一种牛初乳生长因子粗提物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种牛初乳生长因子粗提物及其制备方法和应用，制备方法包括：(1)将牛初乳通过离心机离心，除去脂肪获得脱脂牛初乳；(2)酸法沉淀脱脂牛初乳中的酪蛋白，获得乳清液体；(3)采用陶瓷膜超滤仪进行两次超滤，除去乳清中残留的大分子蛋白质，获得超滤渗透液；(4)利用透析袋透析，脱盐；(5)冷冻干燥，即得。本发明超滤分离过程都在室温附近的温度下进行，不易使活性蛋白变性，低能耗，无相变；整个过程都是在液体中进行，增强了多肽稳定性，且都是在无机相中进行，无有机相参与，使制备的牛初乳生长因子粗提物更加安全可靠。本发明制得的牛初乳生长因子粗提物含有多种生长因子，且浓度高，可用于制备防治肠炎保健品。
【专利说明】一种牛初乳生长因子粗提物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粗提物及其制备方法，特别涉及一种牛初乳生长因子粗提物及其 制备方法和在制备防治肠炎保健品中的应用，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 现代生活节奏的加快，饮食不规律，胃肠病发生率越来越高，日常生活中人们几乎 都会患有不同程度地发生急性或慢性胃肠病。数据显示我国有近30%的人患有各种胃炎， 目前全国胃病患者的总人数粗略估计就有近4亿人，而且其中40%病情严重。胃肠炎发展 会导致细胞损伤、坏死脱落，机械屏障破坏，通透性增加，加上伴随的肠内菌群失调，细菌与 内毒素移位，肠黏膜及系膜内免疫组织产生炎性反应，进一步损伤肠黏膜。严重的黏膜损伤 不仅有大出血的潜在威胁，而且介导肠源性感染，引发全身性的病理、生理、及内脏功能紊 乱。因此，如何减轻黏膜损伤，促进损伤后再修复，保持肠黏膜结构完整成为当前医学领域 研宄的一个重要课题。
[0003] 牛初乳是自然界中唯一含有两类主要生长因子（类胰岛素生长因子（IGF-I，II) 和转化生长因子（TGF-β 1，β 2)的天然产物，而且IGF-I和TGF-β 2也是初乳中含量最高 的两种生长因子，EGF在分泌初期含量较多。初乳还含有其他生长因子，如血小板生长因子 (TOGF)、上皮生长因子（EGF)、成纤维生长因子（FGF)等。牛初乳生长因子能刺激表皮、上皮 和胚胎细胞的增殖，抑制胃酸分泌，促进伤口愈合和骨吸收，在胚胎发生、组织修复、骨和结 缔组织形成中起重要作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种牛初乳生长因子粗提物的制备方法以及由该制备方 法制备得到的牛初乳生长因子粗提物。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
[0006] 一种牛初乳生长因子粗提物的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)将牛初乳通过离心机离心，除去脂肪获得脱脂牛初乳；
[0008] (2)酸法沉淀脱脂牛初乳中的酪蛋白，获得乳清液体；
[0009] (3)采用陶瓷膜超滤仪进行两次超滤，除去乳清中残留的大分子蛋白质，获得超滤 渗透液；
[0010] ⑷利用透析袋透析，脱盐；
[0011] (5)冷冻干燥，即得牛初乳生长因子粗提物。
[0012] 本发明中，优选的，步骤（1)所述牛初乳为健康母牛分娩后2天内的乳汁；所述离 心的条件为：4°C下，7000r/min离心15min。
[0013] 本发明中，优选的，步骤（2)所述酸法沉淀脱脂牛初乳中的酪蛋白的具体步骤： 10111〇1/1!1(：1调节脱脂牛初乳？!1至2.5，常温下保存1811后，再用10111〇1/1似0!1调节到？!1 4. 6,之后4°C下，10000r/min离心30min，收集乳清。
[0014] 本发明中，优选的，步骤（3)第一次超滤所用陶瓷膜的截留分子量为300Ku，第二 次超滤所用陶瓷膜的截留分子量为l〇〇Ku，超滤时操作压力0. 15MPa，流量5L/h，温度25°C。
[0015] 本发明中，优选的，步骤（4)所述透析袋的截留分子量为3500U ;所述透析的条件 为：在蒸馏水中4°C过夜平衡。
