一种检测叶绿体dna鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，以辣椒叶片为材料，提取叶片中的总DNA，用叶绿体引物C1和C2进行PCR扩增，对扩增产物进行克隆测序，再与辣椒细胞质雄性不育的叶绿体DNA分子指纹进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。本发明的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，在鉴定辣椒细胞质不育系时只需对叶绿体引物C1和C2的PCR扩增产物进行克隆测序，然后进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。
【专利说明】一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，属于细胞质雄性不育检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]细胞质雄性不育是植物界中常见现象，利用雄性不育进行杂交育种是有很大的优势，如不需要人工去雄、提高杂交种子的纯度和增加产量；细胞质雄性不育机理很复杂，至今没有发现两个细胞质雄性不育突变是完全相同的。细胞质雄性不育系的分子标记在很多植物中已经建立，利用该标记能很快的区分不育和可育材料；对辣椒雄性不育系遗传物质的研宄主要集中在细胞核方面，很少细胞质方面的报道，能用于鉴定辣椒细胞质雄性不育系的叶绿体DNA分子标记更少，这对辣椒细胞质雄性不育系的选育和鉴别增加了难度，限制了辣椒杂交育种的发展。
【发明内容】
[0003](一 )要解决的技术问题
[0004]为解决上述问题，本发明提出了一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，通过检测叶绿体DNA确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定；其检测过程比较简单，检测结果准确。
[0005]( 二)技术方案
[0006]本发明的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法所述方法包括以下步骤:
[0007]第一步，制备完整叶绿体，采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法制备辣椒叶片中完整叶绿体；
[0008]第二步，提取上述完整叶绿体中的DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片叶绿体中的总DNA ；
[0009]第三步，PCR扩增，用叶绿体引物Cl和C2对上述总DNA进行PCR扩增；
[0010]第四步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序；
[0011]第五步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
[0012]进一步地，所述叶绿体引物Cl:
[0013]正向序列5 ?GTTATCCATTAACGTAATGCTC ?3，
[0014]反向序列5 ?CGCGCAAGGCGATTCACAATCC ?3 ；
[0015]所述叶绿体引物C2:
[0016]正向序列5 ?AGTCTTAGACAATCCGATAA ?3，
[0017]反向序列5 ?GTTGCAGAGCCATACCAC ?3。
[0018]再进一步地，所述辣椒细胞质雄性不育系的特征位点的DNA分子指纹如下:
[0019]Cl片段:辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点15和29?32分别为T和ATTC，而可育辣椒在上述对应位点分别为C和TGGA。
[0020]C2片段:辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点326?332、344?346、454?455,468 ?470、588、676 ?685、712 ?713 和 821 ?822 为 TGAGTAT、CTA、TG、CCT、T、TGATGCAGTG、CG和CG，而可育辣椒在上述对应位点分别为GTGTACG、TGT、GA、GAC、G、CCTGCAGACT,AC 和 GT。
[0021](三)有益效果
[0022]与现有技术相比，本发明的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，在鉴定辣椒细胞质不育系时只需对叶绿体引物Cl和C2的PCR扩增产物进行克隆测序，然后进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明的实施例1的3个细胞质雄性不育系供试材料表。
[0024]图2是本发明的实施例1的叶绿体引物表。
[0025]图3是本发明的实施例1的叶绿体信息位点表。
【具体实施方式】
[0026]实施例1:
[0027]如图1至图3所示，本发明以3份常规辣椒品种为对照，对3个细胞质雄性不育系和相应的保持系进行叶绿体Cl和C2片段的扩增序列，并运用相关软件分析，建立辣椒细胞质雄性不育系的叶绿体DNA分子指纹。
[0028]其具体操作如下:
[0029]第一步，制备完整叶绿体，采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法制备辣椒叶片中完整叶绿体；
[0030]第二步，提取上述完整叶绿体中的DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片叶绿体中的总DNA ；
[0031]第三步，PCR扩增，用叶绿体引物Cl和C2对上述总DNA进行PCR扩增；
[0032]第四步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序；
[0033]第五步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
[0034]其中，所述叶绿体引物Cl:正向序列5?GTTATCCATTAACGTAATGCTC?3，
[0035]反向序列5?CGCGCAAGGCGATTCACAATCC?3 ;所述叶绿体引物C2:正向序列5?AGTCTTAGACAATCCGATAA ?3，反向序列 5 ?GTTGCAGAGCCATACCAC ?3。
[0036]所述辣椒细胞质雄性不育系的特征位点的DNA分子指纹如下:
[0037]Cl片段:辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点15和29?32分别为T和ATTC，而可育辣椒在上述对应位点分别为C和TGGA ；C2片段:辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点 326 ?332、344 ?346、454 ?455、468 ?470、588、676 ?685、712 ?713 和 821 ?822为TGAGTAT、CTA、TG、CCT、T、TGATGCAGTG, CG和CG，而可育辣椒在上述对应位点分别为GTGTACG、TGT、GA、GAC、G、CCTGCAGACT、AC 和 GT。
[0038]检测结果为，9704A、PBC362A和Co4761A为细胞质雄性不育系。
[0039]上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
【权利要求】
1.一种检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: 第一步，制备完整叶绿体，采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法制备辣椒叶片中完整叶绿体； 第二步，提取上述完整叶绿体中的DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片叶绿体中的总DNA ； 第三步，PCR扩增，用叶绿体引物Cl和C2对上述总DNA进行PCR扩增； 第四步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序； 第五步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
2.根据权利要求1所述的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于， 所述叶绿体引物Cl:正向序列5?GTTATCCATTAACGTAATGCTC?3，反向序列5?CGCGCAAGGCGATTCACAATCC ?3 ； 所述叶绿体引物C2:正向序列5?AGTCTTAGACAATCCGATAA?3，反向序列5?GTTGCAGAGCCATACCAC ?3。
3.根据权利要求1或2所述的检测叶绿体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，所述辣椒细胞质雄性不育系的特征位点的DNA分子指纹如下: Cl片段:辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点15和29?32分别为T和ATTC，而可育辣椒在上述对应位点分别为C和TGGA ； C2片段:辣椒细胞质雄性不育叶绿体DNA在位点326?332、344?346、454?455、468 ?470、588、676 ?685、712 ?713 和 821 ?822 为 TGAGTAT、CTA、TG、CCT、T、TGATGCAGTG、CG和CG，而可育辣椒在上述对应位点分别为GTGTACG、TGT、GA、GAC、G、CCTGCAGACT、AC和GT0
【文档编号】C12Q1/68GK104513856SQ201410816981
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】肖辉海, 郝小花 申请人:湖南文理学院, 肖辉海