利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1MEFs原代获取、CF-1MEFs传代培养和CF-1MEFFeeder制备等三个步骤；制备CF-1MEFFeeder时以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，转瓶机的搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；转瓶机专用培养瓶的容积是普通培养瓶/皿的几倍甚至上百倍，培养瓶能重复使用，可节省大量细胞培养瓶/皿，降低Feeder的制备成本，提高Feeder制备效率，节约大量实验时间；另外本方法是在悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液处理，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态。
【专利说明】利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种饲养层（Feeder)细胞的制备方法，具体涉及一种利用搅拌式细 胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法，属于体外细胞培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 诱导型多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs)很多特性与胚 胎干细胞极为相似，能分化为几乎所有的成体细胞，由于其可通过细胞重编程技术从终末 分化的成体细胞得到，因此可获得患者特异性或疾病特异性的iPSCs，促使其成为研究疾病 发生机制、个体化药物治疗、药物筛选和细胞治疗的热点，进一步拉近了干细胞和临床疾病 治疗的距离。iPSCs在长期培养过程中容易发生分化和核型不稳定情况，在长期培养过程中 维持iPSCs正常不分化状态和自我更新能力是一项极具挑战性的工作。而长期培养在饲养 层体系中是维持iPSCs不分化状态和核型稳定最简单、直接和有效的方法，因此制备高质 量的Feeder成为培养iPSCs的关键技术。
[0003] 目前，Feeder制备方法主要有γ-射线照射法和丝裂霉素 （Mitomycin C，MMC)处 理法：Y射线法的优点是可大批量处理细胞，但是由于Y射线存在放射性污染及储存监 管程序繁琐，费用昂贵等缺点，世界上很多地区已找不到放射源，因此多数实验研究仍采用 MMC法来制备Feeder。小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，是最 常用的Feeder细胞来源；而CF-I MEFs是培养人iPSCs (hiPSCs)最常用的Feeder细胞来 源，具有增殖能力极强、可覆层生长、密度依赖性高、低密度时易发生老化等特点。
[0004] 传统MMC法制备CF-I MEF Feeder时，通常需要将MEFs以较低密度铺至细胞培养 皿/瓶中，待其长至< 100%融合(保证细胞为单层存在）时，用MMC抑制其有丝分裂，存在 以下问题：1)产量低，成本高：利用传统方法单个细胞培养皿/瓶处理的细胞数量较少，要 想得到足够数量的Feeder就需要消耗大量的实验耗材，多批量处理必然产生昂贵的费用； 2)细胞增殖抑制不充分：若提高单个细胞培养皿/瓶处理细胞的密度，会出现细胞增殖不 能被充分抑制的问题；3) MEFs的生物学行为易受影响：由于CF-I MEFs低密度时易发生 老化，分泌hiPSCs必需营养因子的能力就会下降，可能影响到hiPSCs的生长状态；4)处理 时间受限：为了充分抑制细胞增殖，最好在细胞生长至809Γ90%融合时用MMC处理，但CF-I MEFs增殖速度很快，易出现覆层生长从而错过最佳处理时机。为了降低Feeder的制备成 本，提高细胞处理效率，降低操作者工作强度，急需一种新方法，既可以单批处理大量细胞， 又能保证细胞增殖被充分抑制。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用搅拌式细胞培 养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，搅拌 锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触，可提高 MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液消 化，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态；细胞培养瓶的容积是 普通培养瓶/皿的几倍甚至上百倍，短时间内可处理大量细胞，可提高Feeder的制备效率， 降低Feeder的制备成本，操作更为灵活方便。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-I MEFs原代获 取、CF-I MEFs传代培养和CF-I MEF Feeder制备等三个步骤，其特征在于，制备CF-I MEF Feeder以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，具体包括以下步骤： (I) CF-I MEFs 原代（PO)获取： I、 取孕12. 5天的CF-I小鼠，脱颈处死、无菌条件下取出胚胎，用IOml PBS (即磷酸盐 缓冲液）清洗后放于无菌培养皿中；去除胚胎头部和内脏，用IOml PBS清洗2次； II、 将剩余组织移至新的无菌培养皿中，用无菌剪刀将组织剪碎，每个胚胎加入Iml消 化液，同时吹打数次，放入培养箱中消化5min ;加入与消化液等体积的培养液终止消化后 充分吹打尽量分散为单细胞； III、 将上述细胞悬液混匀后，每个T75培养瓶添加2个胚胎的细胞悬液和13ml培养 液，然后将培养瓶放到培养箱中培养，培养瓶上注明细胞名称、代次PO及日期。
