一株降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌及其用途
【专利摘要】本发明公开了一株降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌及其用途。该降解乙草胺和杂草焚的细菌是根瘤菌(Rhizobium sp.)198-R-47，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.9867。本发明提供的根瘤菌(Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No.9867在无机盐培养基中7天对50mg/L乙草胺的降解率达到73.65％；对100mg/L杂草焚的降解率达到9.04％。这表明该菌株能够降解乙草胺和/或杂草焚，在修复土壤除草剂乙草胺和/或杂草焚污染方面具有广阔的应用前景。CGMCC No986720141028
【专利说明】一株降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域中一株降解除草剂乙草胺和杂草焚的细菌及其用途。
【背景技术】
[0002] 乙草胺，英文通用名称acetochlor，化学名称是2-乙基-6甲基-N-乙氧基甲 基_ α _氯代乙酰替苯胺。
[0003] 乙草胺是内吸性酰胺类除草剂，是选择性的芽前除草剂。能被杂草的幼芽和幼根 吸收，抑制杂草蛋白质合成，而使杂草死亡。主要用于大豆、花生、玉米、棉花等作物防除一 年生禾本科杂草和部分阔叶杂草，对大豆菟丝子有良好防效，对多年生杂草无效。
[0004] 杂草焚，又名三氟羧草醚，英文名称acifluorfen，化学名称5-(2-氯-α，α， 三氟对甲苯氧基）2-硝基苯甲酸。
[0005] 杂草焚是二苯醚类除草剂，属接触性除草剂，是原卟啉氧化酶抑制剂。通常采用 25%水剂进行大豆苗前表土处理及苗后经叶喷雾，可有效防除大豆田阔叶杂草如苍耳、苘 麻、龙葵、览、藜、寥、牵牛、豚草、曼陀罗、马齿览、铁览菜、鬼针草、融瓣花、鸭妬草等，苗后早 期处理也可防除包括狗尾草在内的一年生禾本科杂草。喷药后，大豆会不同程度受害，表现 为叶片黄化、皱缩、褐变等，但6?7d后恢复正常。
[0006] 乙草胺和杂草焚半衰期较短，一直被认为是一种低毒的环境友好型农药，但近年 来频繁、过量或使用不当，对农田土壤和地下水等造成了不同程度的污染，对后茬作物的危 害也越来越严重。研究表明，在环境中大量施用乙草胺和杂草焚造成一定的残留毒性，其在 地下水、地表水中可以残留数年，进入到环境中通过食物链在生物体内不断富集，对鱼类有 较强的毒性，对环境污染很大。尤其乙草胺可以引起生物体的内分泌紊乱，造成不育、不正 常的性别差异甚至致癌，已被美国环保局定为致癌物。
[0007] 自然界除草剂残留的降解主要依靠土壤中微生物来完成，但自然降解十分缓慢。 因此，有针对性地筛选高效微生物菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加速土壤除草剂 残留的降解消除农田除草剂残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是如何降解除草剂乙草胺和杂草焚。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供了一株可以降解除草剂乙草胺和杂草焚的细 菌。
[0010] 本发明提供的细菌是根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47,该菌株已于2014年10月 28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No. 9867。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867〇
[0012] 上述菌剂可为下述1)或2)所述菌剂：
[0013] 1)用于降解除草剂乙草胺和/或杂草焚的菌剂；
[0014] 2)用于修复土壤除草剂乙草胺和/或杂草焚污染的菌剂。
[0015] 所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可 为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白 碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一 种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、 矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培 养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述 组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒 剂。
[0016] 根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、稳 定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。
[0017] 所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867 或以根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867为活性成分的菌剂在降解除草剂乙草胺和/或杂草焚中的应 用也属于本发明的保护范围。
[0018] 所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867 或以根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867为活性成分的菌剂在修复土壤除草剂乙草胺和/或杂草焚污 染中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019] 本发明的再一个目的是提供一种培养根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867的方法。
[0020] 本发明所提供的培养根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867的方法， 包括将根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867在用于培养根瘤菌的培养基中培 养的步骤。
[0021] 本发明的又一个目的是提供一种以根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867为活性成分的菌剂的制备方法。
[0022] 本发明所提供上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的根瘤菌（Rhizobium sp. )198-R-47 CGMCC No. 9867作为活性成分，得到所述菌剂。
[0023] 本发明是从长期受到除草剂污染的农田采集土样，并从中分离筛选得到的除草剂 乙草胺和/或杂草焚降解菌根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47 CGMCC No. 9867。实验证明， 该菌株在无机盐培养基中7天对50mg/L乙草胺降解率达到73. 65% ;对100mg/L杂草焚的 降解率达到9. 04%。这表明该菌株能降解除草剂乙草胺和/或杂草焚，在修复土壤除草剂 乙草胺和杂草焚污染方面具有广阔的应用前景。
[0024] 保藏说明
[0025] 菌种名称：根瘤菌
[0026] 拉丁名：（Rhizobium sp.)
