本发明涉及动物营养与饲料技术领域，具体涉及一种含抗菌肽的保育后期用仔猪配合饲料及其制备方法，该饲料适合仔猪断奶一个月后开始饲喂。
背景技术：
自然界中断奶一般发生在仔猪3月龄左右。实际生产中，为了提高母猪的生产力和分娩舍的利用率、减少母体向仔猪垂直传播，猪场通常选择在仔猪3周龄左右断奶。然而，此时仔猪消化系统尚未发育完善，胃酸分泌不足、消化器官体积和重量都比较小、各种消化酶活性较低。此外，早期断奶仔猪尚未建立稳定的肠道微生物区系，菌群种类和数量易变化。未消化的营养物质进入后肠，可作为后肠微生物增殖的营养物质，从而促进微生物的大量繁殖，导致肠道微生态紊乱，最终导致仔猪腹泻和疾病频发。
过去人们一直认为，在动物日粮中添加低水平抗生素是预防疾病、提高动物胃肠道健康的有效措施，进而可以提高饲料转化率及促进生长。然而动物饲料中长期大量使用抗生素，不仅会增加病原微生物耐药性，还会造成动物肠道菌群紊乱、肠道屏障功能减弱、影响肠道的稳态从而破坏机体的先天免疫，最终降低动物生产性能。研究表明，常规性地杀死较弱的细菌，可导致较强的细菌存活下来并大肆增殖，产生人类无法控制的“超级细菌”。更为严重的是，动物饲料中长期大量添加抗生素，导致抗生素残留增多、经由食品增加人类抗生素耐药性，严重威胁人类健康并污染环境。故此，世界上许多发达国家都已经开始严格限制使用抗生素并提高畜产品检测标准，研发高效新型抗生素替代品具有重要的科学意义和社会价值。抗菌肽(Antibacterial Peptides)，又叫抗微生物肽(Antimicrobial Peptides)或宿主防御肽(Host Defense Peptides)，是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。由于抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等广泛的抑制作用，而且不易产生耐药性，是众多替代抗生素产品中的佼佼者，具有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种含抗菌肽的保育仔猪配合饲料及其制备方法，解决为提高断奶仔猪生产性能而大量添加抗生素的问题，进而保证猪肉食品安全和人类健康。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述含抗菌肽的保育后期用仔猪配合饲料包括如下重量份的组分：
玉米58-61份、豆粕14-16份、进口DDGS8-12、发酵豆粕5-8份、葡萄糖2-4份、进口鱼粉1.8-5份、石粉0.8-1.0份、磷酸氢钙0.4-0.8份、赖氨酸0.15-0.2份、食盐0.1-0.4份、复合微量元素预混料0.15-0.2份、米糠0.10-0.15份、蛋氨酸0.08-0.10份、苏氨酸0.05-0.10份、胆碱0.03-0.10份、复合多维预混料0.02-0.05份、抗氧化剂0.02-0.05份、天蚕素抗菌肽0.01-0.03份、菌丝霉素抗菌肽0.01-0.03份、植物精油复合物0.02-0.05份。
上述抗菌肽饲料的配制方法包括如下步骤：
(1)将玉米、豆粕、发酵豆粕、进口DDGS、进口鱼粉、葡萄糖、米糠分别粉碎，制备目标粒径1000μm的各种粉体，控制粉体的平均粒径为930—1000μm即为合格。适宜的粉碎粒度可显著提高饲料的转化率，减少动物粪便排泄量，提高动物的生产性能。通过粒度检验，保证饲料颗粒的均匀，促进仔猪消化。其余原料因其本身粒度已经小于1000μm，无需粉碎。
(2)按权利要求1所述的比例分别称量大宗原料和小料，大宗原料为玉米、豆粕、发酵豆粕、进口DDGS、进口鱼粉、葡萄糖，其余为小料；
(3)将称量好的大宗原料和小料混合，即得含抗菌肽的保育后期用仔猪配合饲料。
下面对本发明作进一步说明：