[0007] (2) CF-I MEFs 传代培养： ① 、PO代CF-I MEFs培养3天后，倒置显微镜下观察MEFs长满培养瓶底时，吸弃培养 液，用IOml PBS清洗细胞一遍，然后加入2ml消化液将其混至覆盖整个培养瓶底部； ② 、培养瓶置于培养箱中孵育3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使MEFs细胞脱落；用2ml培 养液终止消化，同时轻轻吹打形成单细胞悬液； ③ 、将上述细胞悬液均分到3个T75瓶中（即为1:3传代培养)，用培养液补至15ml进 行传代，放入培养箱中继续培养； ④ 、用此方法，将细胞传至第3代。
[0008] (3)、CF-I MEF Feeder 制备： A :将搅拌式细胞培养转瓶机的磁力搅拌器消毒后置于培养箱内，磁力搅拌器通过控制 线与培养箱外的控制箱相连；转瓶机的专用细胞培养瓶和搅拌锤高温、高压灭菌后冷却至 室温待用； B、 CF-1 MEFs培养至第3代第4天后，吸弃培养液，用IOml PBS清洗细胞一遍，然后加 入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使细胞脱落，添加2ml培养液终 止消化，将细胞收集到同一个离心管中后计数； C、 将步骤B中收集的细胞转移到专用细胞培养瓶中，依据细胞数添加培养液至 25?10001111，将细胞密度调整至0.5\10 6?1.3\106个>1;然后避光条件下将丽(：加至上述 培养液中，将MMC浓度调整至l(^g/ml，充分混匀后旋紧瓶盖； D、 立即将专用细胞培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，旋松瓶盖，将控制箱上转动 模式设置为ΚΓ20转/分钟，连续旋转0. 5~2小时；本发明专用细胞培养瓶的盖子悬松，既 可以保证细胞的无菌培养条件，又可满足细胞生存必须的氧气需求，同时培养箱内的CO 2也 可以进入到培养瓶中调节内部培养液的pH ; E、 旋转结束后，立即将细胞转移至50ml离心管内，放入离心机中以1000转/分钟的速 度离心5~15分钟，然后吸弃离心管中上清液，去除含MMC的培养液； F、 用PBS重悬细胞，将细胞密度调整到2X 105~5X IO5个/ml，以1000转/分钟离心 5~15分钟，离心结束后，吸弃上清液； G、 按步骤F所述方法重复3次，得到需要的细胞，细胞计数后，冻存备用。
[0009] 优选的，步骤A中所述的搅拌式细胞培养转瓶机，为Cell Spin比欧细胞培养转 瓶机-搅拌式-4瓶位。
[0010] 优选的，步骤C中，细胞密度调整至0. 6 X 106~1 X IO6个/ml ;步骤F中，细胞密度 调整至3 X IO5?4 X IO5个/ml。
[0011] 优选的，步骤D中，将控制箱上转动模式设置为15转/分钟，连续旋转0. 5~1. 5小 时；步骤E中，以1000转/分钟的速度离心10分钟，尽可能减少因离心而引起的细胞丢失， 同时可避免因离心时间过长和/或转速过大影响细胞状态。
[0012] 优选的，步骤G中，冻存液配方各成分体积比为培养液：胎牛血清（FBS):二甲基亚 砜（DMSO) =9:10:1。
[0013] 优选的，本发明所述的培养液为：以高糖DMEM培养液为基本培养液，向基本培养 液中添加体积分数为10%的胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1%的L-谷氨酰胺，充分混匀后 用0. 22Mm滤器过滤除菌后备用；所述的消化液为0. 25%胰酶+0. 02%EDTA。
[0014] 本发明所述的利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，该方法 还可以应用于细胞培养领域其它细胞制备Feeder。
[0015] 本发明方法，搅拌式细胞培养转瓶机的搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细 胞在悬浮状态下，与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理 时间；转瓶机专用培养瓶的容积有l〇〇ml、250ml、500ml、1000ml不同规格，培养瓶能重复使 用，可节省大量细胞培养瓶/皿，降低Feeder的制备成本；短时间内能处理大量细胞，可提 高Feeder制备效率，节约大量实验时间，操作更为灵活方便，明显降低操作者的工作强度； 另外本方法是在悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液消化，可减少消化对细胞带 来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1 :按照实施例1方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后得到的Feeder细胞 的显微结构图； 图2 :按照实施例1方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞随时间变化的增殖 统计结果； 图3 :按照实施例1方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞的复苏率统计结果； 图4 :按照实施例1方法、MMC处理不同时间后制备的Feeder,接种hiPSCs后，Feeder 细胞和培养其上的hiPSCs的显微结构图； 图5 :按照实施例2方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后得到的Feeder细胞的显 微结构图； 图6 :按照实施例2方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞随时间变化的增殖 统计结果； 图7 :按照实施例2方法制备的Feeder，MMC处理不同时间后，细胞的复苏率统计结果； 图8 :按照实施例2方法、MMC处理不同时间后制备的Feeder,接种hiPSCs后，Feeder 细胞和培养其上的hiPSCs的显微结构图； 其中： 图 1、图 4、图 5、图 8 中：A、B、C、D 分别代表 MMC 处理 0. 5h、lh、l. 5h、2h ;
