一种稳定性强的血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种稳定性强的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，属于临床体外检测【技术领域】。本发明采用单一试剂方法检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT），以酶偶联的连续检测法为基础，解决了原有配方中单一试剂中不稳的问题，操作简单方便，有利于临床的应用和推广。
【专利说明】一种稳定性强的血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种稳定性强的血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂，属于临床体外检测
【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 丙氨酸氨基转移酶(ALT)是一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶(相当于工业生 产中的催化剂)，起加快体内蛋白质氨基酸在体内转化的作用，它广泛存在于人体各种组 织、器官、肌肉、骨骼中，以肝脏细胞的细胞浆中最多，血清中ALT的正常含量参考值是：男 9-51U/L，女8-41U/L (各医院的测试方法不同，参考值不完全相同)。当人体内各组织器官 活动或病变时，就会把其中的ALT释放到血液中，使血清ALT含量增加。例如，肝脏发炎时， 转氨酶就会从肝细胞释放到血液中，肝脏有病，血清转氨酶一定增高，当肝细胞千分之一有 炎症时，血清转氨酶含量就会增高一倍以上，因此，血清转氨酶数量是肝脏病变程度的重要 指标。
[0003] ALT升高临床意义就在于对急性乙型肝炎、慢性肝炎、HBV携者、重型肝炎以及肝 硬化、肝癌等一系列病毒性肝炎的诊断和分析，ALT的升高只表示肝脏可能受到了损害。除 了肝炎，其他很多疾病都能引起谷丙转氨酶转氨酶升高。
[0004] ALT检测方法众多，国内过去多使用比色法检测血液ALT，目前主要开展的为酶偶 联的连续检测法。前者操作简单，不需要特殊的仪器和试剂，但结果不够准确，重复性差，效 果不理想；后者结果准确，是公认的好方法，但是对仪器和试剂有一定的要求。现在市面上 多采用的是双试剂的酶偶联的连续检测方法检测血清ALT，操作步骤较繁琐，而单试剂的酶 偶联的连续检测方法操作简单方便，但试剂中酶和NADH不稳定，容易造成衰减，这为单试 剂方法检测血清ALT带来很大困难。因此本发明针对此问题，特发明了一种稳定性强的单 试剂血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种稳定性强的血液丙氨酸氨基 转移酶检测试剂。该试剂配方为单一试剂，操作简单方便，且试剂具有很好的检测稳定性。 [0006] 本发明所采用的技术方案是： 一种稳定性强的血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于，它为单一试剂配方，其 组成包括以下组分： Tris 缓冲液（pH=7. 8 ) 4〇-60mmol/L L-丙氛酸 400-600mmol/L 氯化钾 lg/L-10g/L EDTA.Na2 5mmol/L_10 mmol/L 海藻糖 lg/L-lOg/L 牛血清白蛋白（BSA) lg/L-lOg/L 二硫苏糖醇 0· lg/L-10g/L EMERGEN A-60 0. lg/L-10g/L Prod in-300 0· 5ml/L_lml/L a-酮戊二酸 10-20mmol/L 乳酸脱氢酶（LDH) 1000-14000U/L NADH 0. 15-0. 25mmol/L。
[0007] 作为本发明的一种优选，它的试剂组成为： Tris 缓冲液（pH=7. 8 ) 50mmol/L L-丙氛酸 500mmol/L 氯化钾 8g/L EDTA. Na2 10 mmol/L 海藻糖 6g/L 牛血清白蛋白（BSA) 6g/L 二硫苏糖醇 6g/L EMERGEN A-60 6g/L Prod in-300 lml/L α _ 丽戊二酸 15mmol/L 乳酸脱氢酶（LDH) 1200U/L NADH 0.18mmol/L〇
