编码重组恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的dna分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及编码重组恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的DNA分子。所述的DNA分子采用了酵母偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对本发明的重组蛋白基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列。
【专利说明】编码重组恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的DNA分子
[0001] 本发明是申请号为200610118947. 8的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及DNA重组技术和基因工程疫苗领域。更具体地，本发明涉及一种源自 恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的重组蛋白；编码所述重组蛋白的DNA序列；含所述DNA序 列的载体；含所述载体的宿主细胞；含所述重组蛋白的疫苗；用基因工程制备该重组蛋白 的方法；以及该重组蛋白在制备抗疟疾疫苗方面的应用。
【背景技术】
[0003] 疟疾是人类最古老的传染病之一，目前仍严重影响人类的健康。据世界卫生组织 (WHO)的最新调查，约世界人口的40%仍处在疟疾威胁之中，分布于100多个国家。目前世 界上每年有3至5亿人罹患疟疾，其中约300万人死亡。更为严重的是，由于疟原虫及蚊媒 抗药性的产生和迅速扩散，疟疾不仅没有得到有效控制，反而有卷土重来之势。因此，开展 全球遏制疱疾计划已成为WHO在新世纪两个重点研宄领域之一。
[0004] 人们在疟疾防治中依靠或期望获得突破的主要有三个途径：抗疟药、疟疾疫苗和 蚊媒防制。但抗疟药及蚊媒防制面临着巨大的困难和挑战，这是因为疟原虫及蚊虫抗药性 的产生和扩散。尽管目前尚未有应用价值的疟疾疫苗问世，但普遍认为发展疟疾疫苗是人 类控制乃至消灭疟疾的重要途径。
[0005] 大量研宄表明，疟疾是可以通过研制有效的疫苗而实现预防的。如用灭活子孢子 免疫的志愿者能完全保护后来的攻击感染。再如用鼠疟原虫的重组抗原免疫小鼠，亦能完 全保护后来同种疟原虫的攻击感染。此外，疟疾流行病学研宄也显示，死于疟疾的主要是无 疟疾免疫力的人群，如：在疟区的儿童和非疟区人群进入疟区，而在疟区的成人很少因疟疾 而死亡。如给这些无免疫力的人群接种有效的疫苗，使其达到与疟区成人同样的免疫力，这 样就能实现预防疟疾和降低疟疾死亡率的目标。因此，疟疾疫苗研制已成为当今世界性热 点课题。
[0006] 疟疾疫苗的研宄已进行了 20多年，但至今仍无可应用的有效疟疾疫苗问世。目前 正在研宄开发的疟疾疫苗有3种，S卩：抗子孢子疫苗，红内期疫苗和阻断传播的疫苗。然而， 这些疫苗均因为效力低下、持续时间短、或不稳定等原因，应用受到限制。
[0007] 此外，研制由疟原虫红外期和红内期等抗原组成的多价多期疫苗是疟疾疫苗研 发的趋势。本 申请人:已经研制了含有主要裂殖子表面抗原（MSPl)和裂殖子顶端膜抗原 (AM-I)的融合蛋白的疫苗（也称为PfCP-2. 9)，其是一种红内期疟疾疫苗。为提高疫苗的 免疫保护效力，需要寻找合适的红外期抗原与其联合应用，以达到全面且良好的防治疟疾 的效果。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是提供源自恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的重组蛋白。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种重组蛋白，所述重组蛋白具有以下结构：
[0010] 元件B-连接肽-元件A ;或
[0011] 元件A-连接肽-元件B ;
[0012] 其中，
[0013] 元件A为恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的C端免疫区；
[0014] 元件B为无，或恶性疟原虫环子孢子表面蛋白中除C端免疫区以外的免疫反应表 位区域；
[0015] 连接肽为无，或长度为1-30氨基酸的肽，所述的连接肽对于元件A和元件B的构 象基本上无影响。
[0016] 并且，所述的重组蛋白不具有恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的氨基酸序列，更优 选的，所述的重组蛋白不具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0017] 在本发明的另一优选例中，所述恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的C端免疫区是恶 性疟原虫环子孢子表面蛋白中位于中心重复区与锚定区之间、且不包括中心重复区与锚定 区的氨基酸序列。
[0018] 在本发明的另一优选例中，所述恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的C端免疫区包 括：恶性疟原虫环子孢子表面蛋白第二区域（RII区域）和C-末端内的T、B细胞表位。