【权利要求】
1. 一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1 MEFs原代 获取、CF-1 MEFs传代培养和CF-1 MEF Feeder制备三个步骤，其特征在于，制备CF-1 MEF Feeder时以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，转瓶机的旋转锤在电磁场作用下不 断旋转，从而使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触；悬浮状态处理细胞，回收细 胞时无需消化液处理，减少消化对细胞带来的损伤。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，转瓶机的旋转锤在电磁场作用下不断旋 转，其旋转速度为1(T20转/分钟，连续旋转0. 5~2小时。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，回收细胞无需消化液处理指 的是，在悬浮状态下处理细胞，处理结束后，细胞可直接离心后吸弃上清液，然后用PBS重 悬细胞沉淀后清洗，不经过消化液消化过程。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，制备CF-1 MEF Feeder的具体步骤为： A :将搅拌式细胞培养转瓶机的磁力搅拌器消毒后置于培养箱内，磁力搅拌器通过控制 线与培养箱外的控制箱相连；转瓶机的专用细胞培养瓶和搅拌锤高温、高压灭菌后冷却至 室温待用； B、 CF-1 MEFs培养至第3代第4天后，加入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻 拍培养瓶侧壁使细胞脱落，然后用2ml培养液终止消化，将细胞收集到同一个离心管中后 计数； C、 将步骤B中收集的细胞转移到专用细胞培养瓶中，依据细胞数添加培养液至 25?10001111，将细胞密度调整至0.5\106?1.3\106个>1 ;然后避光条件下将丽(：加至上述 培养液中，将MMC浓度调整至lOPg/ml，充分混匀后旋紧瓶盖； D、 立即将专用细胞培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，旋松瓶盖，将控制箱上转动 模式设置为1(T20转/分钟，连续旋转0. 5~2小时； E、 旋转结束后，立即将细胞转移至50ml离心管内，放入离心机中以1000转/分钟的速 度离心5~15分钟，离心结束后，吸弃离心管中上清液，去除含MMC的培养液； F、 用PBS重悬细胞，将细胞密度调整到2X105~5X105个/ml，以1000转/分钟离心 5~15分钟，离心结束后，吸弃上清液； G、 按步骤F所述方法重复3次，得到所需要的细胞，细胞计数后，冻存备用。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A中所述的搅拌式细胞培养转瓶机， 为Cell Spin比欧细胞培养转瓶机-搅拌式-4瓶位。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤C中细胞密度调整为 0. 6X106?1X106个/ml ;步骤F中细胞密度调整为3X105?4X105个/ml。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤D中控制箱上转动模式设置为15转 /分钟，连续旋转0. 5~1. 5小时；步骤E和F中，离心机以1000转/分钟的速度离心10分 钟。
8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤G中，冻存液各组分体积比为培养 液：胎牛血清：二甲基亚砜=9:10:1。
9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养液为：以高糖DMEM培养液 为基本培养液，向基本培养液中添加体积分数为10%的胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1% 的L-谷氨酰胺，充分混匀后用0. 22Mm滤器过滤除菌后备用；所述的消化液为0. 25%胰酶 +0.02%EDTA。
10. -种权利要求1所述的利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法， 其特征在于，该方法在细胞培养领域制备Feeder的应用。
【文档编号】C12N5/073GK104388382SQ201410673462
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】李玉林, 刘晋宇, 战立香, 池光范, 张丽红, 李莉莎 申请人:吉林大学