[0008] 本发明试剂的配制方法为：先将Tris、L-丙氨酸、氯化钾、海藻糖、BSA、EDTA. Na2 、二硫苏糖醇、EMERGEN A-60和Proclin-300按照配方量依次溶解到IL去离子水中，使用 氢氧化钠调节溶液pH至7. 8,然后依次加入配方量乳酸脱氢酶（LDH)和NADH溶解于上述溶 液中制备完成。
[0009] 本发明的有益效果是： (1) 本发明采用单一试剂方法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，操作简单方便，有利 于临床的应用和推广； (2) 本配方以酶偶联的连续检测法为基础，解决了原有配方中单一试剂中不稳的问题， 本发明优先选择了 Tris-EDTA. Na2缓冲体系，Tris-EDTA. Na2缓冲液能够有效的去除试剂中 重金属离子对NADH的干扰，提高了 NADH的稳定性； (3) 本发明在试剂中还添加了二硫苏糖醇和氯化钾原材料同样能够较好的减缓NADH 在试剂中的哀减，提1?试剂的稳定性； (4) 本发明中还添加了牛血清白蛋白和EMERGEN A-60两种物质作为保护剂，保护LDH 的活性基团不被破坏，能够有效的提高LDH生化试剂的稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是本发明实施例1-3与对照1、2组的37°C 7天热稳定性低值质控试验结果 图； 图2是本发明实施例1-3与对照1、2组的37°C 7天热稳定性高值质控试验结果图； 图3是本发明实施例1-3与对照1、2组的15天开瓶稳定性低值质控试验结果图； 图4是本发明实施例1-3与对照1、2组的15天开瓶稳定性高值质控试验结果图； 图5是本发明实施例1-3与对照1、2组的37°C 7天热稳定性试剂空白趋势图； 图6是本发明实施例1-3与对照1、2组的15天开瓶稳定性试剂空白趋势图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0012] 实施例1 一种稳定性强的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其试剂组成为： Tris 缓冲液（pH=7. 8 ) 40mmol/L L-丙氛酸 400mmol/L 氯化钾 lg/L EDTA-Na2 5mmol/L 海藻糖 lg/L 牛血清白蛋白（BSA) lg/L 二硫苏糖醇 〇. lg/L EMERGEN A-60 0. lg/L Prod in-300 0. 5ml/L α _ 丽戊二酸 lOmmol/L 乳酸脱氢酶（LDH) 1000U/L NADH 0·15mmol/L 。
[0013] 上述试剂的配制方法为：先将Tris、L-丙氨酸、氯化钾、海藻糖、BSA、EDTA. Na2、 二硫苏糖醇、EMERGEN A-60和Proclin-300按照配方量依次溶解到IL去离子水中，使用氢 氧化钠调节溶液pH至7. 8,然后依次加入配方量乳酸脱氢酶（LDH)和NADH溶解于上述溶液 中制备完成。
[0014] 实施例2 一种稳定性强的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其试剂组成为： Tris 缓冲液（pH=7. 8 ) BOmmoI /T, L-丙氛酸 600mmol/L 氯化钾 l〇g/L EDTA. Na2 10 mmol/L 海藻糖 l〇g/L 牛血清白蛋白（BSA) l〇g/L 二硫苏糖醇 l〇g/L EMERGEN A-60 10g/L Proclin-300 lml/L α _ 丽戊二酸 20mmol/L 乳酸脱氢酶（LDH) 14000U/L NADH 0·25mmol/L 。
[0015] 本实施例试剂制备方法同实施例1。