[0027] 菌株编号：198-R_47
[0028] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0029] 保藏机构简称：CGMCC
[0030] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0031] 保藏日期：2014年10月28日
[0032] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 9867
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 下述实施例中所用的培养基如下：
[0036] 无氮液体培养基：溶质及其浓度为蔗糖10g/L，NaCl 0· 12g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5g/ L，CaCO3 lg/L，MgSO4 · 7H20 0· 2g/L ;溶剂为蒸馏水；ρΗ7· 2。
[0037] 无氮固体培养基：向无氮液体培养基中加琼脂至其含量为15_20g/L得到的培养 基。
[0038] 牛肉膏蛋白胨液体培养基：溶质及其浓度为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L;溶剂为蒸馏水；pH7.2。
[0039] 牛肉膏蛋白胨固体培养基：溶质及其浓度为牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L、琼脂15-20g/L ;溶剂为蒸馏水；pH7. 2。
[0040] 无机盐液体培养基：溶质及其浓度为NH4Cl I. Og/L，KH2PO4 0· 5g/L，K2HPO4 I. 5g/ L，MgSO4 0· 2g/L，NaCl 0· 5g/L ;溶剂为蒸馏水；ρΗ7· 0。
[0041] 无机盐固体培养基：向无机盐液体培养基中加琼脂至其含量为2%得到的培养 基。
[0042] 下述实施例中的根瘤菌（Rhizobium sp.) LD1616CGMCC No. 7775 (简称根瘤菌 (Rhizobium sp.)LD1616)已在中国发明专利文献CN 103343100B中公开。
[0043] 实施例 1、根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47 CGMCC No. 9867 的分离与鉴定
[0044] 一、乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47的分离
[0045] 1、在IOOrnl无菌水中加入IOg土壤样品（采自中国黑龙江黑河受除草剂污染的农 田），振荡培养30min制成混浊液。吸取Iml上述混浊液加入盛有9ml无菌水中的试管中充 分混匀（此时稀释度记为KT 1)，然后从此试管中吸取Iml加入到另一盛有9ml无菌水的试 管中混合均匀，以此类推制成10_2、10_ 3、10_4、10_5不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.11111 均匀涂布在无氮固体培养基平板上，28°C恒温静置培养2- 3天。待菌落形成后，在无氮固 体培养基平板上进行菌种纯化。
[0046] 2、对除草剂乙草胺、杂草焚、普施特和氯嘧磺隆降解能力的初步筛选采用平板透 明圈法。将乙草胺标准品（Fluka公司产品）加入无机盐固体培养基使其含量为IOOOmg/ L，得到乙草胺平板；将杂草焚标准品（Fluka公司产品）加入无机盐固体培养基使其含量为 1000mg/L，得到杂草焚平板；将普施特标准品（Fluka公司产品）加入无机盐固体培养基使 其含量为l〇〇〇mg/L，得到普施特平板；将氯嘧磺隆标准品（Fluka公司产品）加入无机盐固 体培养基使其含量为l〇〇〇 mg/L，得到氯嘧磺隆平板。将乙草胺平板、杂草焚平板、普施特平 板和氯嘧磺隆平板进行分区，吸取步骤1纯化得到的每株菌的菌悬液10 μ L和本实验室的 根瘤菌（Rhizobium sp. )LD1616的菌悬液10μ L(各种菌株菌悬液的菌体含量相同）分别点 种到四种平板上（每株菌在一个平板上重复3次），28°C培养、观察。筛选到一株在乙草胺 平板和杂草焚平板上均能形成较大透明圈的菌株，将该菌株其命名为乙草胺/杂草焚降解 菌198-R-47。乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47在普施特平板和氯嘧磺隆平板均不能形成 透明圈。根瘤菌（Rhizobium sp.)LD1616只在氯啼磺隆平板上形成较大透明圈，在普施特平 板、乙草胺平板和杂草焚平板上均不能形成透明圈。说明乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47 能降解乙草胺和杂草焚，不能降解氯啼磺隆和普施特；根瘤菌（Rhizobium sp.)LD1616能 降解氯嘧磺隆，不能降解普施特、乙草胺和杂草焚。
[0047] 表L乙草胺/杂草焚降解菌198-R-47和根瘤菌（Rhizobium sp. )LD1616对四种 除草剂降解能力初筛结果
【权利要求】
1. 根瘤菌（Rhizobium sp. )198-R-47,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心的保藏编号为CGMCC No. 9867。
2. -种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867〇
3. 根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述1)或2)所述菌剂： 1) 用于降解乙草胺和/或杂草焚的菌剂； 2) 用于修复土壤乙草胺和/或杂草焚污染的菌剂。 4?权利要求1所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47CGMCC No. 9867、或权利要求2 或3所述的菌剂在降解乙草胺和/或杂草焚中的应用。 5?权利要求1所述的根瘤菌（Rhizobium sp.) 198-R-47CGMCC No. 9867、或权利要求2 或3所述的菌剂在修复土壤乙草胺和/或杂草焚污染中的应用。
6. 培养权利要求1所述根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867的方法，包括 将所述根瘤菌（Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867在用于培养根瘤菌的培养基中培 养的步骤。
7. 权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的根瘤菌 (Rhizobium sp.)198-R-47CGMCC No. 9867作为活性成分，得到所述菌剂。
【文档编号】C12N1/20GK104388355SQ201410705138
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】高淼, 孙建光, 孙颖飞, 张磊 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所