结合脱落细胞学形态及荧光原位杂交来检测肺癌的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种结合脱落细胞学形态及荧光原位杂交来检测肺癌的试剂盒，包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有三色探针的试剂管(4)、装有二脒基苯基吲哚DAPI的试剂管(5)、装有胃蛋白酶的试剂管(6)、装有二巯基苏糖醇的试剂管(7)、装有NP-40裂解液的试剂管(8)、装有染色剂苏木素的试剂管(9)、装有巴氏OG-6的试剂管(10)、装有巴氏EA50的试剂管(11)、装有固定剂Saccomanno的试剂管(12)、装有枸椽酸盐SSC的试剂管(13)、装有磷酸盐缓冲液PBS的试剂管(14)被设置在所述小孔内。本实用新型结构简单、设计合理，检测步骤简便，检测速度快，便于在临床推广应用。
【专利说明】 结合脱落细胞学形态及荧光原位杂交来检测肺癌的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于分子细胞生物学领域，涉及一种检测肺癌的试剂盒，尤其涉及一种结合脱落细胞学形态及荧光原位杂交来检测肺癌的试剂盒。
【背景技术】
[0002]肺癌是人类最常见、发病率最高、死亡率最高、治疗效果较差、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第一位。
[0003]由于肺癌早期无特异性临床症状和表现，80%的患者就诊时已属中晚期，临床治疗效果和中位生存期都令人不满意，I年生存率仅为12%。然而，研宄显示I期肺癌术后10年生存率可达到92%。因此，降低肺癌患者死亡率的关键在于早期诊断和早期治疗。
[0004]目前，肺癌的早期诊断方法主要有以下几种。1、影像学检查:胸部影像学检查是诊断肿瘤最重要的方法之一，对早期诊断肺癌有重要意义。主要包括X线检查、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层显像、正电子发射计算机体层显像(PEN)等。2、肿瘤标记物检查:如癌胚抗原(CEA)、癌抗原125 (CA — 125)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21 -1)、肺癌相关抗原等，经证实，多种肿瘤标记物联合检测能提高肺癌诊断阳性率。3、支气管镜检:如支气管内超声、自动荧光支气管镜等。4、胸腔镜和纵膈镜。5、痰脱落细胞检查:传统痰脱落细胞学检查因受诸多因素影响，敏感性极低，未能广泛应用。
[0005]虽然以上方法对肺癌的早期诊断有一定帮助，但却各有利弊，不尽如人意。肿瘤标记物检查和传统痰脱落细胞检查虽检测方法简单，创伤小，但因受各种因素影响，敏感性低；影像学检查虽对早期肺癌诊断有一定意义，特别是胸部X线、CT及MRI是临床上常用的检查方法，但其有辐射，对人体有一定的伤害；支气管镜和胸腔镜等检查虽从不同角度和层面解决了传统技术存在的缺陷，提高肺癌的诊断率，并对肺癌分期有重要指导作用，但其作为一种有创检查，给患者带来一定痛苦，且对毫无症状的高危人群，不能作为一种筛查手段。因此，寻找一种新的有助于肺癌早期诊断的方法是亟待解决的问题。
实用新型内容
[0006]为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种结合脱落细胞学形态及荧光原位杂交来检测肺癌的试剂盒，其标本采集方便、简单易行、无创、无辐射、同时又具有高特异性和敏感性，大大提高了肺癌的早期诊断率。
[0007]为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是:结合脱落细胞学形态及荧光原位杂交来检测肺癌的试剂盒，所述试剂盒包括盒体(I)、盒盖(3)和设置在盒体(I)内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有三色探针的试剂管(4)、装有二脒基苯基吲哚DAPI的试剂管(5)、装有胃蛋白酶的试剂管￠)、装有二巯基苏糖醇的试剂管(7)、装有NP-40裂解液的试剂管(8)、装有染色剂苏木素的试剂管(9)、装有巴氏OG-6的试剂管(10)、装有巴氏EA50的试剂管(11)、装有固定剂Saccomanno的试剂管(12)、装有枸椽酸盐SSC的试剂管(13)、装有磷酸盐缓冲液PBS的试剂管(14)被设置在所述小孔内。
[0008]根据本实用新型的实施例，所述衬垫(2)上设有11个小孔，所述小孔在所述衬垫
(2)上分成3排平行排列。
