一种Sanger测序反应优化剂、应用该优化剂的测序反应体系及测序方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学【技术领域】，公开了一种Sanger测序反应优化剂、应用该优化剂的测序反应体系及测序方法。按体积比计，本发明所提供的Sanger测序反应优化剂包含下述组份：BigDye 1份，dGTP-BigDye 0.2～1份，dGTP 0.1～1份和dCTP 0.1～1份。在Sanger测序反应中加入该种优化剂，应用于对常见的特殊DNA结构，例如发夹结构、高GC含量序列或重复序列等的测序中，可有效避免在测序过程中出现测序信号提前中断、信号减弱较快导致测序有效序列短、序列不准确等问题，从而能提供针对于复杂结构DNA的可靠、精准的测序结果。
【专利说明】一种Sanger测序反应优化剂、应用该优化剂的测序反应体系及测序方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学【技术领域】，特别涉及一种Sanger测序反应优化剂、应用该优化剂的测序反应体系及测序方法。
【背景技术】
[0002]在分子生物学研宄中，DNA的序列分析是进一步研宄和改造目的基因的基础。Frederick Sanger 发明的 Sanger 双脱氧链终止法(Chain Terminat1n Method)是一种常用的DNA测序方法。Sanger测序法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机引入被4种不同颜色荧光分别标记的ddNTP以终止延伸反应，这样就形成了大量末端被荧光标记的、长短不一的延伸产物，接着再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端4种不同荧光颜色的区分，计算软件会自动“读出”DNA序列。
[0003]Sanger测序法已被广泛地应用于对菌(菌液、穿刺菌、平板菌)、质粒、PCR产物(原液、已纯化)等不同类型的样品所进行的测序技术中，以此提供质粒提取、PCR纯化、测序引物设计、DNA序列的基本数据分析，以及长片段walking测序后的序列拼接等生物信息学分析服务。
[0004]由于二级结构或者其它内在因素的影响，复杂结构对于DNA测序是巨大的挑战。常见的特殊DNA结构有发夹结构、高GC含量序列、重复序列等，此类结构在常规的sanger测序方法中往往出现测序信号提前中断、信号减弱较快导致测序有效序列短、序列不准确等问题。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的在于提供一种Sanger测序反应优化剂，该优化剂应用于Sanger测序反应中，可提高具有复杂结构DNA样品的测序结果的可靠性和精准性。
[0006]本发明的另一个目的在于提供应用该种Sanger测序反应优化剂的测序反应体系及测序方法。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种Sanger测序反应优化剂，按体积比计，该种优化剂包含下述组份:
[0008]BigDye 1 份，
[0009]dGTP-BigDye 0.2 ?1 份，
[0010]10 μΜ 的 dGTP 0.1 ?1 份，
[0011]和10 μΜ 的 dCTP 0.1 ?1 份。
[0012]该种优化剂的组成配比根据需测序片段的GC含量来定，GC含量越高，BDG、dGTP和dCTP的比例越高。在Sanger测序反应中加入该种优化剂，应用于对常见的特殊DNA结构，例如发夹结构、高GC含量序列或重复序列等的测序中，可有效避免在测序过程中出现测序信号提前中断、信号减弱较快导致测序有效序列短、序列不准确等问题，从而能提供正对于复杂结构DNA的可靠、精准的测序结果。本发明的实施方式中，分别将上述配比的优化剂用于对发夹DNA序列的Sanger测序以及对高GC含量序列的Sanger测序中，对测序过程的顺利进行和测序结果的准确得出均有显著效果。
[0013]本发明的实施方式还提供一种Sanger测序反应体系，每10 μ 1该种反应体系包含下述组份:5X sequencing buffer 2 μ 1，3.2 μΜ 测序引物 2 μ 1，100 ?200ng/ μ 1 的测序模板1 μ 1，Sanger测序反应优化剂1 μ 1，加水补足10 μ 1 ;其中，Sanger测序反应优化剂，按体积比计，包含下述组份:BigDye 1份，dGTP-BigDye (λ 2?1份，10 μΜ的dGTP 0.1?1份和10 μ Μ的dCTP 0.1?1份。