抗菌肽又称抗微生物肽，是可以被细菌、植物、昆虫、两栖动物、哺乳动物等天然产生，并且具有天然免疫反应的生物活性分子，通过入侵病原微生物发挥细胞宿主防御作用。抗菌肽具有广谱抗菌活性、低毒和低耐药性，同时作为高等生物免疫调节剂被认为是一种未来具有前途和潜在的候选药物，属于环保型抗生素。
天蚕素是世界上第一个被发现的抗菌肽，瑞典科学家于1981年用蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)诱导惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)产生了抗菌活性多肽物质，定名为Cecropin。本发明所应用的天蚕素抗菌肽具有广谱抑菌作用，但是主要对革兰氏阴性菌起作用，它具有如下结构特征：(1)由31-39个氨基酸残基组成，分子量约为4KD，不含半胱氨酸，不能形成分子内二硫键。这种简单的肽链结构便于进行化学合成或者基因工程表达，并保证产品稳定性。(2)有强碱性的N端，N末端区域富含亲水碱性氨基酸残基，可形成近乎完美的双亲螺旋结构,这将有利于天蚕素吸附到带负电的细菌膜上。(3)C末端含较多的疏水性氨基酸残基，可形成疏水螺旋，疏水性的尾部有利于抗菌肽插入细菌膜的双层脂质膜中。且其C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。(4)分子的两端各形成一个两亲性α螺旋，这种α螺旋是破坏、裂解细菌的主要结构。
菌丝霉素(Plectasin)是Mygind等研究小组于2005年通过筛查腐生子囊菌假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)分泌蛋白的cDNA库，从中找出一些与无脊椎动物防御素序列高度相似的片段，并筛选分离出来的首例真菌防御素。它具有如下结构特征：(1)菌丝霉素是一类内源性、高度稳定、富含半胱氨酸的抗菌肽，其序列内一般有6-8个保守半胱氨酸形成3-4对二硫键。二硫键对数和连接方式在维持防御素结构和抗菌功能方面具有重要作用，本发明所用菌丝霉素通过分子改造技术形成链内二硫键来稳定其2条反向平行的β折叠片和1个α螺旋从而提高抑菌活性、增强稳定性。(2)菌丝霉素具有良好的盐离子耐受能力，在生理盐离子浓度下同样具有杀菌活性。(3)此外，它还具有良好的pH值稳定性和热稳定性，在pH值2.0-10.0范围内，菌丝霉素对金黄色葡萄球菌均有抑菌活性；100℃热处理1h后，亦能抵抗木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的降解。(4)菌丝霉素与细胞壁前体物脂质II结合，导致细胞壁合成紊乱，破坏了细胞壁的完整结构，形成孔洞，内容物泄漏，整个细胞裂解死亡。体外实验研究报道，菌丝霉素主要对G+(革兰氏阳性菌)的几个种类(包括链球菌属、葡萄状球菌属、肠球菌属、棒状杆菌属和杆状菌属)具有良好杀伤作用，尤其对肺炎链球菌(S.pneumoniae)的MIC仅为0.125mg/l，与万古霉素和青霉素的杀菌速率相当。
植物提取物是以植物为原料，经过一系列物理、化学提取过程，得到的由一种或多种天然活性成分组成的植物产品。植物提取物在历史上一直作为人类的药物或营养补充剂大量使用，有数千年历史。近年来，植物提取物在养猪生产中替代抗生素方面的研究取得了良好效果。植物提取物中含有丰富的生物活性物质，包括麝香草酚、香芹酚、肉桂醛等，这些物质通过抑制有害微生物、调节免疫、抗氧化和调节代谢等作用促进猪的健康和生长。体外研究表明，植物提取物对于包括霉菌在内的多种病原菌具有抗菌作用,其主要抗菌的活性物质为酚醛化合物。