[0009]通过以上技术方案，本实用新型的有益效果如下:
[0010]本实用新型采用结合肺脱落细胞学形态及FISH检测方法，将传统痰脱落细胞学检查进行改良，在改良细胞学的基础上结合荧光原位杂交(FISH)，从形态及基因水平对肺癌细胞进行检测。本方法标本采集方便、简单易行、无创、无辐射；高科技的分析系统可有效去除杂细胞的干扰，同时又具有高特异性和敏感性；将巴氏染色和FISH技术相结合，从形态学和基因水平出发，提高了肺癌早期诊断的准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本实用新型的实施例的结构示意图；
[0012]图中，1-盒体、3-盒盖、2-衬垫、4-装有三色探针的试剂管、5-装有二脒基苯基吲哚DAPI的试剂管、6-装有胃蛋白酶的试剂管、7-装有二巯基苏糖醇的试剂管，8-装有NP-40裂解液的试剂管、9-装有染色剂苏木素的试剂管、10-装有巴氏0G-6的试剂管、11-装有巴氏EA50的试剂管、12-装有固定剂Saccomanno的试剂管、13-装有枸椽酸盐SSC的试剂管、14-装有磷酸盐缓冲液PBS的试剂管。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本实用新型的【具体实施方式】作进一步描述，本实用新型的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何限制。
[0014]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0015]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0016]如图1所示，本实用新型提供了一种用于将脱落细胞学形态及FISH相结合检测肺癌的试剂盒，所述试剂盒包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体(I)内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有三色探针的试剂管(4)、装有二脒基苯基吲哚DAPI的试剂管(5)、装有胃蛋白酶的试剂管(6)、装有二巯基苏糖醇的试剂管(7)、装有NP-40裂解液的试剂管
(8)、装有染色剂苏木素的试剂管(9)、装有巴氏0G-6的试剂管(10)、装有巴氏EA50的试剂管(11)、装有固定剂Saccomanno的试剂管(12)、装有枸椽酸盐SSC的试剂管(13)、装有磷酸盐缓冲液PBS的试剂管(14)被设置在所述小孔内。
[0017]其中，所述衬垫⑵上设有11个小孔，所述小孔在所述衬垫(2)上分成3排平行排列。
[0018]检测步骤如下:
[0019](I)首先米集标本
[0020]对肺癌检测有诊断意义的细胞来自下呼吸道。为了提高标本的有效细胞采集率，采用雾化器使患者吸入高渗盐水从而增加且液化分泌物，刺激患者咳嗽，导致最终咳出的下呼吸道痰液中包含目标样本。采集标本的步骤如下:
[0021]a.在样本采集之前病人需要漱口或者喝一杯水(防止样本污染)；
[0022]b.坐直，在口中放置雾化器喉舌(如需要，适用鼻夹)，打开雾化器；
[0023]c.深吸雾化器产生的液雾5min，之后会发生咳嗽；
[0024]d.如果无自发性咳嗽，请病人自主咳嗽；
[0025]e.直至咳出深肺中分泌物，吐入样本收集容器；
[0026]f.若只咳出唾液，则丢弃样本收集容器直至目标样本收集；
[0027]g.整个过程持续15?20min，直至较好的样本被收集。
[0028](2)处理收集到的样本，挑取目标细胞进行制片，并进行形态学染色
[0029]2.1从唾液中分离痰栓
[0030]a、挑选粘质、白色的痰栓，用吸管将其转移至培养皿中，尽量避免唾液和固定剂Saccomanno ；
[0031]b、若标本浓度小，即很难挑选出痰栓，则应将整瓶标本倒入离心管内，1500rpm离心5-10min，弃去上清液。
[0032]C、将痰栓切割成大小均一的小碎片，将其中1.5ml移至15ml离心管中。
[0033]2.2制备细胞悬液原液(STOCK液)
[0034]在离心管中加入2.5ml 二巯基苏糖醇(Sputolysin)；混匀，37 °C水浴锅孵育15min，每5min摇勾一次；加入磷酸盐缓冲液(PBS)至5ml，1500转/分离心7min ;弃上清，加PBS至4ml, 1100转/分离心4min ;弃上清，轻弹离心管，混勾。
[0035]2.3制备白片
[0036]a.制备细胞悬液工作液(DILUTE液):
