猪肉质性状相关wnt10b基因分子标记的克隆及应用的制作方法

文档序号:499651阅读:243来源:国知局
猪肉质性状相关wnt10b基因分子标记的克隆及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜分子分子生物学【技术领域】,具体涉及猪肉质性状相关WNT10B基因分子标记的克隆及应用。本发明所述的分子标记由猪WNT10B基因克隆得到,其WNT10B分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示。WNT10B基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的WNT10B基因序列设计引物,以猪的基因组DNA为模板扩增,扩增片段利用测序筛选SNP,并利用PCR-RFLP进行基因分型,发现第552bp处有一个A/G的碱基突变,导致PCR-RFLP-Sal I多态性,为猪肉质性状标记辅助选择提供了新的分子标记,可利用该标记检测中外猪种的情况。
【专利说明】猪肉质性状相关WNT10B基因分子标记的克隆及应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜分子生物学【技术领域】,涉及一种包含如SEQ ID N0 :1所示猪肉质 性状相关基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQ ID N0 :1所示的WNT0B基因的分子 克隆方法及多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及其在猪分子标记辅助选择中的应 用。

【背景技术】
[0002] 猪肉是我国13亿人口餐桌上最主要的肉类,2009年我国出栏生猪数6. 45亿头,居 全球第一。国外品种猪的生长速度已达很高水平,但肉质不良也是不争的事实,猪肉质问题 日益受到广泛关注,在诸多影响因素中,肌内脂肪含量(Intramuscular Fat Content, IMF) 是重要的影响因素,頂F是评价猪肉质好坏的主要指标,能影响猪肉的嫩度、风味、大理石 纹、多汁性等,猪肌内脂肪含量的遗传力约为0. 6,在一定范围内,IMF越高,肉质越好,地方 品种猪肌内脂肪含量要远高于外来猪种,因而肉质优良。
[0003] WntlOb基因是经典Wnt信号转导途径的成员,WntlOb是经典Wnt信号转导途径中 的信号蛋白。Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌与位于细胞膜上的受体相结合,激活胞内的各级 信号转导分子,调节脂肪沉积。但是,畜禽中特别是猪中有关WntlOb基因介导的Wnt信号 转导途径的研究极少,与当今基因功能基因组时代生物科学的飞速发展极不相称。
[0004] Wnt信号转导途径的一项重要功能是调控脂肪沉积,因此深入研究猪中WntlOb基 因的生物学功能及其应用,从分子、细胞和组织水平研究对肌内脂肪沉积调控机理,发掘和 开发新的遗传标记,对于改善肉质,加速学科发展具有重要意义。WntlOb基因介导的信号途 径的研究是猪功能基因组学学科发展和肉质改良亟待解决的问题之一。
[0005]Wnt基因是同源基因wingless和int-1的合称,Sharma等1973年在对果蝇胚胎 发育的研究中发现了无翅基因wingless (wg),Nusser等在研究小鼠乳腺肿瘤时,从小鼠乳 腺肿癌中克隆出一种原癌基因,当时称为int-1。近年来利用这些Wnt基因中保守序列设计 引物进行PCR扩增,从脊椎动物到线虫的许多物种中存在Wnt基因。
[0006] Wnt信号转导是一条多环节、多作用位点及动物发育中的关键信号途径,参与了从 人类到线虫等不同物种的胚胎发育、细胞分化及成体正常代谢等过程,Wnt及其信号转导的 研究主要集中在细胞分化、胚胎发育及多种疾病等方面。
[0007] Wnt信号转导是一条非常保守的信号转导途径,在水螅和人类中都发现该途径,根 据Wnt转导信号的方式,Wnt信号转导途径分为经典Wnt信号途径(Canonical Wnt signal Pathway)和非经典的 Wnt 信号途经(Noncanonical Wnt Signal Pathway)。
[0008] 经典Wnt信号途径亦称Wnt/0连环蛋白(0-catenin)信号途径,在细胞质中存 在着一个动态的能够感应受体信号的蛋白复合体,该复合体又称为3-catenin降解复合 体,由轴蛋白(Axin)、腺瘤状息肉病(Adenomatous polyposis coli,APC)、糖原合成酶激酶 (Glycogensynthetasekinase-3P,GSK-3 6)、酪蛋白激酶(Caseinkinasela,CKla) 等组成。当胞外无Wnt蛋白信号时,该蛋白复合体中的GSK-30磷酸化游离0-catenin 蛋白的特异位点,导致0-catenin降解,使细胞质中的0-catenin处于较低的浓度;当存 在胞外Wnt蛋白时,Wnt蛋白(如WntlOb)与其特异性受体卷曲蛋白(frizzled, Frz)及 辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6,LR P5/6)结合后,激活散乱蛋白(dishevlled,Dvl),激活的Dvl蛋白抑制了 GSK-30活性,从而阻止胞质内游离的0-catenin降解,导致内源性0-catenin在细胞 质中积聚并进入细胞核,与其下游信号分子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(Tcf/Lef)或 Tsh、Xs 〇X17及组蛋白乙酰转移酶糖结合蛋白(CBP)互相作用,激活经典Wnt信号途径的相 关靶基因,调控脂肪细胞。
[0009] 非经典Wnt信号途径中P -catenin不积聚的Wnt蛋白(如Wnt4、Wnt5a、Wntll) 通过其他方式转导细胞信号的途径称为非经典Wnt信号途径,在该途径中,Wnt只与Frz作 用,不需要LRP5/6。Wnt/细胞平面极性途径(planar cell polarity pathway)通过小G 蛋白Rho等,激活Jun激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK),调节细胞骨架的不对称分布 和上皮细胞的协同极化、调节细胞的平面极性、胚胎发育的阶段性调控等,最终导致核内靶 基因表达。Wnt/Ca 2+信号途径由Wnt5a和Wntll激活,通过细胞内介导的Ca2+钙调蛋白依 赖性蛋白激酶II和蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)及f丐调磷酸酶(calcineurin,CAN) 等起作用,导致细胞内Ca2+释放,从而影响细胞黏连和基因表达。
[0010] 目前,国内外对猪WNT10B基因及其结合蛋白和该基因在不同组织和不同品种猪 表达差异的报道研究甚少,开展该基因的生物信息学分析和基因表达谱的研究将为WNT10B 基因分子遗传特性、在肌内脂肪沉积等基因功能研究提供基础依据。本发明旨在为揭示 WNT10B基因对猪肌内脂肪含量等肉质性状的调控奠定基础。