[0019] 在本发明的另一优选例中，在所述元件A的氨基酸序列中，消除了糖基化位点的 氨基酸序列。更优选的，将所述的恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的第382位的Asn转变为 Ala，从而消除糖基化位点。
[0020] 更佳地，所述的元件A具有SEQ ID NO: 2中第5-116位的氨基酸序列。
[0021] 在本发明的另一优选例中，除了连接、克隆、表达或纯化相关位点以外，所述重组 蛋白上的其它区域均来源于恶性疟原虫环子孢子表面蛋白。
[0022] 在本发明的另一优选例中，所述元件B是恶性疟原虫环子孢子表面蛋白中心重复 区的部分或全部的氨基酸序列。
[0023] 在本发明的另一优选例中，所述的中心重复区的氨基酸序列为：(NANP)n，其中，η =3_34〇
[0024] 在本发明的另一优选例中，所述的中心重复区的氨基酸序列为：(NANP) 15。
[0025] 在本发明的另一优选例中，所述元件B还包括恶性疟原虫环子孢子表面蛋白RI区 的部分或全部的氨基酸序列。
[0026] 在本发明的另一优选例中，所述的重组蛋白含有：
[0027] SEQ ID NO:2中第5-116位所示的氨基酸序列；或
[0028] SEQ ID NO:4中第5-205位所示的氨基酸序列。
[0029] 在本发明的另一优选例中，所述的重组蛋白中不含有连接肽。
[0030] 在本发明的另一优选例中，所述的重组蛋白的N端还包含：酿酒酵母α -因子信号 肽切割序列。
[0031] 在本发明的第二方面，提供一种分离的DNA分子，该DNA分子选自：
[0032] ⑴编码所述的重组蛋白的DNA分子；或
[0033] (ii)与⑴中的DNA分子互补的DNA分子。
[0034] 在本发明的另一优选例中，所述的DNA分子编码具有SEQ ID N0:2中第5-116位 所示的氨基酸序列或SEQ ID N0:4中第5-205位所示的氨基酸序列的蛋白。
[0035] 在本发明的另一优选例中，所述的DNA分子具有：
[0036] SEQ ID NO: 1中第13-360位所示的核苷酸序列；或
[0037] SEQ ID NO:3中第13-627位所示的核苷酸序列。
[0038] 在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的DNA分子。
[0039] 在本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的载体；或它的基因组中整 合有所述的多核苷酸。
[0040] 在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞为毕赤酵母细胞。
[0041] 在本发明的第五方面，提供一种抗疟疾组合物，它含有：
[0042] 所述的重组蛋白或所述的DNA分子；以及
[0043] 药学上可接受的载体。
[0044] 在本发明的另一优选例中，所述的抗疟疾组合物还含有：
[0045] (a)主要裂殖子表面抗原（MSPl)和裂殖子顶端膜抗原（AMA-I)的融合蛋白，或
[0046] (b)编码（a)所述融合蛋白的DNA分子。
[0047] 在本发明的另一优选例中，所述的组合物含有所述的重组蛋白以及MSPl与AMA-I 的融合蛋白。
[0048] 在本发明的另一优选例中，所述的组合物为疫苗。
[0049] 在本发明的另一优选例中，所述的组合物中还含有ISA720佐剂。
[0050] 在本发明的第六方面，提供一种产生所述的重组蛋白的方法，包括步骤：
[0051] 在适合表达所述重组蛋白的条件下，培养所述的宿主细胞从而表达出所述的重组 蛋白；分离所述的重组蛋白。
[0052] 另一方面，本发明还提供一种预防疟疾的方法，给需要的对象施用免疫有效量的 所述的蛋白。
[0053] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0054] 图1显示了全长恶性疟原虫环子孢子表面蛋白（PfCSP)以及重组蛋白PfCSP-C和 PfCSP-RC的示意图。其中，SP :信号肽；RI !Region I区；重复区：NANP重复区；RII !Region II区。此外，273Asn为PfCSP的C端免疫区的起始点氨基酸、384Ser为PfCSP的C-末端 锚定区起始点的前一个氨基酸、86Leu为RI区域的起始点氨基酸、112Pro为RI区域末端的 氨基酸，211Asn为本发明的重组蛋白PfCSP-RC的中心重复区的起始点氨基酸（对应于SEQ ID NO:4 中第 32 位）。
[0055] 图2显示了重组蛋白基因 PfCSP-RC和PfCSP-C的合成示意图。其中，图2A为 PfCSP-RC基因的合成：627bp PfCSP-RC基因分成8个寡核苷酸片段，用不对称PCR法分步 进行基因拼接。基因5'和3'分别加上XhoI和EcoRI位点用于基因片段的克隆。各合成 片段克隆在pBluscript载体进行序列分析。图2B为PfCSP-C基因的合成：设计一对引物 分别位于PfCSP-RC的C末端起始处（Pa)和3'末端（Pb)，用PCR方法扩增获得。
[0056] 图3显示了 pPIC9k/PfCSP-C重组表达质粒的图谱。
[0057] 图4显示了 pPIC9k/PfCSP_RC重组表达质粒的图谱。