酚类物质如百里香酚、香芹酚、麝香草酚，这些含有酚类结构的成分都表现出较强的抗菌作用。酚类物质的抗菌性受其自身的构型和所含功能团的影响，其中羟基基团的作用很大，其数量和在酚环上的相对位置会影响酚类物质的抗菌性能，百里酚和香芹酚对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果不同，并且酚环上含有烷基或醋酸根都会增强酚类物质的抗菌活性，这些功能团可通过对琉基的氧化使蛋白质失活；与含琉基的化合物如肤氨酸发生竞争抑制或是直接抑制某些酶的正常生理机能,使病原菌代谢紊乱，新陈代谢得到抑制，最终达到抗菌目的。另外，植物提取物利用自身疏水性使细胞膜和线粒体上的磷脂结构分开，破坏细胞结构，增强细胞膜通透性，导致细胞内离子和其它物质的泄漏，最终导致细菌的死亡。
体外模拟小肠环境研究发现，4种植物添加剂对肠道大肠杆菌的抗菌性依次为：肉桂＞香芹酚＞麝香草酚＞丁香酚。肉桂醛具有易挥发、易氧化的特性，不易进行保藏。将肉桂醛与其他物质结合，能够较易保存并增强抑菌效果。此外，体外抑菌实验表明，肉桂醛对黄曲霉、烟曲霉和黑曲霉等都具有抑菌作用。肉桂醛对病原菌主要表现在提高宿主的防御性，抑制分生孢子萌发和形成，致使分生孢子发生消解，导致菌丝体形态产生异常，长时间干扰菌体生长。
制备方法的标准和详细步骤如下：
(1)原料采购、验收和检验：首先对配方所需各种原料制定原料采购标准，规定各营养指标的参数范围；其次，货比三家选择有良好资质的供货商进行原料质量和价格的综合比较，再决定是否采购；然后，根据饲料原料采购标准，对采购的原料进行快速表观检验和实验室化学分析，快速表观检验合格的可以接收，不合格则拒收；表观检验合格的原料，继续进行实验室化学分析，合格的入库，不合格的退货。通过这一程序，严格控制原料质量。
(2)粉碎及粉碎粒度检验：将玉米、豆粕、发酵豆粕、进口DDGS、进口鱼粉、葡萄糖、米糠分别使用锤片式粉碎机进行粉碎，制备目标粒径1000μm的各种粉体。粉碎后，用光学显微镜做粗略检测，使所得到的粒径基本接近目标粒径。然后用激光粒度分析仪(NICOMPTM380型，美国)测定各种原料的平均粒径，平均粒径在930-1000μm即为合格。适宜的粉碎粒度可显著提高饲料的转化率，减少动物粪便排泄量，提高动物的生产性能。通过粒度检验，保证饲料颗粒的均匀，促进仔猪消化。其余原料因其本身粒度已经小于1000μm，无需粉碎。
(3)大宗原料的称量：称量工序一般包括两个部分：一是预混料等添加量较小的原料称量，二是大宗原料的称量。为追求配料精度、节省人力，大宗原料通常采用自动称量。按照重量组分，玉米、豆粕、发酵豆粕、进口DDGS、进口鱼粉、葡萄糖这些大宗原料使用最小分度值0.10kg的自动称量装置进行称量。
(4)小料的称量：小料由于添加量小、品种多、易结块、易粘仓、易发生化学反应等原因，仍然采用手工称量方式。按照重量组分，磷酸氢钙、石粉、食盐、米糠、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、胆碱、微量元素预混料、维生素预混料、抗氧化剂、抗菌肽和植物精油复合物等添加量低的小料使用最小分度值0.01kg的电子秤手动称量。
(5)混合：将称量好的小料和大宗原料在混合机内混合10min。粉碎粒度越均匀，混合时间越长，均匀度越好。要求配合饲料混合均匀度变异系数≤10％。参照GB/T 5918-2008饲料产品混合均匀度的测定，每半年进行一次混合均匀度检验。
(6)打包：混合均匀后的饲料，由自动打包机完成称重、装袋、封包。产品包装为20kg/袋。
(7)配料精度要求控制在0.1％之内。举例来说，如果混合机容量是1000kg，那么设计配制1000kg饲料，配料完成后最终配料量合格范围是999-1001kg。
本发明的抗菌肽饲料可以达到和抗生素组同样的生长性能，并对仔猪的代谢、机体组织蛋白沉积和免疫功能没有任何影响。这对保证仔猪生长和肠道健康，保障人类食品安全具有重要的经济价值和社会价值。
具体实施方式
实施例1
玉米58份、豆粕14份、进口DDGS8份、发酵豆粕8份、葡萄糖4份、进口鱼粉5份、石粉1份、磷酸氢钙0.8份、赖氨酸0.15份、食盐0.4份、米糠0.15份、复合微量元素预混料0.15份、蛋氨酸0.1份、苏氨酸0.05份、胆碱0.03份、复合多维预混料0.05份、抗氧化剂0.05份、菌丝霉素抗菌肽0.01份、天蚕素抗菌肽0.01份、植物精油复合物0.05份。
