本发明属于益生菌制剂领域，具体涉及一种益生菌微胶囊制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：益生菌是一类当有足够数量定植于人体肠道内则能改善宿主微生态平衡从而产生确切健康功效的活性有益微生物的总称。目前益生菌大体上可以分为三大类，其中包括乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌类。益生菌制品具有广泛的市场，普遍应用于酸奶发酵、防或改善腹泻、缓解不耐乳糖症状、促进肠道消化道系统健康、抑制致病菌、增强人体免疫力及帮助吸收营养成分等。根据国家对益生菌的相关规定，益生菌产品在其保质期内活菌数目或者定植于肠道中的活菌数目不得少于106-107CFUmL-1(g-1)。国内对于益生菌产品主要是看重益生菌产品中所含有的活菌数量，但这样会避开了益生菌在胃部的存活率、定植于肠道的活菌数目、益生菌产品长期保存的稳定性以及菌体代谢产物功能等关键性问题，在一定程度上造成了消费者在认识上的片面性，同时也限制了更有效、更安全的益生菌产品的开发。为了改善益生菌本身的不耐酸、长期储存稳定性差等缺点，近些年来，大量研究致力于通过微型颗粒或者微型胶囊包裹益生菌活菌，然后通过冷冻干燥或者喷雾干燥来生产相关产品。微囊化技术(microencapsulation)，是指利用性能较稳定的天然或者合成高分子材料作为壁材，将性能不稳定的固体、液体等物质包埋在一个封闭“容器”中的技术，微胶囊内部物质称为芯材，包埋基质或者包裹材料称为壁材。微囊化可以保护益生菌免受不利环境因素的影响，所用的微囊化载体材料一般都要求是食品级以上。挤出法是制备微胶囊最常用的办法之一，具有条件温和、成本较低以及无毒等优点，但是使用挤出法制备的微胶囊具有粒径过大等问题，这会限制微胶囊的使用范围，因此在挤出法的基础上，开发一种可以快速制备微米级粒径、粒径分布均一和可控的微胶囊制备方法对益生菌微胶囊的适用性有着重大的应用和经济学意义。基于挤出法制备的微胶囊的物理本质，可以通过一定作用力使菌悬液破解形成微滴，微滴滴入固化剂中固化后得到微胶囊。若采取连续作用力让微滴破裂以及固化一体化则可以较为快速制备微胶囊，实现规模化生产；微胶囊的最终形貌与其对益生菌的包埋程度和微滴的制备条件关系密切，当微滴在气体中形成球状的时候，由于液气界面张力较大，可以维持球形，且益生菌不易扩散，微滴滴入固化剂中后可以形成粒径均一且有效包埋益生菌的微胶囊。以高速旋转的圆碟为核心部件的微滴发生装置可以实现以上的条件(中国专利申请201010177862.3，CN101816913A)。将菌悬液通过蠕动泵装置供至发生装置的圆碟中心，启动电源后，圆碟高速旋转，在1～5s内将菌悬剪切分散为微滴，微滴通过气流作用形成球状并滴入固化剂中，进一步固化成微胶囊。使用微滴发生装置制备微胶囊具有条件温和，操作简单，工艺稳定以及可连续化生产的特点，具有工业化生产应用的潜力。制备益生菌微胶囊制剂过程中，需要对其进行干燥，其中最常用的是真空冷冻干燥法，该方法具有菌存活率高、低温等优点。菌种在真空冷冻干燥后，酶的活性丧失、冻干燥菌粉复水性好、脱水彻底、保存期长、储存运输和使用都很方便，为直投式发酵剂提供良好的基础。但是在实际操作时，冷冻干燥过程中的水结晶、细胞的失水、蛋白失活等情况使得菌体出现死亡或损伤，对于菌种的保存、生产使用非常不利。技术实现要素：基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种益生菌微胶囊及其制备方法和应用，本发明的益生菌微胶囊具有耐酸、稳定的优异性能。为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：一种益生菌微胶囊，包括芯材和壁材，所述芯材为益生菌，所述壁材为含有天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液，所述益生菌与所述混合溶液的质量比为1:1-1:8；所述混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为0.5-5.0％，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为2.0-20.0％。在其中一些实施例中，所述益生菌与所述混合溶液的质量比为1:2-1:6。在其中一些实施例中，所述混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为1-4％，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为5-15％。在其中一些实施例中，所述壁材外还涂覆有包衣材料，所述包衣材料为尤特奇FS30D。在其中一些实施例中，所述益生菌为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌和双歧杆菌中的一种或几种；所述冻干保护剂为葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、阿拉伯胶、右旋糖酐40和脱脂奶粉中的一种或几种；所述天然高分子材料为胶凝糖、黄原胶、k-角叉菜胶和海藻酸钠中的一种或几种。在其中一些实施例中，所述冻干保护剂为乳糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、阿拉伯胶和右旋糖酐40中的一种或几种；所述天然高分子材料为胶凝糖、黄原胶和海藻酸钠中的一种或几种。本发明还提供了上述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：1)将经活化增殖培养的益生菌菌液离心，得到益生菌菌泥；2)将步骤1)所述益生菌菌泥加入至含天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液中，混合均匀，得到菌悬液；所述益生菌菌泥与所述混合溶液的质量比为1:1-1:8；所述冻干保护剂在所述混合溶液中的质量百分比为2-20％；所述天然高分子材料在所述混合溶液中的质量百分比为0.5-5.0％；3)步骤2)的菌悬液在微滴发生装置形成微滴，固化液固化后，即得到益生菌微胶囊。