表中序列1的DNA分子；
[0016] 2)其编码序列是序列表中序列3的DNA分子；
[0017] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的 DNA分子；
[0018] 4)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋 白的DNA分子。
[0019] HY151蛋白编码基因的核酸序列全长为1845bp。本发明所创制HY151基因序列 与NCBI数据库中已知序列比对，仅有41 %的部分与已提交序列有同源性，这一部分来源于 CrylAc基因。与蛋白质序列相对应的，HY151基因序列第1-762位核苷酸来自于CrylAc基 因，第763-1386位核苷酸来自于Cry54Aal基因，第1387-1845位核苷酸来自于CrylAc基 因。本序列所用密码子为水稻优势密码子。本序列亦去除了影响mRNA稳定的一些基序，包 括可能的mRNA剪切位点、可能的mRNA加PolyA位点、重复的PolyA及PolyT序列以及一些 正向或反向的重复序列。用此序列产生的转基因水稻株系可以高量的表达本基因所编码蛋 白，并提供高水平的防治害虫的能力。
[0020] 序列3为序列1的优化前序列。本优化方案适用于但不限于在水稻中高水平表达 HY151蛋白。首先本序列所用密码子为水稻最优势密码子。序列优化时同时考虑到5'非 编码区及3'非编码区对基因所转录之mRNA整体二级结构的影响，以确保mRNA具有更稳 定，更利于高效翻译其所编码的蛋白的能力。本序列亦去除了影响mRNA稳定的一些基序， 包括可能的mRNA剪切位点、可能的mRNA加PolyA位点、重复的PolyA及PolyT序列以及 一些正向或反向的重复序列。另外，为了有效的翻译起始，可能需要修饰与起始甲硫氨酸 相邻的序列，Liitcke(Liitcke,Chowetal. 1987)提出针对植物的一种合适的共有序列为： AACAAUGGC，Joshi(Joshi，Zhouetal. 1997)等提出适合单子叶植物的序列C(A/C)(A/G) CAAUGGCG，Furukawa(Furukawa,Maekawaetal. 2006)等发现了一个高效的适用于水稻的 序列GCCGCCATGG。另外，为了有效的提高翻译效率同时引入了Q序列（Sleat，Gallicet al. 1987，Gallie，Sleatetal. 1988)。应用本优化方案所得到的序列所产生的转基因水稻 株系可以商水平的表达本基因所编码蛋白，并提供商水平的防治害虫的能力。
[0021] 下述1)_4)中的任一种生物材料也是本发明保护的范围：1)含有上述核酸分子的 表达盒；2)含有上述核酸分子的重组载体；3)含有上述核酸分子的重组菌；4)含有上述核 酸分子的转基因细胞系。
[0022] 上述含有上述核酸分子的重组载体在本发明的实施例中为将序列表中序列1所 示的核苷酸插入原核表达载体pET41a的BamHI和Xhol酶切位点间得到的载体。
[0023] 上述蛋白质或上述核酸分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系 在作为Cry类杀虫剂中的应用也是本发明保护的范围。
[0024] 上述应用中，所述杀虫的对象为水稻褐飞虱。
[0025] 本发明提供新颖的工程化杀虫蛋白HY151，这一蛋白比CrylAc及Cry54Aal有实 质上的改变，包括靶标害虫品种及杀虫活力，这一蛋白的靶标害虫是且不仅限于稻褐飞虱 (BPH；Brownplanthopper；NilapavatalugensStal) 〇
[0026] 本发明近一步涉及编码此HY151蛋白的核苷酸序列，并且涉及含有这些HY151蛋 白的组合物以及配制品，它们能够抑制害虫的生存、生长以及繁殖的能力或者能够限制昆 虫相关的对作物植物的损害或损失。本发明进一步描述了制造此HY151蛋白的一种方法以 及使用这一蛋白的方法，进一步提出在转基因植物中赋予对稻褐飞虱等害虫的抗性应用。
[0027] 上述蛋白质或上述核酸分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系 在防治水稻褐飞虱和/或制备防治水稻褐飞虱产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0028] 本发明所选用改造方法为交换两个不同杀虫蛋白的某一序列区段，使其同时具有 两个杀虫蛋白的特征和优点。本发明所选用的两个杀虫蛋白其中CrylAc具有对鳞翅目昆 虫强的杀虫毒性，Cry54Aal具有对半翅目稻褐飞虱有较微弱的毒性。本发明所用两个杀虫 蛋白的编码基因序列都经过序列优化以增强在水稻等植物体中高水平表达。本发明所采 用的策略为：用Cry54Aal能与褐飞虱中肠受体结合的结构域II替换对稻褐飞虱没有毒性 的CrylAc的结构域II，利用CrylAc强的、能在昆虫中肠膜表面形成孔洞的能力，创制形成 对稻褐飞虱毒性显著增强的新型杀虫蛋白HY151。结构域II的替换所采用的方法为重叠 PCR(OverlapPCR)法。
