一种牛樟芝深层发酵复方制品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛樟芝深层发酵复方制品及其制备方法，以茯苓粉、山药粉、葛根粉、蜂花粉、大豆粉、酵母粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁等配制深层发酵培养基，经深层发酵培养富含牛樟芝多糖的牛樟芝菌丝体发酵液，与采用超临界CO2技术提取、酶解、分离、过滤、浓缩制得的佛手、黄精、枸杞、砂仁、余甘子、枳椇子等中草药提取液配制而成。本发明优化了牛樟芝多糖等活性成分的含量，具有产量高、时间短、成本低，可以工业化生产，是一种高效环保的生物工程生产技术，具有显著的开发应用前景。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药复方制品及生物医药领域，具体涉及一种牛樟芝深层发酵复方制 品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 牛樟芝简称"樟芝"，学名为AntrodiaCamphorata,俗名牛樟燕、红樟芝、樟内 燕、樟燕、血灵芝等。野生牛樟芝唯一赖以为生的宿主----台湾牛樟树（Cinnamomum kanehirai)，牛樟树为台湾独有之原生珍贵树种，生长在海拔450米至2000米之间，牛樟芝 生长于老龄牛樟树干腐朽的中空内部或倒伏树干的潮湿表面，生长期在每年六至十月，子 实体形态多变化，有板状、锺状、马蹄状或塔状；初生时鲜红色，渐长变为白色、淡红褐色、淡 褐色或淡黄褐色。牛樟芝气芳香味辛苦、平。有祛风行气、化淤活血、温中消结、解毒消肿、镇 静止痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、提升机体免疫力之效；对于治疗胃肠疼痛、腹泻呕吐、食物中 毒、毒蕈中毒、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、肝癌等更是有独特功能。牛樟芝是有许多的 生理活性成分，如多糖体、三萜类化合物、超氧歧化酶、腺苷、蛋白质(含免疫蛋白）、维生素、 微量元素、核酸、凝集素、氨基酸、纤维素、血压稳定物质等。牛樟芝的有效成分中以多糖和 三萜类化合物为最特别，是其他菇菌无法相比的。樟芝在子实体阶段多醣体含量，约2%，具 有免疫生理活性、预防及控制肿瘤等生理活性，主要含P-D-glucan(P-D-葡聚糖)）其作 用是透过激发巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及自然杀手细胞等来增强免疫功能，进 而达到抗肿瘤的效果。牛樟芝多糖体中有强心、降血压、降血糖、抗血栓等功效。由于牛樟 芝在台湾被视为独特而珍贵的药用真菌，因此具有极高的研究和商业价值，也是目前台湾 最昂贵的野生真菌，在港澳被称为"神芝"，台湾民间称之为"森林中的红宝石"。
[0003] 茯苓 菌核含0 -茯苓聚糖约占干重93%和三萜类化合物乙酰茯苓酸、茯苓酸、3P-羟基羊 毛甾三烯酸。含大量淀粉，同时含有树胶、甲壳质、蛋白质、脂肪、留醇、卵磷脂、葡萄糖、腺嘌 呤、组氨酸、胆碱、P-茯苓聚糖分解酶、脂肪酶、蛋白酶等。
[0004] 茯苓医药用途极广。茯苓性平、味甘淡、益脾、安神、利水渗湿，能治疗脾虚泄泻、心 悸失眠、小便不畅、水肿等症。
[0005] 山药 山药富含淀粉、蛋白质、维生素A、B2、C，含有钙、磷、铁、碘等微量元素和无机盐，以 及粘液质、氨基酸、纤维素等。具有健脾胃、补肾肺、滋补强壮的功效。
[0006] 葛根 葛根含异黄酮成分葛根素、葛根素木糖甙、大豆黄酮、大豆黄酮甙及3 _谷留醇、花生 酸，又含多量淀粉、碳水化合物、植物蛋白、多种维生素和矿物质，此外还含有黄酮类物质： 大豆素，大豆甙，还有大豆素-4, 7-二葡萄糖甙，葛根素，葛根素-7-木糖甙，葛根醇，葛根藤 及异黄酮甙等。葛根是药食同源中草药，主治伤寒温热、头痛项强(颈僵)、烦热消渴、泄泻、 痢疾、麻疹不透、高血压、心绞痛、耳聋等证。