在其中一些实施例中，还包括对所述益生菌微胶囊进行包衣30-90min的步骤，所述包衣液为体积百分含量为1.0-15.0％的尤特奇FS30D溶液，优选为体积百分含量为5.0-12.0％的尤特奇FS30D溶液。尤特奇FS30D是一种肠溶性的包衣材料，对抵抗胃酸环境有一定的效果。在其中一些实施例中，还包括冷冻干燥的步骤，具体步骤为：将所述益生菌微胶囊放入质量百分比为8.0-18.0％的冻干保护剂溶液中平衡30min后，再在-80℃下预冻1-6h，最后在-40℃下真空冷冻干燥18-36h。在其中一些实施例中，步骤2)中所述益生菌菌泥与所述水溶液的质量比为1:2-1:6。在其中一些实施例中，步骤3)中所述菌悬液经蠕动泵匀速供入微滴发生装置的高速旋转圆碟中，所述蠕动泵泵速为3～20ml·min-1，高速旋转圆碟转速为3000～10000rpm。在其中一些实施例中，步骤1)中，所述益生菌在MRS肉汤培养基中活化增殖，所述活化条件为35.0-38.0℃，22-26h；所述增殖培养中，接种比例为每100mL培养基中接种2.0-5.0mL菌种；步骤1)中，所述离心条件为20.0-37.0℃，3000-5000r/min离10-30min。在其中一些实施例中，步骤3)中所述固化液为0.1M-0.3M的CaCl2溶液，所述固化时间为15-60min。本发明还提供了上述益生菌微胶囊在制备保健食品、饮料食品、临床营养制剂、药物微制剂或化妆品中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明采用冻干保护剂与天然高分子材料作为壁材，通过控制冻干保护剂与天然高分子材料在混合溶液中的浓度，使得制备得到的益生菌微胶囊制剂具有较好的稳定性和耐酸性；冻干保护剂的浓度过低，则单体积溶液的冻干保护剂分子过少，菌体不能充分的包裹在冻干保护剂分子中，这样会达不到最佳的冻干存活率，浓度过高，其渗透压可能很大，对菌体造成不利的影响，而且，浓度过高也会造成工业成本的提高；而天然高分子材料的浓度过低，则会使得微胶囊在固化过程中成球性差，导致部分益生菌未包埋在微胶囊内部；浓度过高，则天然高分子材料溶液黏度增大，挤出过程可控性低；2、本发明通过调整益生菌菌泥与混合溶液的质量比，使得得到的微胶囊具有很好的性能；益生菌菌泥与混合溶液的比例中，如果混合溶液比例过低，会不足以完全包裹益生菌，使得活菌数偏低；如果比例过高，等量的菌分散在更多量的微胶囊当中，所以测得的每1.0g凝胶珠中益生菌的数量相比于低比例时就会偏低；3、本发明的益生菌微胶囊的处方简单，使用冻干保护剂以及天然高分子材料的混合材料作为本发明的益生菌微胶囊壁材，既可以在冷冻干燥过程中起到保护作用，又对益生菌的耐酸性和长期储存性有明显的改善，所制备的微胶囊粒径在100um以下可控且分布集中；4、本发明的益生菌微胶囊的制备方法，操作简便、工艺参数易控、生产效率高、经济易行，适合工业化规模生产。附图说明图1为本发明的制备方法所采用的设备示意图；图2为本发明实施例1中经冷冻干燥后，益生菌微胶囊的200倍扫描电镜图；图3为本发明实施例2中活化益生菌时所用培养基的pH值对嗜热链球菌冻干存活率的影响图；图4为本发明实施例3中海藻酸钠中G/M(海藻酸钠葡萄糖醛酸/海藻酸钠甘露糖醛酸)比例对嗜热链球菌活菌数的影响图；图5为本发明实施例4中益生菌微胶囊分别在4℃下储存0、7、14、30和60天后的活菌数图，其中●为本发明益生菌冻干粉存活率；■为本发明益生菌微胶囊存活率)；图6为本发明实施例4中益生菌微胶囊分别在25℃下储存0、7、14、30和60天后的活菌数变化图，其中●为本发明益生菌冻干粉存活率；■为本发明益生菌微胶囊存活率)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。本发明中的益生菌微胶囊以益生菌为芯材，益生菌选自保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌中的一种或几种；优选自长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热链球菌和乳酸乳球菌中的一种或几种。在本发明中，活菌数采用平板稀释法进行计数。本发明中，含有天然高分子材料和冻干保护剂的水溶液所用溶剂为无菌水，且MRS肉汤、混合溶液、壳聚糖溶液和CaCl2溶液都经过湿热灭菌，灭菌温度为121.0℃，灭菌时间为15min。本发明中的“冻干保护剂”是指可以在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护菌体抵抗低温损害的物质。其分类方法有多种：根据物质的种类可以分为糖类、多元醇类、聚合物类、氨基酸类、盐类等；根据渗透性可以分为高渗透性物质(如甘油、DMSO)、中渗透性物质(如葡萄糖、甘氨酸)和低渗透性物质(如可溶性淀粉、HPMC)等；根据分子量可以分为高分子物质和低分子物质。其中，海藻糖、右旋糖酐40、脱脂牛奶等具有非常优异的冻干保护作用。脱脂牛奶中的酪蛋白聚集在益生菌菌体的外周，在冷冻干燥的过程中，这种蛋白会抑制冰晶的形成，从而减少冰晶对菌体的损害，而且还能够在细胞表面形成保护层，减少细胞暴露在介质中的面积，起到保护作用。右旋糖酐能够聚集在嗜热链球菌周围，从而能够有利于细胞膜保持完整并能够起到平衡渗透压的作用，使得嗜热链球菌取得较高的冻干存活率。冷冻干燥过程中海藻糖可以在菌体内部聚集二糖尤其是海藻糖分子。这些海藻糖分子能够代替水分子通过氢键与细胞膜上的蛋白质连接从而保证膜在冻干过程中的完整性。