[0058] 图 5 显示了 SDS-PAGE 检测 PfCSP-C(图 5A)和 PfCSP-RC(图 5B)的表达。其中， 图5A :在诱导前Ohr (泳道1)及诱导后21 (泳道2)、31 (泳道3)、46 (泳道4)、54 (泳道5)、 60 (泳道6)和70 (泳道7)小时分别取培养上清15 μ 1进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝 染色。在16. 5KD处出现一条PfCSP-C目的蛋白。图5Β:在诱导前Ohr (泳道1)及诱导后 18 (泳道2)、28 (泳道3)和41 (泳道4)小时分别取培养上清15 μ 1进行SDS-PAGE电泳和 考马斯亮蓝染色。在31KD处出现一条目的蛋白。
[0059] 图6显示了免疫印迹法检测PfCSP-C和PfCSP-RC表达的电泳图。其中，泳道1代 表PfCSP-C的电泳结果，泳道2代表PfCSP-RC的电泳结果。用PfCSP免疫兔血清进行检测。
[0060] 图7显示了纯化的PfCSP-C和PfCSP-RC重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。表达上清 分离后，用离子交换柱和分子筛两步纯化，经SDS-PAGE测定获得目的蛋白纯度大于95%。 泳道 I :PfCSP-RC，5 μ g ;泳道 2 :PfCSP-C，5 μ g。
[0061] 图8显示了用ELISA法测定联合疫苗免疫兔血清抗NANP重复多肽IgG的水平。 各组分别为 ISA720 佐剂；ISA720 佐剂 +PfCP-2. 9 ;ISA720 佐剂 +PfCSP-C ;ISA720 佐剂 +PfCSP-RC ;ISA720 佐剂 +PfCSP-RC+PfCP-2. 9。
【具体实施方式】
[0062] 本发明人经过广泛而深入的研宄，出乎意料地发现，含有恶性疟原虫环子孢子表 面蛋白的C端免疫区（元件A)的重组蛋白在表达后形成的构象非常接近PfCSP的C末端 的天然构象，将其作为抗原可非常有效地引起免疫应答，在动物体内可产生高水平的特异 性抗体。并且，将所述的C端免疫区蛋白与由MSPl和AM-I融合而成的融合蛋白（参见中 国专利申请CN 01105292. 9,也称为PfCP-2. 9)共同作为抗原进行免疫，可产生良好的联合 免疫效果，因此所述的C端免疫区蛋白可以作为抗疟疾多价联合疫苗的组成成分。基于此 完成了本发明。
[0063] 如本发明所用，所述的"恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的C端免疫区"（或简称为 "C端免疫区"或"C端免疫区蛋白"）是指恶性疟原虫环子孢子表面蛋白中位于中心重复 区与锚定区之间、且不包括中心重复区与锚定区的氨基酸序列。优选地，所述的"C端免疫 区"包括：恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的RII区和C-末端内T、B细胞表位。
[0064] 如本发明所用，所述的"连接、克隆、表达或纯化相关位点"是指：为了便于构建、表 达、纯化所述重组蛋白或促进所述重组蛋白的免疫原性，而设计于所述重组蛋白上的结构， 这些结构本身不构成免疫反应的表位。
[0065] 恶性疟原虫环子孢子表面蛋白
[0066] 如本发明所用，"恶性疟原虫环子孢子表面蛋白（PfCSP) "是指与天然的或变异 的疟原虫PfCSP具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然疟原虫PfCSP基本上相 同的抗原活性的蛋白。所述的"恶性疟原虫环子孢子表面蛋白"的氨基酸序列比如可参见 GenBank 登录号：X15363〇
[0067] PfCSP覆盖在整个子孢子的表面，为子孢子正常发育和入侵肝细胞所必需，经基因 敲除技术缺失PfCSP基因的伯氏疟原虫子孢子不能在蚊虫卵囊内正常发育。
[0068] 在蛋白结构上，PfCSP分子由N端、中心重复区以及C末端组成，其中心重复区由4 个氨基酸组成，即NANP，不同株间的变异表现为NANP重复次数的差异。在该重复区的两侧 分别含有两个种间高度保守的区域，称为RI区和RII区。PfCSP的C末端除RII区域外，还 含有其它的T、B细胞表位。
[0069] 尽管已知PfCSP可以作为一种开发疟疾疫苗的候选抗原，然而，全长的PfCSP由于 序列较长，结构特殊比如含有34个中心四肽重复区，因此在真核表达系统进行分泌表达、 产生结构稳定并两个末端完整的重组蛋白等均比较困难。全长的序列表达产量不高，这给 疫苗生产制备带来困难且疫苗成本高。此外，全长的PfCSP作为抗原，其主要的免疫保护区 如中心重复区等引起的免疫应答水平有限，而且有可能影响联合疫苗中其它抗原的免疫应 答。
[0070] 开发疟疾疫苗需要克服的一个问题是人体MHC分子多态性。由于人体MHC分子的 多态性，使得一些抗原不能与某些机体MHC分子结合，导致抗原递呈受阻，出现免疫个体无 反应现象。因此，需在现有疟原虫抗原中鉴定出能识别多数人MHC分子的多反应表位，制成 疫苗，从而确保疫苗可在绝大多数个体中得到有效递呈。
[0071] 重组蛋白及其编码基因
[0072] 本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白具有以下结构：
[0073] 元件B-连接肽-元件A ;或