[0007] 蜂花粉 蜂花粉主要含有：蛋白质20% - 25%，氨基酸总量20%以上，游离氨基酸I% - 2%， 碳水化合物40% - 50%，脂肪5%-10% ;还有丰富的天然维生素、微量元素、酶类、激素、 生物活性物质等多种营养物质。还含有多种矿物质，其中：钾20?40%、镁1?20%、钙1? 15%、铁1?12%、硅2?10%、磷1?20%，以及大量的的活性蛋白酶、核酸、黄酮类化合物及 其它活性物质等。蜂花粉中的元素可预防和治疗高血压、糖尿病、冠心病和肾脏疾病等。具 有抗动脉硬化、降低胆固醇、解疼、防辐射、抗肿瘤等作用。
[0008] 黄精 黄精中含有黄精多糖甲乙丙3种，由葡萄糖，甘露糖，和半乳糖醛酸组成，其分子量均 大于20万；黄精中总多糖含量为11. 74%，含有多种留体皂苷和赖氨酸，苏氨酸，异亮氨酸， 丝氨酸，亮氨酸，谷氨酸，酪氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天门冬氨酸，高丝氨酸，二氨基丁 酸等多种氨基酸和人体的必须元素。药理作用具有延缓衰老，降血压，降血糖，降血脂，防止 动脉粥样硬化，延缓衰老和抗菌等作用，黄精多糖具有免疫激活作用. 佛手 佛手鲜果约含蛋白质1.2%、脂肪1.3%、总糖8. 7%、粗纤维I. 1 %、灰分0.7%、水分 86. 9%，果皮内部含有香豆精类化合物，柠檬内酯、黄酮类化合物还有多种维生素和矿物 质。其中维生素C含量为0. 04%，矿物元素主要有钙、镁、铁、锌、锰、铜、磷、钾、钠、硫等。在 碳水化合物中有多种不同分子量的多糖，具有生理活性作用。
[0009] 枸杞子 枸杞子含有甜菜碱，阿托品，天仙子胺，胡萝卜素，硫胺素，核黄素，烟酸，维生素C。同 时含氨基酸：天冬氨酸，脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，甘氨酸，谷氨酸，半胱氨 酸，赖氨酸，精氨酸，异亮氨酸，苏氨酸，组氨酸，酷氨酸，色氨酸，蛋氨酸。又含牛磺酸，Y-氨 基丁酸，还含钾、钙、钠、锌、铁、铜、铬、锶、铅、镍、镉、钴、镁等天然活性元素。枸杞多糖含量 为7. 09%，具有促进免疫作用。
[0010] 余甘子 余甘子含碳水化合物6. 63%?14. 10%，脂肪0. 19%?1. 09%，灰分0. 62%?0. 70%，蛋白 质0. 69%?2. 18%，维生素B1、维生素B2、维生素C和胡萝卜素等多种维生素，其中尤以Vc 含量高而著称，为IOOg果肉中含470?680mg，最高达1814mg/100g，平均含量是柑橘的 100倍，苹果的160倍，猕猴桃的3?5倍，含有多种氨基酸和丰富的钙、铁、钾、磷、硒、锗等 人体必须的常量和微量元素，其中铁、锌是人体生长和发育的重要元素，硒、镁、锰具有抗氧 化、防衰老、防癌症和抗心血管疾病的功能。具有生津止渴、润肺化痰、消滞化积、降低胆固 醇等作用。
[0011] 枳犋 枳犋每百克含水分59. 1克，糖28. 55克，脂肪0.07克，蛋白质0.03克，维生素C16. 3 毫克。枳犋性味甘酸平，具有清热，止烦渴，补中益气、润五脏、舒筋络的功效。治醉酒、烦热、 口渴、呕吐、二便不利。《本草拾遗》载"止渴除烦，润五赃，利大小便。
[0012] 根据上述原料有效成分的特点，采用深层发酵技术已有相关的报道。然而很多研 究只是采用常规的方式进行，其制品有效活性成分不高，提取得率不高，牛樟芝的多醣体重 量低，加上采用单一原料，综合效价协同不广谱，有效成分未能成分被人体吸收。因此，采 用天然植物山药粉、葛根粉、蜂花粉、茯苓粉等中草药作为培养基，营养全面，能不断补充氮 源、碳源，能有效满足牛樟芝菌丝体生长对营养的需求，提高获得大量菌体与代谢产物，大 幅提高多糖体等有效活性成分的含量。由于中草药佛手、黄精、枸杞、砂仁、余甘子、枳犋子 及蜂王浆具有多种天然活性物质，采用超临界CO2萃取、酶解工艺，萃取的提取液与牛樟芝 发酵液复合配制的复方制品，尚未见有相关报道。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于提供一种牛樟芝深层发酵复方制品及其制备方法，优化了牛樟 芝多糖等活性成分的含量，具有产量高、时间短、成本低，可以工业化生产，是一种高效环保 的生物工程生产技术，具有显著的开发应用前景。
[0014] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种牛樟芝深层发酵复方制品，主要由牛樟芝菌丝体发酵液和中草药提取液配制而 成，所述的中草药为佛手、黄精、茯苓、枳犋子、余甘子、枸杞和砂仁。