[0014]此外，本发明的实施方式还提供应用上述Sanger测序反应体系进行的测序方法，该方法包含下述步骤:
[0015](1)测序样品DNA的预变性，然后冰水淬火；(2)测序反应的PCR循环；(3)对测序反应的产物进行纯化；(4)对纯化后的产物进行变性，然后冰水淬火；(5)采用DNA测序仪进行测序。
[0016]优选地，本发明的实施方式中，上述测序方法的步骤(1)中进行预变性的反应条件是:在98°C下进行预变性8分钟。对于有发夹结构或者高GC含量的模板，一般双链结合比较紧密，测序过程需要产生单链，常规的95°C不能使双链解链完全而导致后续可用于测序反应的单链DNA含量低，因此本发明的实施方式所提供的测序方法中，通过提高变性温度至98 °C和增加变性时间至8分钟，来保证双链解链完全。
[0017]优选地，本发明的实施方式中，上述测序方法的步骤(2)中进行PCR循环的反应程序为:以98°C 10秒、50°C 1分钟、60°C 4分钟为一个循环，进行40个循环。
[0018]优选地，本发明的实施方式中，上述测序方法的步骤(3)中对测序反应的产物进行纯化的方法为乙醇/醋酸钠法，通过该纯化步骤，可去除反应体系中多余的原料、酶和离子等杂质。纯化步骤的具体操作如下:
[0019](1)每管加入Ιμ? 125mM EDTA到管底，每管加入1 μ 1 3Μ NaAc到管底；(2)每管加入25 μ 1 100%酒精，混匀，避光条件室温静置15min ； (3) 3700rmp离心30min，马上倒置96孔板，800rmp离心lmin ； (4)每管加入35 μ 1 70%酒精，震荡，3700rmp离心30min，马上倒置96孔板，800rmp离心lmin ； (5)室温挥发净酒精。
[0020]优选地，本发明的实施方式中，上述测序方法的步骤(4)中对纯化后的产物进行变性的方法为:在98°C下变性8分钟，使得双链DNA充分解链，在测序时，之后单链才是有效的。
[0021]优选地，本发明的实施方式中，上述测序方法的步骤(4)中对纯化后的产物进行变性前，加入?ο μ 1甲酰胺，并充分混匀，加入甲酰胺有助于DNA样品维持变性状态。
[0022]优选地，本发明的实施方式中，上述测序方法的步骤(5)中所采用的DNA测序仪为ΑΒΙ测序仪，例如3730XL。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是实施例1中采用本发明提供的测序方法对发夹DNA序列测得的测序结果；
[0024]图2是实施例2的比试验例中采用常规测序对发夹DNA序列测得的测序结果；
[0025]图3是实施例3中采用本发明提供的测序方法对高GC含量序列测得的测序结果；
[0026]图4是实施例4的对比试验例中采用常规测序对高GC含量序列测得的测序结果。
【具体实施方式】
[0027]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
[0028](在本申请文件中，对Bigdye也简称为BDT，对dGTP-BigDye也简称为BDG)
[0029]实施例1采用本发明的测序方法对发夹DNA序列(ShDNA序列，存在发夹结构)的测序案例
[0030]1、本实施例中对发夹DNA样品所进行测序的PCR反应体系组成如下:
[0031]5 X sequencing buffer:2 μ 1
[0032]模板(150ng/μ 1):1 μ 1
[0033]引物(3.2μ Μ):2 μ 1
[0034]Sanger测序反应优化剂1 μ 1 (其中按体积计:Bigdye 1份，dGTP-BigDye 0.2份，10 μ Μ 的 dGTP 0.2 份和 10 μ Μ 的 dCTP 0.2 份)
[0035]水:4μ1。
[0036]2、本实施例中对发夹DNA样品进行测序的PCR反应程序如下:
[0037]98°C预变性8分钟；冰水淬火；
[0038]以98 °C 10秒、50 °C 1分钟、60 °C 4分钟为一个循环，进行40个循环；
[0039]4°C 保存。
[0040]3、对PCR反应产物进行乙醇/醋酸钠法纯化的步骤:
[0041](1)每管加入1 μ 1 125mM EDTA到管底，每管加入1 μ 1 3M NaAc到管底；
[0042](2)每管加入25 μ 1 100%酒精，混匀，避光条件室温静置15min ；
[0043](3) 3700rmp 离心 30min，马上倒置 96 孔板，800rmp 离心 lmin ；
[0044](4)每管加入35μ1 70%酒精，震荡，3700rmp离心30min，马上倒置96孔板，800rmp 离心 lmin ；