[0074] 元件A-连接肽-元件B ;
[0075] 其中，
[0076] 元件A为恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的C端免疫区；
[0077] 元件B为无，或恶性疟原虫环子孢子表面蛋白中除C端免疫区以外的免疫反应表 位区域；
[0078] 连接肽为无，或长度为1-30氨基酸的肽，所述的连接肽对于元件A和元件B的构 象基本上无影响。
[0079] 作为一种更优选的方式，所述的元件B是恶性疟原虫环子孢子表面蛋白中心重复 区的部分或全部的氨基酸序列。优选的，所述中心重复区含有3-34个重复的NANP。更优选 的，所述的中心重复区的氨基酸序列为：(NANP) 15。通常，所述的中心重复区的C端与所述的 C ?而免疫区的N ?而相连接。
[0080] 作为一种更优选的方式，所述的元件B是恶性疟原虫环子孢子表面蛋白RI区的部 分或全部的氨基酸序列。通常，所述的RI区的C端与中心重复区的N端相连接。
[0081] 较优选的，本发明人在所述的重组蛋白中，消除了糖基化位点的氨基酸序列。更优 选的，本发明人将所述的恶性疟原虫环子孢子表面蛋白的第382位的Asn转变为Ala，从而 消除糖基化位点。
[0082] 此外，在本发明的重组蛋白的N端或C末端还可添加其它不影响该重组蛋白免疫 原性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列为有利于本发明的重组蛋白的表达 (如信号肽）或纯化（如6XHis序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点（Glu-Lys-Arg))， 或可促进本发明的重组蛋白的免疫原性（例如IL-2、GM-CSF等细胞因子的序列）。
[0083] 作为本发明的优选实例，提供了重组蛋白PfCSP-C，它具有SEQ ID NO: 2所示的氨 基酸序列；以及重组蛋白PfCSP-RC，它具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
[0084] 本发明还包括编码本发明的重组蛋白的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人 工合成，也可用PCR扩增或合成的方法获得。
[0085] 为了提尚宿主细胞的表达量，可以对本发明的重组蛋白的编码序列进彳丁改造，例 如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明的一个实施 例中，采用了酵母偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对本发明的重组蛋白基因进行检 测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。
[0086] 在获得了编码本发明新重组蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再 转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的重组 蛋白。
[0087] 如本文所用，术语"载体"包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
[0088] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载 体，然后将编码本发明新重组蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋 白表达载体。
[0089] 如本文所用，"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影 响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的 分泌，那么信号肽（分泌前导序列）DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如果启动子控制序列 的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置 时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，"可操作地连于"意味着相邻近，而对于分泌前 导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0090] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动 物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是酵母细胞。
[0091] 在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明重组蛋白的条件下培养该细胞， 从而表达出重组蛋白。然后再分离出表达的重组蛋白。
[0092] 连接肽
[0093] 如本文所用，术语"连接肽"（linker)指位于元件A和元件B之间的、起连接作用 的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度也可为0,此时元件A和元件B直接 相连。通常，连接肽不影响或不显著影响元件A和元件B氨基酸序列形成正确的折叠和空 间构象。一些连接肽的例子包括（但并不限于）：