[0015] 牛樟芝菌丝体发酵液和中草药提取液的重量比为1:1，牛樟芝菌丝体发酵液的浓 度Brix=18. 0-20. 0%，中草药提取液的浓度Brix=18. 0-20. 0%。（Brix为白利比重计测定的 液体密度） 制备方法包括以下步骤： (1)牛樟芝菌丝体发酵液的制备 培养基： 斜面培养基：马铃薯煮汁IOOOmU葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨20g、硫酸镁0. 2wt. %，pH自然； 深层发酵培养基：茯苓粉1.5wt. %、山药粉1.5wt. %、葛根粉1.5wt. %、大豆粉2.0wt. %、蜂花粉2.0wt. %、葡萄糖3.0wt. %、酵母粉0.3wt. %、硫酸镁0.2wt. %、磷酸氢二钾 0. 3wt. %、氯化钠 0. 2wt. %、余量为水，pH:5-7,粉末：80-100 目； 制备工艺： 1) 将接种的斜面于26-28°C下培养5-7d; 2) 将长满菌丝体的斜面接种于深层发酵培养基，摇床180r/min转速下，26-28°C振荡 培养2-3d; 3) 种子罐种子培养：按种量10-15%、温度26-28°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速度 150-180r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0. 5v/v，罐压0. 04-0. 05MPa，培养40-48h，pH降 至 3. 5-4. 0 ; 4) 发酵培养：接种量15-20%，温度26-28°C，搅拌速度150-200r/min，无菌空气通气量 为每分钟1: 〇. 5v/v，罐压0. 04-0. 05MPa，培养40-48h，pH降至3. 5-4. 0,残糖量降至0. 3% ; 5) 酶解：加入复合蛋白酶0. 5wt. %、纤维素酶0. 5wt. %和淀粉酶0. 5wt. %，50-55°C酶 解浸提2-3h;其中蛋白酶的酶活力2X105U/kg、淀粉酶的酶活力I.OXIO5U/kg、纤维素酶 的酶活力1.5X105U/kg; 6) 均质处理：经酶解处理的牛樟芝发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速SOO-IOOOr/ min，再经高压均质机均质，压力40-60MPa，最后过200目膜过滤，得到牛樟芝菌丝体发酵 液； (2)中草药提取液的制备 1) 前处理：按重量百分数计：佛手10%、黄精10%、茯苓15%、枳犋子15%、余甘子20%、枸 杞20%、砂仁10%，分别进行粉碎，细度为3-5mm，混合，按料液比为1:10加水，浸泡3-5小时； 2) 超临界CO2萃取；萃取条件为：萃取釜压力24-30MPa，萃取温度60-80°C，I级分离 釜压力8-10MPa，II级分离釜压力6-8MPa，CCV流量120-150L/h; 3) 离心分离得萃取液：转速2000-3000r/min，时间6-10min; 4) 萃余物酶解提取：将萃余物按料液比为1:10加纯净水，调节pH=4. 5-6. 0,60-80°C 浸煮6-12h，然后降温至50-55°C，加入纤维素酶，酶解l_2h，再加入淀粉酶，酶解l-2h;升温 至100-1KTC，灭酶3-5min，过滤得酶解提取液；酶解过程在超声辅助条件下进行，超声波 频率为25-30kHz;所述纤维素酶的酶活力为2. 5万u/g,酶用量为萃余物重量的1. 0-1. 2% ; 所述淀粉酶的酶活力为1万u/g，酶用量为萃余物重量的1. 0-1. 2% ; (3 )将牛樟芝菌丝体发酵液、中草药萃取液和中草药萃余物酶解提取液混合均匀，经浓 缩，加入蜂王浆，制成复方口服液制品或复方固体制品。
[0016] 复方口服液制品的制备：将牛樟芝菌丝体发酵液、中草药萃取液和中草药萃余 物酶解提取液混合均匀，压力〇.〇9MPa下，减压浓缩至可溶性固形物含量为10-12%，浓度Brix=18. 0-20. 0%，冷却至室温，加入5wt. %蜂王浆，搅拌均匀，均质处理，添加食品调味剂， 调配pH=5. 0-6. 0,用棕色瓶罐装。