[0029] 定义
[0030] "杀虫蛋白"是指能够控制昆虫的的生存、生长以及繁殖的蛋白，并且主要是通过 杀死昆虫的方式实现是生物活性。
[0031] "S-内毒素"是指由苏云金芽孢杆菌在产生的，具有对不同昆虫具有毒性的蛋白 质。
[0032] "靶标害虫"是指对某一特定杀虫蛋白敏感的昆虫称为此杀虫蛋白的靶标害虫，与 此对应的对此蛋白不敏感的害虫称为非靶标害虫。
[0033] "结构域":是蛋白质中的一类结构单元，是构成蛋白质三级结构的基本单元。它由 不同的a螺旋、0折叠或者其它蛋白质二级结构组成，具有相对独立的空间结构和功能。
[0034] "工程化杀虫蛋白HY151":是指包括HY151蛋白编码序列的一种核酸，这种工程化 HY151基因可以衍生于一种天然的Cry类基因或者一种合成的Cry类基因。
[0035] "基因"是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面 (5'非编码区）和后面（3'非编码区）的调控序列。
[0036] "植物"是指处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
[0037] "转化"是指将源核酸引入至一种宿主细胞或生物中的一个过程。
[0038] "外源基因"是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可 指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座 的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。
[0039] "基序"是指DNA，蛋白质等生物大分子中的保守序列，在反式作用因子的结构中， 基序一般指构成任何一种特征序列的基本结构（既指此具功能的基本结构，也指编码此结 构的蛋白质/DNA序列），作为结构域中的亚单元，其功能是体现结构域的多种生物学作用。
[0040] "mRNA剪切"是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子 连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。
[0041] "密码子"是指信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻的三个碱基亦称三联体密码。 同一个氨基酸可由不同的密码子编码称为"密码子的简并性"。
[0042] "密码子偏爱性"是指由于密码子的简并性，每个氨基酸至少对应1种密码子，最多 有6种对应的密码子。不同物种、不同生物体的基因密码子使用存在着很大的差异。各种 生物体似乎更偏爱使用某些同义三联密码子。其中在某一物种中使用频率高的密码子称为 该物种的"优势密码子"。
[0043] "重叠PCR" ：是指采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后 的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来形成一条杂合DNA 链。
[0044] "保护碱基"是指限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识 别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用 是有很大影响的，被称为保护碱基。
[0045] "半致死浓度"是指在动物急性毒性试验中，使受试动物半数死亡的毒物浓度，用 LC5。表不。
[0046] 本发明的实验证明，本发明在前期工作的基础上，创造性的改造了CrylAc及 Cry54Aal杀虫蛋白，并得到了对褐飞虱等刺吸式口器昆虫具有强杀虫活性的新型杀虫蛋白 HY151，从而为防治稻褐飞虱等水稻害虫提供了新的策略，具有广阔的应用前景；以CrylAc 和Cry54Aal基因为基础，通过交换CrylAc和Cry54Aal的结构域II，开发对稻褐飞虱具有 高毒力的新型杀虫蛋白，是一项具有重大理论和应用价值的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0047] 图 1 为CrylAcNCBIBlastpCDD分析结果
[0048] 图 2 为Cry54AalNCBIBlastpCDD分析结果
[0049] 图 3 为HY151NCBIBlastpCDD分析结果
[0050] 图4为HY151重组示意图
[0051] 图5为HY151编码序列获得过程overlapPCR结果
[0052] 图6为pET41a_HY151质粒BamHI、Xhol双酶切鉴定结果
[0053] 图7为pET41a_HY151的质粒图谱