实施例1益生菌微胶囊及其制备方法本实施例提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将乳酸乳球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养26h，再按体积比为5.0％的比例(即每100mL培养基中接种5mL菌种)接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在5.0℃、4000rpm下离心15min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取10.0g的右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸馏水中，搅拌溶解，再称取3g海藻酸钠粉末静置溶解在上述制备的右旋糖酐40溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀后，通过超微粒制备系统旋碟(见图1)形成液滴，在气流的作用下滴入0.3MCaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用；4)尤特奇FS30D包衣稀释尤特奇FS30D至12％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到尤特奇FS30D溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到尤特奇FS30D-右旋糖酐40-海藻酸钠微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为8.0％的右旋糖酐40溶液中，平衡30min，随后放到-80.0℃冰箱中预冻1h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥36h，得到本实施例的益生菌微胶囊制剂。检测发现，冷冻干燥后，本实施例的益生菌微胶囊制剂的活菌数达到了9.32×107CFU/g，而在缺少冻干保护剂的情况下，乳酸菌的冻干后活性为6.37×105CFU/g。说明乳酸乳球菌的存活率有较大的提高。采用扫描电镜观测微胶囊形态，可以看到在200倍视野下，微胶囊的形态及粒径均一，对益生菌有良好的包埋效果(图2)。实施例2益生菌微胶囊及其制备方法本实施例提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按体积比为4.0％的比例接种于MRS液体培养基中，即每100.0mL培养基中接种4.0mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在25.0℃、4000rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取15.0g乳糖加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解，再称取4.0g黄原胶粉末溶解在上述制备的乳糖溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀后，通过超微粒制备系统旋碟形成液滴，在气流的作用下滴入0.3MCaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用。4)尤特奇FS30D包衣稀释尤特奇FS30D至18％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到尤特奇FS30D溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到尤特奇FS30D-乳糖-黄原胶微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到质量百分浓度为15.0％的乳糖溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻6h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥18h，得到本实施例的益生菌微胶囊制剂。本实施例的益生菌微胶囊制剂的活菌数达到了3.11×108CFU/g，缺少冻干保护剂的情况下，冻干后活性为3.32×105CFU/g。观察在预冻时，不同pH的乳糖溶液对步骤2)制备得到的嗜热链球菌菌泥的活菌数影响，结果如图3所示。可见当冻干保护剂溶液——乳糖溶液的pH为6.5时，冷冻干燥后嗜热链球菌活菌数均保持在较高水平，达到9.00logCFU/mL。实施例3益生菌微胶囊及其制备方法本实施例提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将乳酸乳球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养26h，再按体积比为5.0％的比例接种于MRS液体培养基中，即每100.0mL培养基中接种5.0mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在0.0℃、5000rpm下离心10min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取5.0g甘油加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取4.0g海藻酸钠粉末溶解在上述制备的甘油溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为6:1的比例与菌泥混合均匀后，通过超微粒制备系统旋碟形成液滴，在气流的作用下滴入0.1MCaCl2溶液中，固化20min，洗涤过滤，备用。