[0037]根据细胞STOCK液的细胞密度，选择合适量的“STOCK”悬液和适量50%酒精混匀，制备成“DILUTE ”细胞悬液；将适量的“DILUTE ”细胞悬液倒入漏斗中，在1500rpm离心5min ;取下制备好的白片；显微镜下观察白片质量(细胞密度)；在95%酒精中固定20min，室温干燥10_20min。
[0038]2.4形态学染色
[0039]采用苏木素染色lmin，至染色明显为止；自来水清洗30sec，浸入0.25% HCL分化l-2sec ；自来水清洗30sec，放入95% 1、95% II乙醇中各1sec ;在橘黄0G-6中染色lmin,放入95% 1,95% II乙醇中各1sec ;放入EA50中染色Imin ;依次放入95% 1,95% II乙醇中各10sec，100% 1,100% II乙醇中各lmin，二甲苯1、II各2min ;封片检查形态学染色；形态学扫描。
[0040](3)标记目标细胞
[0041]形态学染色后，白片中会有成千上万的细胞，对所有细胞进行分类，去除杂细胞的干扰，标记目标细胞。
[0042](4)荧光原位杂交(FISH)，从基因水平进行检测。
[0043]4.1预处理:将备好的片子依次在事先预热的2X标准枸椽酸盐(SSC)中及胃蛋白酶工作液中进行处理，经PBS及梯度酒精后风干2?5min，然后将玻片置于37°C烤片机上使残留酒精蒸发5min。
[0044]4.2进行杂交冰箱内取出探针，室温静置
[0045]离心探针l_3sec，混匀后再次离心。在玻片上滴加3.8 μ I探针，立即盖上13mm的盖玻片，避免气泡；封胶，将盖玻片放入湿盒内，并置于杂交仪上，然后进行变性、杂交；
[0046]4.3杂交后处理
[0047]移去胶水和盖玻片，依次采用0.4XSSC、2XSSC/0.1 % NP-40处理，然后避光风干，滴加10 μ I 二脒基苯基吲哚(DAPI)，加盖22 X 50mm的盖玻片，在Χ60荧光显微镜下观察，多余75%的细胞有信号才算合格；进行荧光扫描。
[0048](5)FISH染色完成后，将荧光视野下的细胞和明场(即形态学染色)的细胞进行匹配，即有针对性的分析目标细胞而去除杂细胞的干扰，从而大大提高特异性和敏感性。
[0049]检测结果如下:
[0050](I)当异常细胞指数为O时，采用细胞形态学结合FISH检测未见异常细胞，但可见少量炎性细胞；
[0051](2)当异常细胞指数小于阈值时，采用细胞形态学结合FISH检测可见异常细胞，但未超过阈值，需要3-6个月后用本方法复查或进行X线等相关项目检测；
[0052](3)当异常细胞指数大于阈值时，采用细胞形态学结合FISH检测可见异常细胞且超过阈值，存在肺癌的可能，需要结合X射线断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)及病理活检等检查结果进一步明确诊断。
[0053]其中，异常细胞指数=异常细胞数/可计数的靶细胞数
[0054]异常细胞指FISH染色后，在荧光显微镜下观察存在基因扩增或缺失的细胞；
[0055]当可计数的靶细胞数多200个时，阈值为多7.5%;当可计数的靶细胞数位于50与200个之间时，阈值位于7.5%?10%之间；如果可计数的靶细胞数< 50个，则视为不合格标本，建议重新取样送检。
[0056]上面已经举例说明了本实用新型的实施例，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。
【权利要求】
1.一种结合脱落细胞学形态及荧光原位杂交来检测肺癌的试剂盒，其特征在于包括盒体(1)、盒盖(3)和设置在盒体(I)内的衬垫(2)，所述衬垫(2)上设有小孔，装有三色探针的试剂管(4)、装有二脒基苯基吲哚DAPI的试剂管(5)、装有胃蛋白酶的试剂管￠)、装有二巯基苏糖醇的试剂管(7)、装有NP-40裂解液的试剂管(8)、装有染色剂苏木素的试剂管(9)、装有巴氏0G-6的试剂管(10)、装有巴氏EA50的试剂管(11)、装有固定剂Saccomanno的试剂管(12)、装有枸椽酸盐SSC的试剂管(13)、装有磷酸盐缓冲液PBS的试剂管(14)被设置在所述小孔内。
2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:其中，所述衬垫(2)上设有11个小孔，所述小孔在所述衬垫(2)上分成3排平行排列。
【文档编号】C12Q1/04GK204138674SQ201420429776
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】刘建勇, 李微, 张益清, 王绪华, 梁超, 陈忠, 方国伟, 黄士昂 申请人:北京海思特临床检验所有限公司