检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒通过Real-Time PCR从免疫相关基因的转录水平进行检测，只需要使用本试剂盒提供的材料和方法，而不依赖于相关的抗体试剂涉及的免疫学检测，即可快速、准确、高通量检测免疫相关基因的转录水平。
【专利说明】检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体的涉及Real-Time PCR检测北京鸭免疫相 关基因转录水平的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] Real-Time PCR技术由美国Applied Biosystems公司于1996年推出，由于该技 术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化 程度高。Real-Time PCR技术，又称实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光 基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，而传统的PCR是采用终点法对目标基因 进行定量，即对PCR反应后的产物进行琼脂糖电泳鉴定目的条带的亮度来实现定量，所以 Real-Time PCR具有更高的灵敏度和特异性。实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已 被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。
[0003] 目前用于基因转录检测的技术手段还包括，转录组测序技术、基因芯片技术，其中 基因芯片技术对目标物种的遗传景要十分清楚才能进行基因转录水平的检测，转录组测序 技术是通过深度测序技术来分析全部基因的转录水平，其价格十分昂贵，不能专项检测特 定功能的基因转录水平，因此这两种技术手段受到适用性的限制。
[0004] 传统的免疫学检测通常以琼扩实验检测中和抗体的水平，或是更为灵敏的间接 ELISA检测血清的中抗体的水平。抗体的产生属于体液免疫的研究范畴，不能全面的反应 宿主免疫状态。然而北京鸭的细胞免疫以及分子免疫学研究由于受到免疫学相关试剂的 限制，不能用ELISA方法检测北京鸭细胞免疫的状态。本发明可以解决相关试剂缺乏、实验 周期长、灵敏度不高、实验设计复杂等问题，一次样本采集即可完成多个免疫相关基因的检 测，检测结果可以在3个小时内完成，实验结果准确可靠，数据分析量大。
[0005] Real-Time PCR通过设计相应的特异性的引物来检测北京鸭免疫相关基因的转 录水平，本发明设计的引物对可以检测北京鸭的细胞免疫、先天性免疫、趋化因子、组织相 容性复合物等免疫相关基因的转录情况，克服了传统的依赖于抗原抗体反应的实验设计 (ELISA实验、琼扩实验），该发明只需要使用本发明的引物对即可快速完成所有免疫相关 基因的转录水平检测。
【发明内容】
[0006] 本
【发明内容】
涉及的是Real-Time PCR检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂 盒、引物对以及方法。
[0007] 本发明是通过以下的技术方案实现，利用荧光定量PCR仪检测SYBR荧光染料的 特点，将根据Genebank公布的北京鸭的基因序列设计用于荧光定量的PCR引物，经反复试 验，优化Real-Time PCR反应体系和反应参数，建立了 Real-Time PCR检测北京鸭免疫相关 基因转录水平的方法，包括如下步骤：一、采用RNAiso Plus抽提组织总RNA ;二，将抽提的 mRNA反转录为cDNA ;三、利用Real-Time PCR检测免疫相关基因的转录水平，检测结果通过 IBM SPSS Statistics20进行生物学统计分析。
[0008] 本发明所述的Real-Time PCR检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂盒、引物 对以及方法，其特征在于步骤三中所涉及的全部引物序对和Real-time PCR检测过程，其中 引物序列如表1中所述；
[0009] Real-time PCR过程如下：一、Real-Time PCR检测免疫相关基因的转录反应体 系如下：2X SYBRJ: Premix Ex Taq? II 10ul，cDNA2ul，Forward primer 0.8ul，Reverse primer 0.8ul，ddH20 6.4ul ;二、反应程序如下：95°C 30s，95°C 5s，58.2°C 30s，95°C 30s， 72°C 30s，55°C -95°C 15s+0. 5°C /cycle。
[0010] 表I本发明所涉及的引物对
[0011]
【权利要求】
1. Real-Time PCR检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂盒，其特征在于所述的试 剂盒包括如下引物： GAPDH 5' -ATGTTCGTGATGGGTGTGAA-3' 5' -CTGTCTTCGTGTGTGGCTGT-3' IFN-β 5' -CCTCAACCAGATCCAGCATT-3' 5, -GGATGAGGCTGTGAGAGGAG-3， IL-I β 5' -TCGACATCAACCAGAAGTGC-3' 5' -GAGCTTGTAGCCCTTGATGC-3' IL-25' -GCCAAGAGCTGACCAACTTC-3' 5, -ATCGCCCACACTAAGAGCAT-3， IL-65' -TTCGACGAGGAGAAATGCTT-3' 5' -CCTTATCGTCGTTGCCAGAT-3' IFN-a 5' -TCCTCCAACACCTCTTCGAC-3' 5' -GGGCTGTAGGTGTGGTTCTG-3' IFN-Y5' -GCTGATGGCAATCCTGTTTT-3' 5' -GGATTTTCAAGCCAGTCAGC-3' MHC-I 5' -GAAGGAAGAGACTTCATTGCCTTGG-3' 5' -CTCTCCTCTCCAGTACGTCCTTCC-3' MHC-II 5' -CCACCTTTACCAGCTTCGAG-3' 5' -CCGTTCTTCATCCAGGTGAT-3' TLR-75' -CCTTTCCCAGAGAGCATTCA-3' 5，-TCAAGAAATATCAAGATAATCACATCA-3， BAFF 5' -TGTGCACGTCATCCAACAGA-3' 5, -GCCACAGGAATGTGACAGGA-3' CCL215, -GGAGAAGCAGAAGAACCCCC-3， 5' -GGGAAAGCATCCGTCCTCTC-3' CCL195, -CCAGGAAGGTCCCAAATAAA-3， 5, -GTAGTAGGAGGTGGAAGCAAGTC-3， TLR-35 ' -CAACACTCCGCCTAAGTATCATG-3 ' 5' -GCTATCCTCCACCCTTCAAAA-3' β-defens in 5'-CCAGGTTTCTCCAGGATTGT-3' 5' -AACCCAAAGCAACTTCCAAC-3'。
2. 根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒不需要抗体试剂。
3. 权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测北京鸭免疫相关基因转录水平试剂中的应 用。 4. Real-Time PCR检测北京鸭免疫相关基因转录水平的的方法，其特征在于包括如下 步骤：一、采用RNAisoPlus抽提北京鸭组织中的总RNA ;二，将抽提的mRNA反转录为cDNA ; 三、利用Real-Time PCR试剂盒检测免疫相关基因的转录水平，检测结果通过IBM SPSS Stat ist ics 20进行生物学统计分析。
5.根据权利要求4所述的Real-Time PCR检测北京鸭免疫相关基因转录水平的方 法，其特征在于步骤三中所涉及的全部引物序对和Real-t ime PCR检测过程，其中引物 序列权利要求1或2中所述；Real-t ime PCR过程如下：1、Real-Time PCR检测免疫相关 基因的表达实验反应体系如下：2X SYBR㊣Premix Ex Taq? II IOul, cDNA 2ul，Forward primer(10pm)0.8ul，Reverse primer(10pm)0.8ul，ddH20 6.4ul ;2、反应程序如下： 95°C 30s，95°C 5s，58.2°C 30s，95°C 30s，72°C 30s，55°C -95°C 15s+0.5°C /cycle。
【文档编号】C12Q1/68GK104372097SQ201410664799
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】汪铭书, 欧旭敏, 程安春, 朱德康, 陈孝跃 申请人:四川农业大学