4)尤特奇FS30D包衣稀释尤特奇FS30D至10％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到尤特奇FS30D溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到尤特奇FS30D-甘油-海藻酸钠微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的甘油溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻6h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥18h，得到本实施例的益生菌微胶囊制剂。本实施例的益生菌微胶囊制剂的活菌数达到了6.35×106CFU/g，不添加冻干保护剂情况下，冻干后活性为7.57×104CFU/g，乳酸乳球菌存活率较高。观察海藻酸钠中G/M(海藻酸钠葡萄糖醛酸/海藻酸钠甘露糖醛酸)质量比对本实施例的益生菌微胶囊制剂的活菌数的影响，结果如图4所示。由图4可以看出，当G/M质量比分别为0.65、0.75和1.00时，冷冻干燥后的微胶囊的活菌数均有所下降，其中，当G/M质量比为1.00时，下降幅度较小。实施例4益生菌微胶囊及其制备方法本实施例提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养26h，再按体积比为5.0％的比例接种于MRS液体培养基中，即每100.0mL培养基中接种5.0mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在10.0℃、3000rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取10g的海藻糖加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取3.0g海藻酸钠粉末静置溶解在上述制备的海藻糖溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，静置溶解。放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀后，通过超微粒制备系统旋碟形成液滴，在气流的作用下滴入0.2MCaCl2溶液中，固化30min，洗涤过滤，备用。4)尤特奇FS30D包衣稀释尤特奇FS30D至12％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到尤特奇FS30D溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到尤特奇FS30D-海藻糖-海藻酸钠微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的海藻糖溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻6h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到本实施例的益生菌微胶囊制剂。本实施例的益生菌微胶囊制剂的活菌数达到了3.12×108CFU/g，而不含海藻糖的微胶囊动感后活性为6.31×106CFU/g，嗜热链球菌存活率有一定提高。将本实施例制备的益生菌微胶囊与益生菌冻干粉在4℃下分别储存0d、7d、14d、30d、60d后，检测益生菌活菌数，结果如图5所示。由检测结果可以看出，随着时间的延长，冻干粉和微胶囊中的活菌数都有下降，但壁材中包含海藻糖和海藻酸钠的微胶囊的稳定性更佳，活菌数下降并不明显。将本实施例制备的益生菌微胶囊与益生菌冻干粉在25℃下分别储存0d、7d、14d、30d、60d后，检测益生菌活菌数，结果如图6所示。由检测结果可以看出，冻干粉和微胶囊中的活菌数下降趋势与4℃下一致，只是幅度较大，而同样的，壁材中包含海藻糖和海藻酸钠的微胶囊的稳定性相比于冻干粉更佳，活菌数下降并不明显。可见无论温度为4.0℃还是25.0℃时，嗜热链球菌菌经过长时间的储存后，仍然能够保持较好的活菌数，活菌数达到7.28logCFU/g。说明储存后的益生菌微胶囊制剂具有良好的长期储存性。对比例1本对比例提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按体积比为5.0％的比例接种于MRS液体培养基中，即每100mL培养基中接种5mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在5.0℃、4000rpm下离心15min，弃去上清液，获得菌泥。3)芯材制备加入占有嗜热链球菌菌泥总重量的3％的脱脂奶粉，用高速均质机混匀后获得芯材。4)微胶囊的制备称取3g海藻酸钠溶于100.0mL的蒸馏水中，搅拌溶解，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为2:1的比例与芯材混合均匀，通过超微粒制备系统旋碟形成液滴，在气流的作用下滴入0.3MCaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用。5)明胶包衣称取5.0g明胶加入到100.0mL蒸馏水中，搅拌溶解后，再在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤4)所得物加入到明胶溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到明胶-海藻酸钠-脱脂奶粉微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊放到-80.0℃冰箱中预冻1h，再在-55.0℃下真空冷冻干燥36h，得到本对比例的明胶-海藻酸钠-脱脂奶粉微胶囊制剂。