上述抗菌肽饲料的配制方法包括如下步骤：
(1)原料采购、验收和检验：首先对配方所需各种原料参照原料采购标准进行采购；原料送货后表观检验合格的接收，不合格的拒收；化学分析合格的入库，不合格的退货。
(2)粉碎及粉碎粒度检验：将玉米、豆粕、发酵豆粕、进口DDGS、进口鱼粉、葡萄糖、米糠分别使用锤片式粉碎机进行粉碎，制备目标粒径1000μm的各种粉体。粉碎后，用光学显微镜做粗略检测，使所得到的粒径基本接近目标粒径。然后用激光粒度分析仪(NICOMPTM380型，美国)测定各种原料的平均粒径，平均粒径在930-1000μm即为合格。
(3)大宗原料的称量：使用最小分度值0.10kg的自动称量装置,按照重量组分，称量玉米58份、豆粕14份、发酵豆粕8份、进口DDGS8份、进口鱼粉5份、葡萄糖4份、石粉1份。
(4)小料的称量：按照重量组分，使用最小分度值0.01kg的电子秤手动称量磷酸氢钙0.8份、赖氨酸0.15份、食盐0.4份、米糠0.15份、复合微量元素预混料0.15份、蛋氨酸0.1份、苏氨酸0.05份、胆碱0.03份、复合多维预混料0.05份、抗氧化剂0.05份、菌丝霉素抗菌肽0.01份、天蚕素抗菌肽0.01份、植物精油复合物0.05份。
(5)混合：将称量好的大宗原料和小料在混合机内混合10mim。
(6)打包：混合均匀后的饲料，由自动打包机完成称重、装袋、封包。产品包装按20kg/袋。
(7)配料精度要求控制在0.1％之内。举例来说，如果配制100份的饲料，那么配料完成后最终配料量合格范围应为99-101份。
实施例2
玉米61份、豆粕16份、进口DDGS12份、发酵豆粕5份、葡萄糖2份、进口鱼粉1.8份、石粉0.8份、磷酸氢钙0.4份、赖氨酸0.2份、食盐0.1份、复合微量元素0.2份、米糠0.1份、蛋氨酸0.08份、苏氨酸0.1份、胆碱0.1份、复合多维0.02份、抗氧化剂0.02份、菌丝霉素抗菌肽0.03份、天蚕素抗菌肽0.03份、植物精油复合物0.02份。
上述抗菌肽饲料的配制方法包括如下步骤：
(1)原料采购、验收和检验：首先对配方所需各种原料参照原料采购标准进行采购；原料送货后表观检验合格的接收，不合格的拒收；化学分析合格的入库，不合格的退货。
(2)粉碎及粉碎粒度检验：将玉米、豆粕、发酵豆粕、进口DDGS、进口鱼粉、葡萄糖、米糠分别使用锤片式粉碎机进行粉碎，制备目标粒径1000μm的各种粉体。粉碎后，用光学显微镜做粗略检测，使所得到的粒径基本接近目标粒径。然后用激光粒度分析仪(NICOMPTM380型，美国)测定各种原料的平均粒径，平均粒径在930-1000μm即为合格。
(3)大宗原料的称量：使用最小分度值0.10kg的自动称量装置,按照重量组分，称量玉米61份、豆粕16份、进口DDGS12份、发酵豆粕5份、葡萄糖2份、进口鱼粉1.8份。
(4)小料的称量：按照重量组分，使用最小分度值0.01kg的电子秤手动称量石粉0.8份、磷酸氢钙0.4份、赖氨酸0.2份、食盐0.1份、米糠0.1份、复合微量元素0.2份、蛋氨酸0.08份、苏氨酸0.1份、胆碱0.1份、复合多维0.02份、抗氧化剂0.02份、菌丝霉素抗菌肽0.03份、天蚕素抗菌肽0.03份、植物精油复合物0.02份。
(5)混合：将称量好的大宗原料和小料在混合机内混合10mim。
(6)打包：混合均匀后的饲料，由自动打包机完成称重、装袋、封包。产品包装按20kg/袋。
(7)配料精度要求控制在0.1％之内。举例来说，如果配制100份的饲料，那么配料完成后最终配料量合格范围应为99-101份。
实验地点：中国科学院亚热带农业生态研究所(湖南省长沙市)
实验时间：2016年8月-2016年9月