[0094] (a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-15个氨基酸序列，例如 Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:7)；
[0095] (b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为2-20个，较佳地2-10个氨基 酸；
[0096] (c)由（a)或（b)组合形成的氨基酸序列。
[0097] 重组蛋白的用途
[0098] 本发明提供了所述重组蛋白的用途，其可被用于制备防治疟疾的组合物，例如疫 苗。
[0099] 在本发明的实例中，本发明人合成了包含PfCSP的C端免疫区的氨基酸序列 的PfCSP-C、以及同时包含PfCSP的C端免疫区氨基酸序列和中心重复区氨基酸序列的 PfCSP-RC，并在毕氏酵母中分泌表达出蛋白。采用这两个重组蛋白作为抗原免疫小鼠后，小 鼠血清能够识别恶性疟原虫子孢子。而且，PfCSP-RC的免疫血清中含有高水平针对NANP重 复区的抗体（图8)，而这种抗体具有抑制子孢子入侵肝细胞的作用。这些实例证明，本发明 的重组蛋白对于疟疾的防治是非常有用的。
[0100] 疫苗
[0101] 本发明还提供了含有所述的重组蛋白作为免疫原的组合物。优选的，本发明的组 合物是疫苗。所述的疫苗可以是预防性的（即预防感染）。
[0102] 这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸（如 核糖核酸或脱氧核糖核酸），通常与"药学上可接受的载体"组合，这些载体包括本身不诱导 产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的 大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物（如 油滴或脂质体）以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外， 这些载体可起免疫刺激剂（"佐剂"）作用。
[0103] 增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：（1)铝盐（alum)，如氢氧化铝、 憐酸错、硫酸错等；（2) ISA720佐剂；（3)福氏佐剂等。
[0104] 疫苗组合物（包括抗原，药学上可接受的载体和/或佐剂），通常含有稀释剂，如 水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等可存在于这 类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中 的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
[0105] 更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以 及上述其它所需的组分。"免疫有效量"指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预 防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别（如非人 灵长类等）、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗 状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验 来确定。
[0106] 通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还 可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在 脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。
[0107] 常规方法是从肠胃外（皮下或肌内）途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其 它给药方式的其它配方包括口服、栓剂和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方 案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。
[0108] -种疫苗方式是DNA疫苗，即含有编码本发明重组蛋白的编码序列的DNA疫苗。
[0109] 联合免疫
[0110] 疟原虫生活史复杂，在人体内先后寄生于肝细胞和红细胞内，进行裂体增殖。其子 孢子在进入人体后，随血侵入肝细胞，摄取肝细胞内应用进行发育并裂体增殖，形成红外期 裂殖体。红外期裂殖子从肝细胞释放出来后，进入血流后很快侵入红细胞，进行红内期裂体 增殖。
