假肥大型肌营养不良症的检测探针及其无创检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种假肥大型肌营养不良症的检测探针及检测试剂盒，该检测探针为SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸序列，该检测试剂盒中含有SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:546所示的核酸序列。本发明的检测探针或检测试剂盒能够一次性检测DMD基因各种突变信息，包括外显子缺失/重复、点突变在内的DMD基因的完整突变信息；具有全面、快速、准确、价格适中的优点，解决了DMD分子诊断的瓶颈。本发明试剂盒适于肌肉、血液和羊水等多种组织样本的检测。该试剂盒能够检出外显子区和内含子区致病突变；能够检出已知突变，也能发现未报道致病突变；此外还能用于检测经干细胞治疗后病人基因是否被纠正。
【专利说明】假肥大型肌营养不良症的检测探针及其无创检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种基于杂交捕获技和半导体测序技术快速 检测假肥大型肌营养不良症致病基因突变的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 假肥大型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种以进行性 四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大为特征，同时累及心肌和呼吸肌，部分患 者伴有智力障碍的致死性X连锁隐性遗传病，其发病率为活产男婴的1/3500。患者从3-5 岁起病，12岁左右失去行走能力，20多岁死亡。Becker肌营养不良症（Becker muscular dystrophy，BMD)与DMD互为等位基因异质性疾病，其发病率有报道为1/30000,发病年龄比 DMD晚，进展速度慢。目前国内外尚缺乏对本病特效的治疗方法，故通过对先证者的确诊、携 带者的产前诊断和提供正确的遗传咨询以杜绝假肥大型肌营养不良症患儿的出生是降低 本病发病率的关键措施。
[0003] DMD/BMD是由定位于Xp21. 2-21. 3的编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin)的DMD基因 突变所致。大约有60-65%的DMD患儿是由于DMD基因外显子缺失所致，5-10%是由于DMD 基因外显子重复所致，其余约30%是由于DMD基因微小突变导致。
[0004] 目前DMD基因的突变检测方法主要有如下几种：Southern杂交法（Southern blotting)、多重PCR、多重连接依赖式探针扩增法（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、变性高效液相色谱法（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)、微阵列-比较基因组杂交法（array comparative genomic hybridization, arrayCGH)、单链 构象多 态性法(single-strand conformation polymorphism, SSCP)、变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)、高分辨率溶解曲线分析法（high resolution melting curve analysis, HRM)、Sanger测序法等。上述这些检测方法存在的突出问题是：只能检出部分突 变类型，检出率低；约30%患儿需要进行二次检测，增加了检测周期和检测成本。故此，本 领域迫切需要建立一种可以一次性检测DMD基因所有突变且快速、准确的方法，以满足临 床上基因诊断、产前诊断、种植前诊断的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供假肥大型肌营养不良症的检测探针。
[0006] 本发明的另一目的在于提供含有上述假肥大型肌营养不良症的检测探针的检测 试剂盒。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
[0008] 一种检测假肥大型肌营养不良症的检测探针为SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO: 546所 示的核酸序列。
[0009] 一种检测假肥大型肌营养不良症的核酸探针混合物，该核酸探针混合物含有核苷 酸序列为SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO:546所示的核酸探针。
[0010] -种检测假肥大型肌营养不良症的试剂盒，该试剂盒中含有核苷酸序列为SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO:546所示的核酸探针。
[0011] -种检测待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的核苷酸序列的方法， 包括以下步骤：
[0012] 1)基因组DNA文库的构建：提取将待测样品中的基因组DNA，并将其打断成100? 500bp大小的片段；将打断后的双链DNA片段的两端进行末端修复后，再连接上测序接头； 即可获得DNA文库；
[0013] 2) DNA文库的优化：将上述DNA文库中带有测序接头的DNA片段进行PCR扩增，获 得优化的DNA文库；
[0014] 3)第一次杂交捕获靶序列：将优化的DNA文库中的双链DNA片断变性后，利用权 利要求1中所述的检测探针SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO:546对其进行杂交捕获靶序列；
[0015] 4)靶序列洗脱和第一次PCR扩增：将上一步捕获的靶序列进行洗脱，将洗脱下来 的靶序列进行PCR扩增；
[0016] 5)第二次杂交捕获靶序列：将上一步PCR扩增后的靶序列进行变性后，再用权利 要求1中所述的检测探针SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO:546进行杂交捕获；
[0017] 6)靶序列洗脱和第二次PCR扩增：将上述第二次捕获的靶序列进行洗脱，并将洗 脱下来的靶序列进行第二次PCR扩增；
[0018] 7)将上述第二次PCR扩增的产物进行测序，即可获得与DMD相关的核酸分子序列； 对该序列进行生物信息学分析，确定待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的突 变情况；
[0019] 上述方法用于非诊断目的。
[0020] 进一步的，上述步骤1)中所述测序接头包括A接头和Pl接头，其序列如下：
[0021] A接头的序列为：
[0022] 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3' （SEQ ID N0:547);
[0023] 3,-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5, （SEQ ID N0:548);