【发明内容】

[0011] 本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足,提供一种猪肉质性状 相关WNT10B基因分子标记的克隆及应用,通过克隆猪WNT10B基因CDNA分子,寻找WNT10B 基因的突变位点以及检测该基因的多态性,为猪肉质性状标记辅助育种提供有用的分子标 记。
[0012] 为了解决上述问题,本发明所采用的技术方案是:一种猪肉质性状相关WNT10B基 因,其DNA序列如SEQ ID N0 :1所示,在SEQ ID N0 :1序列的552 bp处有1个A/G的碱基 突变,导致PCR-RFLP-Sal I多态性。
[0013] 本发明以人的WNT10B基因序列(GenBank收录号为NM_003394. 3)为种子序列, 在 GenBank 中利用 BLASTN(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide),参照其同 源性在80%以上的猪EST(Expression Sequence Tags)设计特异引物,利用RACE(Rapid Amplification of cDNA End),克隆出猪WNT10B基因cDNA全长,该猪WNT10B基因的DNA序 列如SEQ ID N0:1所示。WNT10B基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的WNT10B 基因序列设计引物,以猪的基因组DNA为模板扩增,扩增片段利用测序筛选SNP,并利用 PCR-RFLP进行基因分型技术,发现第552 bp处有一个A/G的碱基突变,导致PCR-RFLP-Sal I多态性,并利用该标记检测了中外猪种的情况。
[0014] 试验材料:25日龄沙子岭猪由湖南省湘潭市沙子岭猪资源场提供,取背最 长肌-80 °C 保存,5 ' -RACE Version 2. 0 试剂盒购于 Invitrogen 公司,3 ' -RACE SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒购于 Clontech 公司。
[0015] 总RNA提取与cDNA第1链的合成:用SUPERSCRIPT II RT酶和特异性引物GSP-1 对总RNA进行基因第一链cDNA的合成,使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理,最 后对cDNA进行纯化。
[0016] 引物设计:据GenBank人WntlOb基因(登录号NM_003394. 3)序列保守区设计引 物,引物设计的软件为Primer Premier 5. 0,引物设计的原则是特异性引物长度在23-28 个核苷酸,GC含量在50% -70%,退火温度为65°C -70°C,使用巢式PCR进行扩增。
[0017] 编码序列PCR扩增:以合成的猪cDNA为模板,在保守区设计引物经过克隆测序,获 得该基因部分CDS(codingdomainsequence)序列。
[0018] 5' -RACE扩增:使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上多聚C,使用引物 GSP5(Gene_Specific Primers)和试剂盒中的桥连铆钉引物AUAP(表1)对已经加dC尾的 cDNA进行PCR第一轮扩增;使用引物GSP-3和试剂盒里中的桥连通用扩增引物AUAP进行 巢式PCR第二轮扩增,将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化,纯化后 的PCR产物与pMD18-T进行连接,转化后对阳性克隆进行测序,获得268 bp的目的序列。
[0019] 3'-RACE扩增:使用合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。将第一轮PCR扩 增产物稀释50倍,然后用引物GSP3和UPM(UniversalPrimerAMix)(表1)进行第二轮 PCR扩增。将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。纯化后的PCR产 物与PMD18-T进行连接,转化后挑取阳性克隆测序。
[0020] 将扩增得到的5' -RACE长度为268 bp、3' -RACE扩增得到的长度910 bp和开 放阅读框长度为1058 bp的编码序列的序列拼接得WNT10B基因的全长cDNA序列,从而完 成本发明的WNT10B基因的克隆的内容。
[0021] 表1本发明中使用的引物序列
[0022]

【权利要求】
1. 一种猪肉质性状相关1阶108基因,其0嫩序列如3£〇10勵:1所示,在3£〇10勵:1序列的552bp处有1个A/G的碱基突变,导致PCR-RFLP-Sall多态性。
2. 检测权利要求1所述的猪肉质性状相关WNT10B基因的碱基突变的引物对,其 特征在于,所述引物对序列是:正向引物为5' -AATCTGAAGCGGAAATGC-3',反向引物为 5, -TAAAGGGACTCCAGGGTT-3,。
3. 制备如权利要求1所述的猪肉质性状相关WNT10B基因的方法,其特征在于,该方法 是以猪的基因组DNA为模板,利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增,利用限制性内切 酶Sal I对PCR产物进行酶切鉴定,最后电泳检测AA、AG和GG基因型的分布。
4. 权利要求1所述的猪WNT10B基因在猪肉质性状相关的分子标记辅助选择中的应用。
5. 权利要求2所述的引物对在猪肉质性状相关WNT10B基因的分子标记辅助选择中的 应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104450729SQ201410850623
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】马海明, 王玲玉, 蒋隽 申请人:湖南农业大学
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