[0054] 图8为Cry54Aal、HY151及CrylAc氨基酸序列比对结果
[0055] 图9为pET41a-HY151原核表达结果
[0056] 图 10 为pET41a_HY151 纯化结果
[0057] 图11为HY151编码序列优化后密码子使用情况与水稻密码子比较结果
【具体实施方式】
[0058] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060] 下述实施例构建过程中质粒提取、酶切、DNA的回收、纯化均按分子克隆中的方法 进行（SambrookandRussell2001)。
[0061] 实施例1、新型杀虫蛋白基因HY151的获得
[0062] -、CrylAc及Cry54Aal蛋白及基因序列分析
[0063] 将CrylAc及Cry54Aal氨基酸序列应用NCBI网站Blastp功能分析其保守结构域 Conserveddomains,并对应的找出其编码核苷酸序列。得出CrylAc结构域I为第36-254 位氨基酸，对应的核酸编码序列为第106-762位核苷酸；结构域II为第259-461位氨基 酸，对应的核酸编码序列为第775-1383位核苷酸；结构域III为第464-608位氨基酸，对 应的核酸编码序列为第1390-1824位核苷酸，其余序列为结构域间连接序列，如图1所示。 Cry54Aal结构域I为第72-316位氨基酸，对应的核酸编码序列为第214-948位核苷酸；结 构域II为第321-514位氨基酸，对应的核酸编码序列为第961-1542位核苷酸；结构域III 为第525-672位氨基酸，对应的核酸编码序列为第1573-2016位核苷酸，其余序列为结构域 间连接序列，如图2所示。
[0064] 根据以上信息设计引物，用Cry54Aal的结构域II替换掉CrylAc的结构域II，结 构域I与结构域II、结构域II与结构域III的连接部分也来自于Cry54Aal，应用NCBI网 站Blastp功能分析结果如图3所示，构建模式如图4所示，与CrylAc及Cry54Aal的氨基 酸序列比对结果见图8。具体引物序列如下：
[0065] 表1为用来制造编码HY151蛋白的序列的引物
[0066]
【权利要求】
1. 一种蛋白质，为用Cry54Aal的结构域II替换掉CrylAc的结构域II得到的蛋白质， 其包括CrylAc的结构域I、Cry54Aal结构域II及CrylAc结构域III。
2. 根据权利要求1所述的蛋白质，为如下a)或b)的蛋白质： a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。
3. 编码权利要求1或2所述蛋白的核酸分子。
4. 根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3) 或4)所示的基因： 1) 其编码序列是序列表中序列1的DNA分子； 2) 其编码序列是序列表中序列3的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分 子； 4) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的 DNA分子。
5. 下述1) _4)中的任一种生物材料： 1) 含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒； 2) 含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体； 3) 含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌； 4) 含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。
6. 权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求4所述的表 达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在作为Cry类杀虫剂中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述杀虫的对象为水稻褐飞虱。
8. 权利要求1或2所述蛋白质或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述的表 达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在防治水稻褐飞虱和/或制备防治水稻褐飞虱产 品中的应用。
【文档编号】C12N15/32GK104387460SQ201410653541
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】朱祯, 陈书元 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所