[0017] 复方固体制品的制备：将牛樟芝菌丝体发酵液、中草药萃取液和中草药萃余物 酶解提取液混合均匀，压力〇.〇9MPa下，减压浓缩至可溶性固形物含量为12-15%，浓度 Brix=20. 0-23. 0%，冷冻干燥制粉，加入5wt. %蜂王浆干粉、10wt. %葡萄糖和15wt. %麦芽 糊精，经混合、制粒、整粒，制成颗粒剂、片剂或胶囊剂。
[0018] 本发明的显著优点在于：本发明优化了牛樟芝多糖等活性成分的含量，具有产量 高、时间短、成本低，可以工业化生产，是一种高效环保的生物工程生产技术，具有显著的开 发应用前景。
【具体实施方式】
[0019] 一种牛樟芝深层发酵复方制品，主要由牛樟芝菌丝体发酵液和中草药提取液配制 而成，所述的中草药为佛手、黄精、茯苓、枳犋子、余甘子、枸杞和砂仁。
[0020] 牛樟芝菌丝体发酵液和中草药提取液的重量比为1:1，牛樟芝菌丝体发酵液的浓 度Brix=18. 0-20. 0%，中草药提取液的浓度Brix=18. 0-20. 0%。
[0021] 制备方法包括以下步骤： (1)牛樟芝菌丝体发酵液的制备 菌种：由台湾中华海峡两岸中医药合作发展文化协会提供的牛樟芝菌种。
[0022] 培养基： 斜面培养基：马铃薯煮汁IOOOmU葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨20g、硫酸镁0. 2wt. %，pH自然； 深层发酵培养基：茯苓粉1.5wt. %、山药粉1.5wt. %、葛根粉1.5wt. %、大豆粉2.0wt. %、蜂花粉2.0wt. %、葡萄糖3.0wt. %、酵母粉0.3wt. %、硫酸镁0.2wt. %、磷酸氢二钾 0. 3wt. %、氯化钠 0. 2wt. %、余量为水，pH:5-7,粉末：80-100 目； 制备工艺： 1) 将接种的斜面于26-28°C下培养5-7d; 2) 将长满菌丝体的斜面接种于深层发酵培养基，摇床180r/min转速下，26-28°C振荡 培养2-3d; 3) 种子罐种子培养：按种量10-15%、温度26-28°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速度 150-180r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0. 5v/v，罐压0. 04-0. 05MPa，培养40-48h，pH降 至 3. 5-4. 0 ; 4) 发酵培养：接种量15-20%，温度26-28°C，搅拌速度150-200r/min，无菌空气通气量 为每分钟1: 〇. 5v/v，罐压0. 04-0. 05MPa，培养40-48h，pH降至3. 5-4. 0,残糖量降至0. 3% ; 5) 酶解：加入复合蛋白酶0. 5wt. %、纤维素酶0. 5wt. %和淀粉酶0. 5wt. %，50-55°C酶 解浸提2-3h;其中蛋白酶的酶活力2X105U/kg、淀粉酶的酶活力l?0X105U/kg、纤维素酶 的酶活力1.5XIO5U/kg; 6) 均质处理：经酶解处理的牛樟芝发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速SOO-IOOOr/ min，再经高压均质机均质，压力40-60MPa，最后过200目膜过滤，得到牛樟芝菌丝体发酵 液； 天然牛樟芝与牛樟芝发酵液主要成分检测对照表
【权利要求】
1. 一种牛樟芝深层发酵复方制品，其特征在于：主要由牛樟芝菌丝体发酵液和中草药 提取液配制而成，所述的中草药为佛手、黄精、茯苓、枳犋子、余甘子、枸杞和砂仁。
2. 根据权利要求1所述的牛樟芝深层发酵复方制品，其特征在于：牛樟芝菌丝体发酵 液和中草药提取液的重量比为1: 1，牛樟芝菌丝体发酵液的浓度Brix=18. 0-20. 0%，中草药 提取液的浓度Brix=18. 0-20. 0%。