[0045](5)室温挥发净酒精。
[0046]4、上机测序
[0047]对纯化产物每管加入10μ1甲酰胺，充分震荡后短离心，收集产物于管底，98°C下变性8分钟后直接冰水淬火；所得产物进行毛细管电泳(ABI 3730XL测序仪)。测序结果见附图1所示。
[0048]实施例2对比试验例:采用常规测序方法对发夹DNA序列(ShDNA序列，存在发夹结构)的测序对比
[0049]本实施例为实施例1的对比试验例，即采用常规方法对发夹DNA序列进行测序。
[0050]1、采用常规方法的PCR反应体系:
[0051]5 X sequencing buffer:2 μ 1
[0052]模板(150ng/μ 1):1 μ 1
[0053]引物(3.2μ Μ):2 μ 1
[0054]BDT: 1 μ 1
[0055]水:4μ 1
[0056]2、采用常规方法的PCR程序:
[0057]95 °C 5 分钟；淬火；
[0058]以95 °C 10秒、50 °C 1分钟、60 °C 4分钟为一个循环，进行40个循环。
[0059]4°C 保存。
[0060]3、对PCR反应产物进行纯化的步骤:
[0061](1)每管加入1 μ 1 125mM EDTA到管底，每管加入1 μ 1 3M NaAc到管底；
[0062](2)每管加入25 μ 1 100%酒精，混匀，避光条件室温静置15min ；
[0063](3) 3700rmp 离心 30min，马上倒置 96 孔板，800rmp 离心 lmin ；
[0064](4)每管加入35μ1 70%酒精，震荡，3700rmp离心30min，马上倒置96孔板，800rmp离心 lmin ；
[0065](5)室温挥发净酒精。
[0066]4、上机测序
[0067]对纯化产物每管加入10μ1甲酰胺，充分震荡后短离心，收集产物于管底，95°C下变性5分钟后直接冰水淬火；所得产物进行毛细管电泳(ABI 3730XL测序仪)。测序结果如附图2所示。
[0068]实施例1和实施例2的结果对比:
[0069]对比结果说明:从附图1和附图2的对比可以看到:该待测NDA序列存在发夹结构，采用实施例2中的常规测序方法，由于发夹结构区没有完全解链而导致测序信号中断，无法继续测序；而采用实施例1中的本发明所提供的测序方法后，对发夹区域顺利解链，顺利测出相关序列。
[0070]实施例3采用本发明的测序方法对高GC含量序列的测序案例
[0071]1、本实施例中对高GC含量样品进行测序的PCR反应体系组成为:
[0072]5 X sequencing buffer:2 μ 1
[0073]模板(150ng/μ 1):1 μ 1
[0074]引物(3.2μ Μ):2 μ 1
[0075]Sanger测序反应优化剂1 μ 1 (其中按体积计:Bigdye 1份，dGTP-BigDye 0.5份，10 μ Μ 的 dGTP 0.5 份和 10 μ Μ 的 dCTP 0.5 份)
[0076]水:4μ1。
[0077]2、本实施例中对高GC含量样品进行测序的PCR反应程序为:
[0078]98 °C预变性8分钟；冰水淬火；
[0079]以98 °C 10秒、50 °C 1分钟、60 °C 4分钟为一个循环，进行40个循环；
[0080]4°C 保存。
[0081]3、对PCR反应产物进行纯化的步骤:
[0082](1)每管加入1 μ 1 125mM EDTA到管底，每管加入1 μ 1 3M NaAc到管底；
[0083](2)每管加入25 μ 1 100%酒精，混匀，避光条件室温静置15min ；
[0084](3) 3700rmp 离心 30min，马上倒置 96 孔板，800rmp 离心 lmin ；
[0085](4)每管加入35μ1 70%酒精，震荡，3700rmp离心30min，马上倒置96孔板，800rmp 离心 lmin ；
[0086](5)室温挥发净酒精。
[0087]4、上机测序
[0088]对纯化产物每管加入10μ1甲酰胺，充分震荡后短离心，收集产物于管底，98°C下变性8分钟后直接冰水淬火；所得产物进行毛细管电泳(ABI 3730XL测序仪)。测序结果如附图3所示。
[0089]实施例4、对比试验例:采用常规测序方法对高GC含量序列的测序对比
[0090]本实施例为实施例3的对比试验例，即采用常规方法对高GC含量序列进行测序。
[0091]1、采用常规方法的PCR反应体系:
[0092]5 X sequencing buffer:2 μ 1
[0093]模板(150ng/μ 1):1 μ 1
[0094]引物(3.2 μΜ):2 μ 1
[0095]BDT: 1 μ 1