对比例2本对比例提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将乳酸乳球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养28h，再按体积比为5.0％的比例接种于MRS液体培养基中，即每100mL培养基中接种5mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)益生菌微胶囊的制备称取10g的海藻糖加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取6.0g海藻酸钠粉末静置溶解在上述制备的海藻糖溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，静置溶解。放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀后，通过超微粒制备系统旋碟形成液滴，在气流的作用下滴入0.2MCaCl2溶液中，固化30min，洗涤过滤，备用。3)结果因天然高分子浓度过高，导致混悬过于粘稠，经过超微粒制备系统旋碟后，无法形成规则的液滴，落入收集器中并固化的悬液大部分成膜，制备失败。对比例3本对比例提供一种益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将保加利亚乳杆菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养28h，再按体积比为5.0％的比例接种于MRS液体培养基中，即每100mL培养基中接种5mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)益生菌微胶囊的制备称取25g的海藻糖加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取3.0g海藻酸钠粉末静置溶解在上述制备的海藻糖溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，静置溶解。放置冷却后，按照质量比为6:1的比例与菌泥混合均匀后，通过超微粒制备系统旋碟形成液滴，在气流的作用下滴入0.3MCaCl2溶液中，固化30min，洗涤过滤，备用。3)包衣稀释尤特奇FS30D至12％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到尤特奇FS30D溶液中，磁力搅拌30min，洗涤过滤，得到尤特奇FS30D-海藻糖-海藻酸钠微胶囊。4)冷冻干燥将步骤3)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的海藻糖溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻4h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到本实施例的益生菌微胶囊制剂。本实施例的益生菌微胶囊制剂的活菌数为4.12×105CFU/g，而不含海藻糖的微胶囊冻干后活性为2.61×106CFU/g.保加利亚乳杆菌活菌数反而减少，这可能是由于过多的冻干保护剂的加入，稀释了每一个微胶囊中所含有的保加利亚乳杆菌，同时过多的海藻糖导致一些微胶囊无法成囊，因此含有冻干保护剂的微胶囊活菌数反而更少。试验例1对实施例1-4中制备的冻干后的含有冻干保护剂的微胶囊及对比例1～3的微胶囊分别进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中2h，再分离出微胶囊，洗涤后，测定活菌数，结果如表1所示。表1酸处理前后不同微胶囊中的活菌数对比由表1数据可以看出，在相同条件下，尤特奇FS30D-保护剂-天然高分子材料微胶囊在经过酸处理后，活菌数最低能够达到0.76×106CFU/g，说明本发明所提供的益生菌微胶囊冻干后依然能够保持优异的耐酸性能。根据试验例中的结果，可以看到实施例中酸处理后的微胶囊活性维持较好，下降的都维持在1个数量级以内。而虽然酸处理后对比例1中的微胶囊有106数量级，但是相对其原始活菌数，下降较多相比，而言结果有一定差异。对比例2中因为壁材的浓度过高，形成的微胶囊量极少，大部分在固化液中成膜，因此无法测定相应试验的结果。对比例3中的耐酸处理结果与对比例1中相似，但是由于原始活性过低，导致酸处理后的活性也偏低。试验例2将实施例1-4中制备的益生菌微胶囊制剂，冻干后使用马尔文粒径仪测定不同浓度的海藻酸钠微胶囊粒径。表2不同浓度的海藻酸钠微胶囊粒径实施例D10μmD50μmD90μm径距一致性119.07929.75044.3070.8480.279215.57729.20245.8291.0360.338317.03829.48746.2350.9900.325416.92829.28045.6560.9810.324对比例120.72531.703983.10530.3565.51对比例36.86336.035178.2874.7571.57由表2数据可以看出，本发明实施例1-4的益生菌微胶囊粒径可以保持在100μm以下，有利于微胶囊的广泛应用。对比例1中的微胶囊粒径D50虽然与实施例相近，但是其D90较大，说明所制备的微胶囊粒径不均一，一致性和径距都较大，结果与实施例相比不够理想。对比例2中因为壁材的浓度过高，形成的微胶囊量极少，大部分在固化液中成膜，因此无法测定相应试验的结果。对比例3中因为添加的冻干保护剂过多，一方面稀释了微胶囊，导致原始微胶囊活性偏低，另外未被包载的海藻糖会影响粒径测定的结果，从结果中可以看出其D10小于10μm，这可能是为被包载的海藻糖的粒径，同时该对比例中的径距和一致性都相对于实施例有一定的差距。因此体现本发明中的制备方法可以制备出粒径均一成型性较好的益生菌微胶囊。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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