3. -种制备如权利要求1所述的牛樟芝深层发酵复方制品的方法，其特征在于：包括 以下步骤： (1) 牛樟芝菌丝体发酵液的制备 培养基： 斜面培养基：马铃薯煮汁l〇〇〇mL、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨20g、硫酸镁0. 2wt. %， pH自然； 深层发酵培养基：茯苓粉1.5 wt. %、山药粉1.5 wt. %、葛根粉1.5 wt. %、大豆粉2.0 wt. %、蜂花粉2.0 wt. %、葡萄糖3.0 wt. %、酵母粉0.3 wt. %、硫酸镁0.2 wt. %、磷酸氢二钾 0. 3 wt. %、氯化钠 0. 2 wt. %、余量为水，pH :5-7,粉末：80-100 目； 制备工艺： 1) 将接种的斜面于26-28°C下培养5-7d ; 2) 将长满菌丝体的斜面接种于深层发酵培养基，摇床180r/min转速下，26-28°C振荡 培养2-3d ; 3) 种子罐种子培养：按种量10-15%、温度26-28°C，光照条件：连续黑暗条件，搅拌速度 150-180r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0. 5v/v，罐压0. 04-0. 05MPa，培养40-48h，pH降 至 3. 5-4. 0 ; 4) 发酵培养：接种量15-20%，温度26-28°C，搅拌速度150-200r/min，无菌空气通气量 为每分钟1: 〇. 5v/v，罐压0. 04-0. 05MPa，培养40-48h，pH降至3. 5-4. 0,残糖量降至0. 3% ; 5) 酶解：加入复合蛋白酶0. 5wt. %、纤维素酶0. 5wt. %和淀粉酶0. 5 wt. %，50-55°C酶 解浸提2-3h;其中蛋白酶的酶活力2X105U/kg、淀粉酶的酶活力1.0X105 U /kg、纤维素酶 的酶活力1.5X105 U /kg; 6) 均质处理：经酶解处理的牛樟芝发酵液先经胶体磨均质，旋转磨转速800-1000r/ min，再经高压均质机均质，压力40-60MPa，最后过200目膜过滤，得到牛樟芝菌丝体发酵 液； (2) 中草药提取液的制备 1) 前处理：按重量百分数计：佛手10%、黄精10%、茯苓15%、枳犋子15%、余甘子20%、枸 杞20%、砂仁10%，分别进行粉碎，细度为3-5mm，混合，按料液比为1:10加水，浸泡3-5小时； 2) 超临界C02萃取；萃取条件为：萃取釜压力24-30MPa，萃取温度60-80°C，I级分离 釜压力8-10MPa，II级分离釜压力6-8MPa，CCV流量120-150L/h ; 3) 离心分离得萃取液：转速2000-3000r/min，时间6-10min ; 4) 萃余物酶解提取：将萃余物按料液比为1:10加纯净水，调节pH=4. 5-6. 0,60-80°C 浸煮6-12h，然后降温至50-55°C，加入纤维素酶，酶解l_2h，再加入淀粉酶，酶解l-2h ;升温 至100-1KTC，灭酶3-5min，过滤得酶解提取液；酶解过程在超声辅助条件下进行，超声波 频率为25-30kHz ;所述纤维素酶的酶活力为2. 5万u/g,酶用量为萃余物重量的1. 0-1. 2% ; 所述淀粉酶的酶活力为1万u/g，酶用量为萃余物重量的1. o-l. 2% ; (3 )将牛樟芝菌丝体发酵液、中草药萃取液和中草药萃余物酶解提取液混合均匀，经浓 缩，加入蜂王浆，制成复方口服液制品或复方固体制品。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：复方口服液制品的制备：将牛樟芝菌丝体 发酵液、中草药萃取液和中草药萃余物酶解提取液混合均匀，压力〇. 〇9MPa下，减压浓缩至 可溶性固形物含量为10-12%，浓度Brix=18. 0-20. 0%，冷却至室温，加入5wt. %蜂王浆，搅拌 均匀，均质处理，添加食品调味剂，调配pH=5. 0-6. 0,用棕色瓶罐装。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：复方固体制品的制备：将牛樟芝菌丝体 发酵液、中草药萃取液和中草药萃余物酶解提取液混合均匀，压力〇. 〇9MPa下，减压浓缩至 可溶性固形物含量为12-15%，浓度Brix=20. 0-23. 0%，冷冻干燥制粉，加入5 wt. %蜂王浆干 粉、10 wt. %葡萄糖和15 wt. %麦芽糊精，经混合、制粒、整粒，制成颗粒剂、片剂或胶囊剂。
【文档编号】A23L1/28GK104473145SQ201410791469
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】郭震宇, 郭耀荣, 吴松刚, 黄建忠, 林金科 申请人:福建华尔康生物科技有限公司