一种活性纳豆粉的制备方法与流程

本发明涉及一种纳豆粉的制备方法，特别是一种以豆粉为原料制备活性纳豆粉的方法。

背景技术：

纳豆是由黄豆通过纳豆菌(枯草杆菌)发酵制成豆制品，具有黏性，气味较臭。纳豆具有抗菌、降血压、抗血栓、抗氧化、预防癌症等多种生理调节功能。纳豆菌为革兰氏阳性菌，属细菌科芽孢杆菌属，好氧型，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种。纳豆距今已有近2000的历史，盛行于日本，被认为是日本人长寿的“秘方”。它的传统制法是将蒸熟的黄豆用稻草包裹起来，稻草浸泡在100℃的沸水中以杀菌消毒，并保持在湿度比较高的地方发酵1-2d。稻草上常见的枯草杆菌(纳豆菌)因可产生芽孢而耐热度高，杀菌过程不受破坏，高温培养速度快也能抑制其他菌种，并使黄豆发酵后产生黏稠的丝状物。

纳豆因其良好的功效逐渐成为国内外食品研究的热点，从单纯的家庭食品演变成商业保健产品而被大批量生产。为了获取高质量的纳豆产品，纳豆的培养方式与培养条件得到了更新与优化。日本是最早致力于研究纳豆培养的。1974年，日本生物科学研究所(又名株氏会社)成立，致力于纳豆产品的开发和研制，是从事纳豆研究最早的厂商之一。1997年7月18日，日本株氏会社医学生物学研究所増井胜信、柴山裕治等人将利用丙酮分离提取纳豆的粘性物质并对其进行活性检测，确定最佳的氮源为大豆蛋白胨、最佳发酵温度为35℃、最适pH在6-8。Aydin Berenjian、Natalie Li-Cheng Chan等人在2013年对影响纳豆菌中维生素K₂生成的培养条件进行研究，确定了甘油、大豆蛋白胨和酵母提取物混合物为最佳营养物质以及45℃为最适温度，利用摇床培养可以显著提高发酵效果。

国内对纳豆菌的培养条件的研究也较多，例如，2001年，钟青萍、佘世望、梁胜媛对纳豆菌产生抗菌物质的培养基组成进行了优化，并探讨了培养温度、培养时的pH、接种菌株量和培养方式等条件对纳豆菌生长和抗菌作用的影响，初步确定发酵的适宜温度为25℃-30℃，生长培养基的最适宜的pH为6.5-7.5，适宜的接种量6％，而振荡培养优于静置培养。2010年，韩烨、周志江等人对实验室分离到的纳豆菌Y-07进行了发酵条件的优化，利用还原糖测定的方法及生物量测定的方法，确定了最佳碳源为葡萄糖、最佳氮源为大豆蛋白胨，最适宜的发酵温度为35℃。通过改良制备方法得出，添加比例适当的葡萄糖和大豆蛋白胨，可以提高纳豆制品的质量。2016年，刘野、苏杭等人以纳豆激酶活性为指标，采用了琼脂糖-纤维蛋白平板法，通过单因素实验的方法，最终确定纳豆发酵条件：大豆浸泡时间为15小时，蒸煮时间为51分钟，发酵温度为37.5℃。

但是，现有的纳豆生产都存在发酵过程中工程菌与底物间的接处面积小，菌株的对底物的转化效率低，单位纳豆粉的有效活性成分含量低，每克产品的活性单位比较小，因而转化效率低。

技术实现要素：

技术问题，本发明的目的是为了解决目前生产过程中单位纳豆粉的有效活性成分含量低的缺陷，提供一种活性纳豆粉的制备方法，采用大豆粉作为基础材料，有效增大了发酵过程中工程菌与底物间的接处面积，提高了菌株的对底物的转化效率，从而提高了单位纳豆粉的有效活性成分含量。

技术方案：本发明的活性纳豆粉的制备方法，包括如下步骤：

A.去杂洗涤

除去黄豆中杂质，洗净，烘去表面水份；

B.破碎灭菌

将洗净的黄豆粉碎、过筛，按容器体积的十分之一装量装入豆粉，用封口膜封口，在121℃高温下灭菌20min；

C.浸渍接种

将纳豆菌菌液与灭菌后的生理盐水按1：5～9混匀，均匀喷洒到灭菌后豆粉中，使豆粉充分浸润后封口；

D.发酵培养

将接种好的豆粉放置在培养箱中培养，培养10-14h后取出，去掉培养用容器的封口膜或通入空气继续培养18—36h；

E.冷冻干燥

将得到的发酵产物进行冷冻干燥至含水量为3％--5％，得到高活性纳豆粉。

2.根据权利要求1所述的一种活性纳豆粉的制备方法，其特征在于：所述黄豆粉碎、过筛后的粒度为20～100目。

有益效果：本发明采用大豆粉作为基础材料进行发酵培养，有效地增大了发酵过程中工程菌与底物间的接处面积，增加与菌株的接触面积，比传统方法获得的纳豆粉活性高30％以上，提高了菌株的对基础材料的转化效率，从而提高了单位纳豆粉的有效活性成分含量，显著提高了单位产品的活性，解决了目前生产过程中单位纳豆粉的有效活性成分含量低的缺陷，实现了底物在短时间内的高效转化，为生产活性纳豆粉提供了技术支持，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1是本发明以不同粒度的黄豆粉为培养基得到的纳豆粉纤溶活性比较示意图。