[0024] 上述序列中的N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种；
[0025] Pl接头的序列为：
[0026] 5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3' （SEQ ID N0:549);
[0027] 3,-TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5, （SEQ ID N0:550)〇
[0028] 进一步的，上述步骤3)和步骤5)中所述第一次和第二次杂交捕获靶序列的具体 操作为：
[0029] 1)利用试剂盒SureSelect TE Reagent Kit, PTN, 16 按照说明书配制杂交buffer， 配方如下所示：
[0030]
【权利要求】
1. 一种检测假肥大型肌营养不良症的检测探针为SEQ ID NO: 1~ SEQ ID NO:546所示 的核酸序列。
2. -种检测假肥大型肌营养不良症的核酸探针混合物，其特征在于：该核酸探针混合 物含有核苷酸序列为SEQ ID NO: 1~ SEQ ID NO:546所示的核酸探针。
3. -种检测假肥大型肌营养不良症的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有核苷酸序 列为SEQ ID NO: 1~ SEQ ID NO:546所示的核酸探针。
4. 一种检测待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的核苷酸序列的方法，其 特征在于：包括以下步骤： 1) 基因组DNA文库的构建：提取将待测样品中的基因组DNA，并将其打断成100? 500bp大小的片段；将打断后的双链DNA片段的两端进行末端修复后，再连接上测序接头； 即可获得DNA文库； 2. DNA文库的优化：将上述DNA文库中带有测序接头的DNA片段进行PCR扩增，获得 优化的DNA文库； 3) 第一次杂交捕获靶序列：将优化的DNA文库中的双链DNA片断变性后，利用权利要 求1中所述的检测探针SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO:546对其进行杂交捕获靶序列； 4) 靶序列洗脱和第一次PCR扩增：将上一步捕获的靶序列进行洗脱，将洗脱下来的靶 序列进彳T PCR扩增； 5) 第二次杂交捕获靶序列：将上一步PCR扩增后的靶序列进行变性后，再用权利要求1 中所述的检测探针SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO: 546进行杂交捕获； 6) 靶序列洗脱和第二次PCR扩增：将上述第二次捕获的靶序列进行洗脱，并将洗脱下 来的靶序列进行第二次PCR扩增； 7) 将上述第二次PCR扩增的产物进行测序，即可获得与DMD相关的核酸分子序列；对 该序列进行生物信息学分析，确定待测样品中假肥大型肌营养不良症相关核酸分子的突变 情况； 上述方法用于非诊断目的。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述测序接头包括A接头和 Pl接头，其序列如下： A接头的序列为： 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3, (SEQ ID NO:547)； 3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5' （SEQ ID N0:548); 上述序列中的N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种； Pl接头的序列为： 5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3, (SEQ ID NO:549)； 3'-TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5' （SEQ ID NO:550)。
6. 根据权利要求I所述的方法，其特征在于：步骤3)和步骤5)中所述第一次和第二 次杂交捕获靶序列的具体操作均为： 1)利用试剂盒SureSelect TE Reagent Kit, PTN, 16按照说明书配制杂交buffer， 配方如下所示：
将配制好的杂交buffer 65°C预热5min ; 2) 利用试剂盒SureSelect TE Reagent Kit, PTN, 16按照说明书配制杂交文库体系， 配方如下所示：
将配制好的文库体系于95°C预杂交5min ; 其中 Ion Pl Adapter Block 和 Ion Xpress Barcode X Block，其目的在于分别封闭 文库构建中用到的Pl接头和A接头，防止文库上的这两个接头序列和探针杂交；其序列如 下： Ion Pl Adapter Block 序列为： 5'-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG/3SpC3/- 3' (SEQ ID NO:551)； Ion Xpress Barcode X Block 序列为： 5'-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG/3SpC3/- 3' (SEQ ID NO:552) 上述序列中N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种，以保证与相应的A接头序列匹配， "/3SpC3/"代表硫代磷酸键修饰； 3) 配制 SureSelect Oligo Library Mix，其中含有 SEQ ID NO: 1~ SEQ ID NO: 546 所 不的 546 种探针和 RNase block，并将 SureSelect Oligo Library Mix 65°C预热 2min; 4) 将上述处理后的杂交文库体系、杂交buffer和SureSelect Oligo Library Mix混 匀，65°C孵育16?24h进行杂交捕获。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)和步骤6)中所述第一次PCR扩 增和第二次PCR扩增的引物为： Primer-F :5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3'（SEQ ID NO:553)， Primer-R :5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'（SEQ ID NO:554)〇
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7)中所述测序为半导体测序。
9. 根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：所述的测序用Ion PGM Dx或Ion Proton测序仪进行的半导体测序。
【文档编号】C12Q1/68GK104498614SQ201410856009
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】尹鸿瑛, 陶锦胜, 吴春求, 陈样宜 申请人:广州和泰科技有限公司