[0111] 疟原虫的抗原具有明显的期特异性，由期特异抗原产生的免疫力只对本期疟原虫 有作用，也就是说红外期抗原产生的免疫只对子孢子和肝内原虫有效，而对红内期疟原虫 无效。这样，若红外期疫苗不能100%有效，当个别子孢子逃避红外期疫苗保护，这些子孢子 即可产生大量裂殖子进入红内期繁殖，由于红外期疫苗对红内期原虫无效，因此红内期原 虫繁殖即可致病乃至致命。因此，一个有效的疫苗最好由针对疟原虫多个生长环节的抗原 组成，这样可增强疫苗的有效性和克服疟原虫变异性等问题。特别是将红内期抗原与红外 期抗原联合，这种联合疫苗对红内期和红外期原虫均能产生杀灭作用。
[0112] 本发明人发现，本发明的重组蛋白可有效地引起针对红外期恶性疟原虫的免疫应 答，其与红内期候选疫苗PfCP-2. 9的联合免疫试验中未发现抗原竞争性免疫抑制现象，并 且联合免疫血清能够更有效抑制疟原虫的生长。因此，本发明的重组蛋白与红内期候选疫 苗PfCP-2. 9可以作为抗疟疾多价联合疫苗的组成成分。
[0113] 抗体
[0114] 本发明还包括对本发明的重组蛋白或其编码DNA具有特异性的多克隆抗体和单 克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于本发明的重组蛋白或其片 段。较佳地，指那些能与本发明的重组蛋白或其片段结合但不识别和结合于其它非相关抗 原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的本发明的重组蛋白结合的抗 体。
[0115] 本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片 段，如Fab'或（Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗 体。
[0116] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如， 纯化的本发明的重组蛋白，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表 达本发明的重组蛋白的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以 利用杂交瘤技术来制备（见Kohler等人，Nature 256 ;495, 1975 ;Kohler等人，Eur. T. Tmmunol. 6:511，1976 ;Kohler 等人，Rur. T. Tmmunol. 6:292, 1976 ；Hammerl ing 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981)〇
[0117] 多克隆抗体的生产可用本发明的重组蛋白或多肽免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠 等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于福氏佐剂、ISA720佐剂等。
[0118] 本发明的主要优点在于：
[0119] (1)本发明的重组蛋白作为抗原可非常有效地引起免疫应答，在动物体内可产生 高水平的特异性抗体。
[0120] (2)本发明的重组蛋白与红内期疟疾候选疫苗PfCP-2. 9作为联合疫苗免疫动物 时，不发生抗原竞争性现象。免疫血清能识别红内期原虫和子孢子，含有高水平的能抵抗子 孢子入侵的NANP四肽重复区抗体，并能抑制疟原虫体外生长。
[0121] (3)本发明的重组蛋白采用毕氏酵母分泌表达系统表达，由此产生的蛋白的构象 非常接近天然PfCSP的C-末端结构。
[0122] (4)本发明的重组蛋白的表达产物能分泌到胞外，并进入无蛋白培养上清，便于分 离纯化。此外，根据该蛋白高等电点的特性，建立简便高效以离子交换纯化为基础的制备工 艺纯度可达95%以上。
[0123] (5)本发明的重组蛋白的表达水平高，在15L发酵罐中表达产量在lg/L以上。
[0124] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人的分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0125] 实施例I PfCSP-C和PfCSP-RC基因的合成
[0126] 1.重组蛋白的设计
[0127] 本发明PfCSP-C和PfCSP-RC重组蛋白的序列来自恶性疟原虫3D7株环子孢子表 面蛋白的氨基酸序列，其氨基酸序列见GenBank登录号：X15363(SEQ ID N0:8)。
[0128] PfCSP-C重组蛋白由PfCSP的C末端区域（不含锚定区）组成，PfCSP-RC重组蛋 白由PfCSP的RI区、中心重复区以及C末端（不含锚定区）组成，各个功能区直接相连。图 1显示了本实施例构建的天然PfCSP、PfCSP-C和PfCSP-RC的蛋白结构的示意图。
[0129] 此外，在融合抗原的N端增设XhoI克隆位点（Leu-Glu)和酿酒酵母α -因子信号 肽切割序列（Lys-Arg)。鉴定出该抗原序列中一个潜在糖基化位点（SEQ ID Ν0:2中的第 114位氨基酸，和SEQ ID NO: 4中的第203位氨基酸），并通过将氨基酸Asn转为Ala (SEQ ID N0:2中的114Asn，和SEQ ID N0:4中的203Asn)而排除这一个糖基化位点。
[0130] 这样，PfCSP-C重组抗原由116个氨基酸组成，如SEQ ID NO: 2所示，而PfCSP-RC 融合抗原由205个氨基酸组成，见SEQ ID NO:4所示。
[0131] 2.重组抗原基因的设计