[0016] 超滤（Ultrafiltration)技术是一种膜过滤法，也有错流过滤（Cross Filtration)之称。连接并清洗滤膜和系统，蒸馏水排空，清洗3遍循环清洗lOmin，排空后 重新倒入IL蒸馏水。将牛初乳生长因子粗提液按比例用蒸馏水稀释，准备好原液瓶和超滤 液瓶。关闭膜壳渗透侧出口阀（隔膜阀），打开进料泵前的管底阀（全开启），缓慢打开膜 滤器浓液调节阀（全开启）、回流阀（半开），确定泵内已充满料液，关小或关闭回流阀后， 方可开启进料泵。调整膜滤器浓液调节阀开度，确认进料泵出口压力在〇. 28- 0. 35MPa之 间。观察浓液回流管出口的出液情况，稳定流量后，同时观察膜组件入口压力值，略关小浓 液回流控制阀，使之符合压力要求。打开渗透侧出液隔膜阀，从出液管观察滤液出液情况。 缓慢关小浓液回流控制阀，使膜组件入口压力值缓慢升高到0.28-0. 40MPa之间。调节阀浓 液回流调节阀及渗透侧出液隔膜阀，观察渗透侧背压，使膜操作压力符合0. 25MPa。超滤方 式为2倍稀释，超滤到1倍体积，再次稀释2倍，超滤至1倍体积，共5次。当系统内乳清浓 缩至原体积1/4时应停止超滤，打开排空阀，将浓缩液排出。清洗系统和滤膜，先用0. 3mol/ L NaOH溶液循环清洗3遍至没有泡沫，换蒸馏水清洗至水通量达到初始值，最后0. 3mol/L NaOH溶液循环清洗2遍，最后一遍碱液留在系统内，卸下滤膜，4°C保存。
[0017] 进一步的，本发明还提供了由所述的制备方法制备得到的牛初乳生长因子粗提 物，其特征在于，所述牛初乳生长因子粗提物含有IGF-I 200?250ng/mL，EGF 30?40ng/ mL，TGF-β 21?5ng/mL，浓度分别较初乳升高139?174、89?120、67?342倍。
[0018] 本发明中，优选的，所述牛初乳生长因子粗提物分子量在6-90KU之间
[0019] 本发明通过研宄牛初乳生长因子粗提物对CaC0-2细胞的增殖和迀移作用发现： 本发明牛初乳生长因子粗提物以1 μ g/mL作用体外CaC0-2细胞时，细胞数量在12、24、36h 分别比正常组增加20. 6 %、30. 8 %、40 % ;本发明牛初乳生长因子粗提物以10 μ g/mL作用 体外CaC0-2细胞时，细胞迀移量在36、48h分别比正常组增加44%、217%;本发明牛初乳生 长因子粗提物能显著促进CaC0-2细胞总蛋白质含量的增加，且随着浓度的增加，细胞总蛋 白质含量呈现剂量依赖性，且IOngAiL牛初乳生长因子粗提物能显著增加细胞蛋白含量。 本发明通过研宄牛初乳生长因子粗提物对MTX引起动物肠炎的修复作用发现：本发明牛初 乳生长因子粗提物以32mg/kg/d作用于大鼠时，能降低由氨甲喋呤（MTX)引起的肠道黏膜 损伤。
[0020] 因此，更进一步的，本发明还提供了所述的牛初乳生长因子粗提物在制备防治肠 炎保健品中的应用。
[0021] 本发明中，优选的，所述牛初乳生长因子粗提物通过促进细胞增殖和迀移、增加细 胞蛋白质含量和修复肠粘膜而达到防治肠炎的目的。
[0022] 本发明中，优选的，所述牛初乳生长因子粗提物促进细胞增殖的最低有效浓度为 Ing/mL ;所述牛初乳生长因子粗提物促进细胞迀移的最低有效浓度为Ing/mL ;所述牛初乳 生长因子粗提物增加细胞蛋白质含量的最低有效浓度为lOng/mL ;所述牛初乳生长因子粗 提物修复肠粘膜的最低有效浓度为32mg/kg/d。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0024] 本发明的牛初乳生长因子粗提物含有多种生长因子，本发明检测了其中三种含量 高，且能够显著刺激上皮细胞增殖和分化的生长因子，还有其他含量较低，作用效果强的生 长因子。超滤分离过程都在室温附近的温度下进行，不易使活性蛋白变性，低能耗，无相变， 整个过程都是在液体中进行，增强了多肽稳定性，且整个过程都是在无机相中进行，无有机 相参与，使制备的牛初乳生长因子粗提物更加安全可靠。超滤过程的规模和处理能力适应 范围广，设备结构紧凑，易于其他分离单元集成，实现自动控制。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为不同浓度牛初乳生长因子粗提物对CaCO-2细胞迀移的影响图；
[0026] 图2为不同浓度生长因子粗提物对细胞迀移的影响图；
[0027] 图3为不同浓度生长因子粗提物对CaCO-2总蛋白质含量的影响图；
[0028] 图4为大鼠肠道组织学变化图（HE染色法，X 100);
[0029] 图5为牛初乳生长因子粗提物对空肠及其黏膜的影响图（*:P〈0. 05vs对照组； #:P〈0.05vs 模型组）；
[0030] 图6为牛初乳生长因子粗提物对回肠及其黏膜的影响（*:P〈0.05vS对照组； #:P〈0.05vs 模型组）；
[0031] 图7为牛初乳生长因子粗提物对大鼠血浆DAO活性的影响（*:P〈0. 05vs对照组； #:P〈0.05vs 模型组）；
[0032] 图8为牛初乳生长因子粗提物对大鼠血浆D-乳酸含量的影响（*:P〈0. 05vs对照 组；#:P〈0. 05vs 模型组）。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0034] 牛初乳：由黑龙江完达山松北牧场提供。
[0035] 主要试剂：10mol/L Na0H，10mol/L HC1，所有试剂均为分析纯。