[0096]水:4μ 1
[0097]2、采用常规方法的PCR程序:
[0098]95 °C 5 分钟；淬火；
[0099]以95 °C 10秒、50 °C 1分钟、60 °C 4分钟为一个循环，进行40个循环。
[0100]4°C 保存。
[0101]3、对PCR反应产物进行纯化的步骤:
[0102](1)每管加入1 μ 1 125mM EDTA到管底，每管加入1 μ 1 3M NaAc到管底；
[0103](2)每管加入25 μ 1 100%酒精，混匀，避光条件室温静置15min ；
[0104](3) 3700rmp 离心 30min，马上倒置 96 孔板，800rmp 离心 lmin ；
[0105](4)每管加入35μ1 70%酒精，震荡，3700rmp离心30min，马上倒置96孔板，800rmp 离心 lmin ；
[0106](5)室温挥发净酒精。
[0107]4、上机测序
[0108]对纯化产物每管加入10μ1甲酰胺，充分震荡后短离心，收集产物于管底，95°C下变性5分钟后直接冰水淬火；所得产物进行毛细管电泳(ABI 3730XL测序仪)。测序结果如附图4所示。
[0109]实施例3和实施例4的结果对比:
[0110]对比结果说明:从附图2和附图4的对比可以看出:该待测序列局部GC含量达到81.2%，在测序过程中，采用实施例4中常规方法的dNTP和ddNTP都是是等量的，由于ddGTP，ddCTP，dGTP和dCTP等在局部消耗过量，体系不平衡而导致信号提前减弱，因此需要额外补充。采用实施例3中的本发明所提供的测序方法后，效果明显改善。
[0111]本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
【权利要求】
1.一种Sanger测序反应优化剂，其特征在于，按体积比计，所述优化剂包含下述组份:
BigDye I 份，
dGTP-BigDye 0.2 ?I 份，
10 μΜ 的 dGTP 0.1 ?I 份，
和 10 μΜ 的 dCTP 0.1 ?I 份。
2.—种Sanger测序反应体系，其特征在于，每10 μ I所述反应体系包含下述组份:5 X sequencing buffer 2 μ 1，3.2 μ M 的测序引物 2 μ 1，100 ?200ng/ μ I 的测序模板 I μ 1，Sanger测序反应优化剂I μ 1，加水补足10 μ I ; 其中，所述的Sanger测序反应优化剂，按体积比计包含下述组份:Bigdyel份，dGTP-BigDye 0.2 ?I 份，10 μ M 的 dGTP 0.1 ?I 份和 10 μ M 的 dCTP 0.1 ?I 份。
3.—种应用权利要求2所述的Sanger测序反应体系进行的测序方法，其特征在于，包含下述步骤: (1)测序样品DNA的预变性，然后冰水淬火； (2)测序反应的PCR循环； (3)对测序反应的产物进行纯化； (4)对纯化后的产物进行变性，然后冰水淬火； (5)采用DNA测序仪进行测序。
4.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，所述步骤(I)中进行预变性的反应条件是:在98°C下进行预变性8分钟。
5.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中进行的PCR循环为:以98°C 10秒、50°C I分钟、60°C 4分钟为一个循环，进行40个循环。
6.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，步骤(3)中对测序反应的产物进行纯化的方法为乙醇/醋酸钠法。
7.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，步骤(4)中对纯化后的产物进行变性的方法为:在98°C下变性8分钟。
8.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，步骤(4)中对纯化后的产物进行变性前，加入10 μ I甲酰胺，并充分混匀。
9.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，步骤(5)中所采用的DNA测序仪为ABI 3730XL 测序仪。
【文档编号】C12Q1/68GK104498605SQ201410778652
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】孙子奎, 丁方美, 王 锋, 高文学, 方钰 申请人:上海派森诺生物科技有限公司