[0132] 选用酵母密码子使用频率，将PfCSP-C和PfCSP-RC氨基酸序列逆转录成DNA序 列，产生PfCSP-C和PfCSP-RC合成基因。
[0133] 并且，采用计算机DNA软件（DNAstar)对该基因进行检测，并排除在该基因中不利 于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。
[0134] 最终获得的PfCSP-C合成基因的全长为360bp，如SEQ ID NO: 1所示，而PfCSP-RC 为627bp，如SEQ ID N0:3所示（3'端的12个碱基是转录终止序列TaaTag和克隆位点 EcoRI)〇
[0135] 3.融合抗原基因的合成
[0136] PfCSP-RC基因的构建：
[0137] 627bp PfCSP-RC基因由8条寡核苷酸链拼接而成（Overlap PCR法）。相邻两条 链设有18?20bp的重叠区。用PCR方法将8条链拼接成双链DNA分子，合成示意图见图 2A。PCR扩增条件为：95°C 10秒（变性）、55°C 30秒（退火）和72°C 1分30秒（延伸）， 每次25个循环。
[0138] PCR产物用1 %琼脂糖胶分离，并用Qiagen DNA回收试剂盒分离目的基因。用XhoI 和EcoRI双酶切目的基因片段，酶切条件为：在20 μ 1反应体系中含有2 μ g目的基因片段， IX酶切缓冲液，XhoI及EcoRI酶各5单位，37°C反应1小时。酶切片段与经同样酶切的 pBluscript载体（购于Invitrogen公司）连接，并转化感受态DH5a大肠杆菌。抽提氨卞 青霉素抗性菌落的质粒DNA，经双酶切鉴定为正确插入后进行DNA序列分析。在所测2个克 隆中，有一个克隆的序列无任何错误碱基。于是形成627bp全长PfCSP-RC合成基因 （SEQ ID NO:3)〇
[0139] 为使PfCSP-RC基因能在毕氏酵母中分泌表达，本发明人在设计基因时，已经在 该基因5'端进行修饰，S卩加上编码Lys和Arg两个氨基酸的DNA序列，这两个氨基酸是 a -因子信号肽切割位点的序列。在PfSCP-RC基因的5'及3'端分别含有XhoI及EcoRI 位点用于该基因克隆入表达载体。
[0140] PfCSP-C基因的构建：
[0141] 合成以下一对引物：
[0142] 5' 引物序列 Pa(SEQ ID NO:5):
[0143] ccg etc gag aaa aga aac aag aat aac caa ggt ；
[0144] 3' 引物序列 Pb (SEQ ID NO: 6):
[0145] egg gaa ttc eta tta tga gga tgc aac tac at〇
[0146] 以前述制备的PfCSP-RC基因为模板，用以上引物进行PCR反应，获得 360bpPfCSP-C基因，合成示意图见图2B。
[0147] 将上述获得的基因克隆入pBluscript载体进行序列分析。证实无错误序列的 PfCSP-C基因用于表达研宄。
[0148] 实施例2 PfCSP-C和PfCSP-RC基因在毕氏酵母中分泌表达
[0149] 2. 1表达载体的构建
[0150] PfCSP-C和PfCSP-RC基因通过XhoI和EcoRI位点插入到pPIC9酵母表达质粒（购 于Invitrogen公司）。这样，重组蛋白的N端与该载体上酿酒酵母α -因子信号肽C末端 融合。由于重组蛋白分子N端含有该信号肽切点3个特异氨基酸Glu-Iys-Arg序列。故分 泌表达释放的目的蛋白不含信号肽序列。
[0151] PPIC9K载体的基本元件与pPIC9相同，但它带有卡那霉素抗性基因，可用G418 进行高拷贝插入子的筛选。这样，用BamH I和EcoR I将含PfCSP-C和PfCSP-RC片段从 pBluscript载体切出，并插入pPIC9K表达质粒的相应位点中，构建成pPIC9K/PfCSP-C (图 3)和 pPIC9K/PfCSP-RC (图 4)。
[0152] 2. 2转化毕氏酵母GS115
[0153] 用 Sal I 将 pPIC9K/PfCSP-C 和 pPIC9K/PfCSP-RC 质粒分别线性化，IOyg 线性化 表达质粒电转化GSl 15毕氏酵母（购于Invitrogen公司）。
[0154] 转化菌先用组氨酸缺陷平板筛选His+转化子，然后用不同浓度G418平板筛选多 拷贝插入的转化子。
[0155] 抽提不同转化子的基因组DNA，用一对目的基因内部引物PCR加以鉴定，表明表达 质粒插入酵母染色体。经鉴定有插入的转化子用于以下表达研宄。
[0156] 2. 3 PfCSP-C 和 PfCSP-RC 表达
[0157] 转化子先接种在以甘油为碳源的培养基中，生长24小时后，转接到的以甲醇为碳 源的培养基中。进行诱导表达。每24小时取样、检测表达产物上清和细胞沉淀。
[0158] SDS-PAGE和考马斯亮蓝检测结果显示：在16. 5kD处有明显的PfCSP-C表达条带， 该表达带只在甲醇诱导后出现，并随表达时间延长，其表达产物明显增加，见图5A。在31kD 处有明显的PfCSP-RC表达条带，该表达带只在甲醇诱导后出现，并随表达时间延长，其表 达产物明显增加，见图5B。
[0159] 用兔抗PfCSP抗血清进行免疫印迹法检测表达产物，结果可见目的蛋白印迹，见 图6,其中，1表示PfCSP-C的印迹，2表示PfCSP-RC的印迹。