[0036] 主要仪器：Delta320精密pH计：Mettler Toledo公司；DU-800紫外分光光度计： Beckman公司；GL-21M高速冷冻离心机；HIRAYAMA HVE-50形高压灭菌器；300Ku、IOOKu陶 瓷膜超滤仪：北京华创源泉环境技术有限公司；AE-30型倒置生物显微镜：麦克奥迪实业 集团有限公司；Model 680型酶标仪：美国Beckman公司。
[0037] 实施例1
[0038] 将8L牛初乳置于制备型离心机内4°C、7000r/min离心15min，除去脂肪获得脱脂 牛初乳6L。采用酸法沉淀脱脂牛初乳中的酪蛋白，具体操作方法为：采用lOmol/L HCl调节 脱脂牛初乳口!1至2.5，常温下保存1811后，再用1〇111〇1/1似0!1调节到？!14.6，之后4°〇下， lOOOOr/min离心30min，收集乳清。分别采用截留分子量为300Ku和IOOKu的陶瓷膜进行 第一次超滤和第二次超滤，除去乳清中残留的大分子蛋白质，获得超滤渗透液，超滤时操作 压力0. 15MPa，流量5L/h，温度25°C。将所得的超滤渗透液用截留分子量为3500u的透析袋 透析，脱盐，吸水剂为蒸馏水，4°C过夜。冷冻干燥，即得牛初乳生长因子粗提物。
[0039] 实施例2牛初乳生长因子粗提物含量的基本测定
[0040] 分别检测提取过程中各个步骤（包括初乳、脱脂乳、乳清、300Ku、IOOKu)含量较高 的IGF-I、TGF-β 2、EGF以及总蛋白的含量，检测结果见下表。
[0041] 表1牛初乳超滤过程中蛋白质含量
[0042]
【权利要求】
1. 一种牛初乳生长因子粗提物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将牛初乳通过离心机离心，除去脂肪获得脱脂牛初乳； (2) 酸法沉淀脱脂牛初乳中的酪蛋白，获得乳清液体； (3) 采用陶瓷膜超滤仪进行两次超滤，除去乳清中残留的大分子蛋白质，获得超滤渗透 液； (4) 利用透析袋透析，脱盐； (5) 冷冻干燥，即得牛初乳生长因子粗提物。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述牛初乳为健康母牛分娩 后2天内的乳汁；所述离心的条件为：4°C下，7000r/min离心15min。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述酸法沉淀脱脂牛初乳 中的酪蛋白的具体步骤：10m〇l/L HC1调节脱脂牛初乳pH至2. 5,常温下保存18h后，再用 10mol/L NaOH 调节到 pH 4.6,之后 4°C下，10000r/min 离心 30min，收集乳清。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)第一次超滤所用陶瓷膜 的截留分子量为300Ku，第二次超滤所用陶瓷膜的截留分子量为lOOKu，超滤时操作压力 0. 15MPa，流量 5L/h，温度 25°C。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4)所述透析袋的截留分子量为 3500u ;所述透析的条件为：在蒸馏水中4°C过夜平衡。
6. 按照权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的牛初乳生长因子粗提物，其 特征在于，所述牛初乳生长因子粗提物含有IGF-I 200?250ng/mL，EGF 30?40ng/mL， TGF-0 2 1?5ng/mL，浓度分别较初乳升高139?174、89?120、67?342倍。
7. 根据权利要求6所述的牛初乳生长因子粗提物，其特征在于，所述牛初乳生长因子 粗提物分子量在6_90Ku之间。
8. 权利要求6或7所述的牛初乳生长因子粗提物在制备防治肠炎保健品中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述牛初乳生长因子粗提物通过促进细 胞增殖和迀移、增加细胞蛋白质含量和修复肠粘膜而达到防治肠炎的目的。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述牛初乳生长因子粗提物促进细胞 增殖的最低有效浓度为Ing/mL ;所述牛初乳生长因子粗提物促进细胞迀移的最低有效浓 度为Ing/mL ;所述牛初乳生长因子粗提物增加细胞蛋白质含量的最低有效浓度为10ng/ mL ;所述牛初乳生长因子粗提物修复肠粘膜的最低有效浓度为32mg/kg/d。
【文档编号】A23L1/29GK104434974SQ201410752159
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】杨丽杰, 刘宾, 霍贵成, 曹凤波, 王晓明, 李媛媛, 周晶 申请人:东北农业大学