图中：1-为60—80目豆粉，2-为整豆，3-为20-40目豆粉。

具体实施方式

实施例1、采用粒度为20-40目豆粉3作为基础材料，如图1所示，

A.去杂洗涤除去黄豆中杂质，洗净，烘去表面水份。

B.破碎灭菌

将洗净的黄豆粉碎、过筛，在100mL三角瓶中装入粒度为20-40目粒度的豆粉10g，用封口膜封口，在121℃的高温下灭菌20min；

C.浸渍接种

将纳豆菌菌株从斜面培养基上转至液体LB培养基中，LB培养基为常用培养基，其配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min；将LB培养基在37℃、120r/min搅拌培养16h，从此培养液中取1mL转至100mL LB培养基中，以相同条件培养4.5h，按：1：5的比例，取1mL纳豆菌菌液加入到灭菌后的5mL 0.9％的生理盐水中，混匀后均匀喷洒到豆粉中，使豆粉充分浸润后封口；

D.发酵培养

将接种好的豆粉放置在38℃培养箱中培养，培养10h后，去掉三角瓶的封口膜，继续培养24h；

E.冷冻干燥

将得到的发酵产物进行冷冻干燥至含水量为3％--5％，得活性纳豆粉，以尿激酶为参照标准，纤溶活性可达3500IU/g。

实施例2、采用粒度为60-80目豆粉1作为基础材料，如图1所示，

A.去杂洗涤除去黄豆中杂质，洗净，烘去表面水份。

B.破碎灭菌

将洗净的黄豆粉碎、过筛，在100mL三角瓶中装入粒度为60-80目豆粉10g，在121℃的高温下灭菌20min；

C.浸渍接种

将纳豆菌菌株从斜面培养基上转至液体LB培养基中，在37℃、120r/min培养16h，从此培养液中取1mL转至100mL LB培养基中，以相同条件培养4.5h，按1：9的比例取1mL纳豆菌菌液加入到灭菌后的9mL 0.9％生理盐水中，混匀后均匀喷洒到豆粉中，使豆粉充分浸润后封口；

D.发酵培养

将接种好的豆粉放置在38℃培养箱中培养，培养12h后，去掉三角瓶的封口膜，继续培养20h；

E.冷冻干燥

将得到的发酵产物进行冷冻干燥至含水量为3％--5％，得活性纳豆粉。以尿激酶为参照标准，纤溶活性可达3500IU/g。

实施例3、采用粒度为20-40目豆粉3作为基础材料，如图1所示，

A.去杂洗涤除去黄豆中杂质，洗净，烘去表面水份。

B.破碎灭菌

将洗净的黄豆粉碎、过筛，在1000mL三角瓶中装入粒度为20-40目豆粉100g，在121℃高温下灭菌20min；

C.浸渍接种

将纳豆菌菌株从斜面培养基上转至液体LB培养基中，在37℃、120r/min培养14h，从此培养液中取1mL转至100mL LB培养基中，以相同条件培养5h。按1：8的比例取10mL纳豆菌菌液加入到灭菌后的80mL 0.9％生理盐水中，混匀后均匀喷洒到豆粉中，使豆粉充分浸润后封口；

D.发酵培养

将接种好的豆粉放置在37℃培养箱中培养，培养12h后，去掉三角瓶的封口膜，继续培养36h；

E.冷冻干燥

将得到的发酵产物进行冷冻干燥至含水量为3％--5％，得活性纳豆粉。以尿激酶为参照标准，纤溶活性可达3500IU/g。

实施例4、采用粒度为60-80目豆粉1作为基础材料，如图1所示，

A.去杂洗涤除去黄豆中杂质，洗净，烘去表面水份。

B.破碎灭菌

将洗净的黄豆粉碎、过筛，在直径为35cm圆盆中装入粒度为60-80目豆粉150g，盆口用耐高温透气膜封住，在121℃高温下灭菌20min；

C.浸渍接种

将纳豆菌菌株从斜面培养基上转至液体LB培养基中，在36℃、120r/min搅拌培养16h，从此培养液中取1mL转至100mL LB培养基中，以相同条件培养5h，按1：9的比例取15mL纳豆菌菌液加入到灭菌后的135mL 0.9％生理盐水中，混匀后均匀喷洒到豆粉中，使豆粉充分浸润后封口；

D.发酵培养

将接种好的豆粉放置在37℃培养箱中培养，培养14h后，去掉封口膜，继续培养18h；

E.冷冻干燥

将得到的发酵产物进行冷冻干燥至含水量为3％--5％，得活性纳豆粉。以尿激酶为参照标准，纤溶活性可达3700IU/g。

采用纤维蛋白平板法对得到的活性纳豆粉进行活性检测：取0.075g琼脂糖加入10mL0.9％生理盐水中，加热溶解后置45℃水浴保温30min，加入80单位/mL的凝血酶60μL，混匀；取0.050g血纤维蛋白原溶于10mL0.9％生理盐水中，置45℃水浴中保温5min。

将含凝血酶的琼脂糖溶液和血纤维蛋白原溶液混匀后迅速倒入两个直径9cm平皿中，水平放置30min后放入冰箱中备用。取制备好的纳豆粉0.5g，加生理盐水10mL，浸提1h，取上清液10μL，滴在纤维蛋白平板上，在37℃保温2h，观察有无溶圈出现及出现的溶圈大小。有无溶圈是定性结果，根据溶圈大小，运用标准曲线，便可计算出活性纳豆粉的活性大小，纤溶活性是产品品质的重要指标。在一度范围内，随着基础材料粒度变小，活性变大。检测表明，本发明与现有技术相比提高了单位纳豆粉的有效活性成分含量。