[0160] 实施例3 PfCSP-C和PfCSP-RC发酵与纯化
[0161] 经对表达条件的优化研宄，摇瓶表达水平可达100mg/L。用15L灌进行发酵表达。 在整个发酵周期中，前期的细胞呈指数生长上升，细胞密度达〇D_= 100。到甘油添加生长 期，细胞生长呈直线上升，细胞密度达到〇D_= 560。但到了甲醇诱导表达阶段，细胞总密 度基本保持不变，而目的蛋白表达是在甲醇加入后3-7hr开始，并随时间延长，表达产率迅 速提高，并不断分泌到发酵液中，这两个重组蛋白的表达量可达lg/L以上。
[0162] PfCSP-C和PfCSP-RC表达产物的纯化分两步进行：由于这两个重组蛋白的等电 点分别为7. 23和8. 66,因此第一步可以用阳离子交换柱纯化。第二步是用凝胶过滤层析 纯化。经两步纯化的蛋白纯度可达95%。纯化的PfCSP-C(I)和PfCSP-RC(2)重组蛋白的 SDS-PAGE电泳图见图7。
[0163] 实施例4 PfCSP-C和PfCSP-RC免疫小鼠和家兔
[0164] 在该实施例中，用纯化的PfCSP-C和PfCSP-RC为抗原，用ISA720为免疫佐剂免疫 家兔，实验分为6组：
[0165] 第一组：ISA720+PfCP-2. 9 ;
[0166] 第二组：ISA720+PfCSP_C ;
[0167] 第三组：ISA720+PfCSP-RC ;
[0168] 第四组：ISA720+PfCP-2. 9+PfCSP-C ;
[0169] 第五组：ISA720+PfCP-2. 9+PfCSP-RC ;
[0170] 第六组：ISA720佐剂对照。
[0171] 免疫分4次进行，每次免疫分别在第0、20、40、和61天进行。每次免疫前及免疫结 束后两周左右取血测定特异抗体水平。具体方法如下：
[0172] 重组蛋白与ISA720佐剂按3:7的比例混合，用注射器抽吸乳化至均匀。免疫剂量 为每只家兔200 μ g，为Iml体积。采用皮下多点注射。四次免疫注射时间分别在DO、D20、 D40和D61。在首次免疫后D33和D54、D75取血测定抗体ELISA及IFA滴度。
[0173] ELISA按以下程序进行：
[0174] 采用重组蛋白为抗原，每孔包被量为0. 1 μ g，加入不同稀释度的抗血清100 μ 1， 每份稀释血清样本重复三孔，经37°C反应Ihr和洗涤后，加入酶标二抗，用TMD底物显色， 并读取450mM OD值。用免疫前血清确定阳性阈值，大于该值的稀释度为抗血清阳性最终滴 度。
[0175] IFA按以下程序进行：
[0176] 按国际上通用的Trager氏蜡烛缸法体外培养恶性疟原虫FCC1/HN株，待生长至裂 殖体阶段时取培养液进行涂片。自然干燥，预冷甲醇固定15分钟。用IOmM PH7.4PBS洗片， 然后用含3%脱脂奶粉的PBS封闭30分钟。待检血清用封闭液从1 :20开始对倍稀释，共 6个稀释度；一张玻片分成8格，每格加一个稀释度的样品，剩余两格加阳性血清和免疫前 血7清（皆为1 :20稀释）。37°C孵育1小时，然后用PBS液洗片3次，5min/次。FITC标 记的抗人IgG用封闭液1:100稀释，然后加到玻片上各个样品所对应的反应位点上。37°C 孵育1小时，然后用PBS液洗片3次，置于暗处，晾干片子。荧光显微镜下读片，先观察阳性 对照，判断反应体系是否正常。然后，观察阴性对照，应该出现比较暗淡的背景，而不能出现 较为明显的荧光裂殖子。这两个对照正常的前提下，从最低稀释度开始从低到高观察样品 反应情况，以出现荧光裂殖子的数目明显多于阴性对照时的最大稀释度为该样品的IFA滴 度。对于针对子孢子的IFA试验，则用恶性疟原虫子孢子代替红内期疟原虫。
[0177] 表1显示了以PfCP-2. 9、PfCSP-C、PfCSP-RC或其组合作为抗原，与佐剂ISA720混 合后，单独免疫或联合免疫小鼠和兔后，血清中PfCP-2. 9、PfCSP-C和PfCSP-RC特异IgG的 水平。各组分别为 ISA720 佐剂；ISA720 佐剂 +PfCP-2. 9 ;ISA720 佐剂 +PfCSP-C ;ISA720 佐 剂 +PfCSP-C+PfCP-2. 9 ;ISA720 佐剂 +PfCSP-RC ;ISA720 佐剂 +PfCSP-RC+PfCP-2. 9。ELISA 结果显示，佐剂对照组没有产生特异性抗体，其余组均产生很高的特异性抗体水平，而且 PfCSP-C和PfCSP-RC重组蛋白单独免疫与联合免疫组之间没有明显差异。
[0178] 表 1
[0179]
【权利要求】
1. 一种分离的DNA分子，其特征在于，该DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3中第 13-627位所示。
2. -种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子。
3. -种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母细胞， 它含有权利要求2所述的载体；或 它的基因组中整合有权利要求1所述的DNA分子。
【文档编号】C12N15/81GK104480129SQ201410673734
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2006年12月1日 优先权日:2006年12月1日
【发明者】潘卫庆, 张青锋 申请人:中国人民解放军第二军医大学