动物实验设计(见表1)：选用体况健康良好、体重大小接近、已经断奶一个月左右的“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪42头，平均体重为17.34kg左右，公母各半随机分成3个组，无抗生素组14个重复、抗生素组14个重复、替代抗生素组14个重复，采用单栏饲喂，每个重复1头猪。无抗生素组为负对照组，饲喂基础日粮没有添加任何抗生素；抗生素组为正对照组，饲喂基础日粮+抗生素；替代抗生素组为实验组，饲喂基础日粮+抗菌肽和植物精油提取物。试验全期14d。
表1
试验猪只日常护理：按照猪场规定免疫和驱虫。试验在全封闭猪舍内进行，仔猪饲养于半漏缝地扳上，控制温度28-30℃，自由采食和饮水，每天喂4次(时间分别为7:30、11:30、15:30和19:30)，每次饲喂前观察饲槽中有无余料进行适当调整以保障其自由采食，自由饮水。试验期内每天上午、下午各打扫圈舍1次。
测定指标及方法
生长性能的测定
两个阶段分别在开始和结束期以重复为单位进行称重，并统计饲料消耗量，计算平均日采食量、平均日增重和料重比以及腹泻率和腹泻指数。
平均日采食量：从试验期开始，记录各个处理组每天的饲料消耗量及猪的头数，到试验结束时计算：平均日采食量＝每天采食量*实验猪头数/实验天数；平均日增重:从试验期开始，记录每头猪的初始体重并记录猪只数，求出平均始重；试验结束时每头猪称重并计算出平均末重，(末期体重-初始体重)/(试验猪头数*天数＝平均日增重。料重比＝平均日采食量/平均日增重。
腹泻率：实验期内，记录每处理组每天的仔猪腹泻头次数和腹泻分数，计算仔猪腹泻率，公式为：腹泻率＝试验期内所有仔猪腹泻头次数/(试验的天数×试验猪只头数)×100％；腹泻指数＝试验期内所有仔猪腹泻评分之和/(试验的天数×试验猪只头数)。腹泻评分标准见表2，生长性能和腹泻情况结果见表3：
表2
表3
饲养实验结果表明：保育仔猪末期平均体重实验组略高于正对照组，说明使用抗菌肽替代抗生素不影响仔猪生长性能，可以达到和添加抗生素一样的生长水平；从料肉比来看，实验组也获得了较好的饲料报酬，这进一步肯定了替代抗生素处理组的方案完全可行。保育仔猪腹泻率和腹泻指数，正对照组低于负对照组说明添加抗生素能够有效抑制仔猪腹泻，而实验组仔猪腹泻率和腹泻指数略高于正负对照组，说明替代抗生素的研究仍有一定进步空间。血清生化指标、免疫指标等测定结果见表4：
表4:
正常情况下,动物血糖浓度相对恒定。血糖是动物机体主要的能量来源,动物机体主要通过肠道吸收获取葡萄糖。血糖含量能在一定程度上反映动物机体糖代谢功能是否正常。血清总蛋白的主要作用是参与营养物质的转运、保持组织蛋白的动态平衡、维持血液的pH值等。血清总蛋白的浓度能有效地反映机体蛋白质合成代谢的强弱,血清总蛋白浓度升高说明机体向组织蛋白沉积的方向进行,能促进组织器官的生长和发育。免疫球蛋白主要存在于血清中,它能与外来的特异性抗原起免疫反应而保护机体。免疫球蛋白IgG和IgM是血液中主要的一类抗体,免疫球蛋白IgG和IgM含量的高低可在一定程度上反映动物的免疫性能。生长激素的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长；促进机体合成代谢和蛋白质合成；促进脂肪分解。胰岛素样生长因子-1是一类多功能细胞增殖调控因子。在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。本实验，保育仔猪血清中葡萄糖含量、总蛋白含量、血清IgG、IgA和IgM含量、生长激素含量及胰岛素样生长因子-含量，各组基本在同一范围，说明饲料中添加抗菌肽和植物精油提取物替代抗生素对保育仔猪的代谢、机体组织蛋白沉积和免疫功能没有影响。
从以上实验结果可以看出，与抗生素组比较，保育仔猪日粮中添加抗菌肽和植物精油提取物替代抗生素，可以获得略高于抗生素组的体重和更好的饲料报酬、对腹泻率和腹泻指数无显著影响，对仔猪的代谢、机体组织蛋白沉积和免疫功能也没有影响。抗菌肽和植物精油提取物替代抗生素是可行的。