[0016] 实施例3 一种稳定性强的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其试剂组成为： Tris 缓冲液（pH=7. 8 ) 50mmol/L L-丙氛酸 500mmol/L 氯化钾 8g/L EDTA. Na2 10 mmol/L 海藻糖 6g/L 牛血清白蛋白（BSA) 6g/L 二硫苏糖醇 6g/L EMERGEN A-60 6g/L Prod in-300 lml/L α _ 丽戊二酸 15mmol/L 乳酸脱氢酶（LDH) 1200U/L NADH 0.18mmol/L〇
[0017] 本实施例试剂的制备方法同实施例1。
[0018] 将本发明实施例1-3制得的试剂进行稳定性试验验证。验证试验分为15天开平 稳定性和7天37°C热稳定性验证。以市场上现有的某公司生产的单试剂丙氨酸氨基转移酶 检测试剂作为对照1，以市场上现有的北京某公司出售的双试剂丙氨酸氨基转移酶检测试 剂ALT(14-0912P)作为对照2,进行对比验证试验。
[0019] 试验所用校准品和质控品分别为： 校准品：朗道复合标准（848UN)其中ALT的含量为38U/L 质控品：朗道复合高值质控：620UE(ALT靶值：131 U/L，靶值范围：105-157U U/L);朗 道复合低值质控：897UN(ALT靶值：38U/L，靶值范围：30-46U/L)。
[0020] 试剂稳定性验证具体操作方法： 首先将本发明实施例1-3中的检测试剂按照配方配置好并分别命名为1-3试验组，取 市场上现有的一种单试剂丙氨酸氨基转移酶检测试剂作为对照1组，取市场上现有的某公 司出售的双试剂丙氨酸氨基转移酶检测试剂作为对照2组；分别自上述5组试剂中各取相 同的两组，一组做15天开瓶稳定性试验，将试剂开瓶放置在仪器的2-8°C冷藏箱中（15天不 取出），作为15天开瓶稳定性检测；另一组做37°C热稳定性检测，封闭放置在37°C恒温水浴 锅中（每天仅在检测的时候取出，检测完毕后，依然封口放回37°C水浴锅中，连续7天)，作 为7天37°C热稳定性验证试验。将对照2组试剂按照常规双试剂检测方法在东芝-120全 自动生化分析仪器进行检测，将实施例1-3和对照1组试剂同时在东芝-120全自动生化分 析仪器上按照如下表1方法进行检测，并在仪器上建立标准曲线。分别取朗道的高、低值冻 干粉质控品，溶解均匀后，各自平均分成15份，-20°C储存，每天高、低值质控各取一个，并 且跟踪检测结果，其跟踪监测趋势如图1-4。每天检测各组试剂的试剂空白，检测结果如图 5,图 6。
[0021] 表I ALT (丙氨酸氨基转移酶）检测试剂检测方法
【权利要求】
1. 一种稳定性强的血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于，它为单一试剂配方， 其组成包括以下组分： Tris 缓冲液（pH=7. 8 ) 4〇-60mmol/L L_ 丙氛酸 400-600mmol/L 氯化钾 lg/L-10g/L EDTA. Na2 5mmol/L_10 mmol /T, 海藻糖 lg/L-lOg/L 牛血清白蛋白（BSA) lg/L-lOg/L 二硫苏糖醇 0? lg/L-lOg/L EMERGEN A-60 0. lg/L-10g/L Prod in-300 0? 5ml/L_lml/L a-酮戊二酸 10-20mmol/L 乳酸脱氢酶（LDH) 1000-14000U/L NADH 0?15-0. 25mmol/L。
2. 根据权利要求1所述的血液丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于，它的试剂组 成为： Tris 缓冲液（pH=7. 8 ) 50mmol/L L_ 丙氛酸 500mmol/L 氯化钾 8g/L EDTA. Na2 10 mmol /T, 海藻糖 6g/L 牛血清白蛋白（BSA) 6g/L 二硫苏糖醇 6g/L EMERGEN A-60 6g/L Prod in-300 lml/L a _ 丽戊二酸 15mmol/L 乳酸脱氢酶（LDH) 1200U/L NADH 0.18mmol/L〇
【文档编号】C12Q1/32GK104404127SQ201410698137
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】杨君莉, 罗维晓, 甘宜梧, 谭柏清, 王绮, 朱玉娥, 肖慧 申请人:山东博科生物产业有限公司