本发明涉及一种降脂红曲粉的制备方法，属于生物发酵技术领域。
背景技术：
红曲作为中国传统的食品和药材，其生产和应用已有上千年历史，建安七子之首王粲所著《七释》中便有关于红曲的内容，而《天工开物》、《本草纲目》中关于红曲的制造和功效的详细记载，则证实了明代以来，红曲的生产和应用已比较普遍。目前我国红曲主要应用于食品色素、红曲酒酿造、红曲食醋、发酵食品(红曲腐乳、酱油、红曲糟制品)、保健食品、中药材等。
近几十年来各国科学家运用现代科技手段，发现了红曲中的各种代谢产物，1979年，日本学者远藤章(endo)等人从泰国食品中分离的红曲霉monascusruber的发酵液中分离出一种具有更强的胆固醇合成抑制活性的化合物并用红曲的拉丁名monascus的字根命名为monacolink，从而引起世界关注。但遗憾的是对monacolink的结构鉴定中未包含立体化学的工作，一年以后美国merck公司的albert等人报导了从土曲霉aspergillusterreus发酵液中分离出同一种化合物命名为mevinolin，在对它的结构鉴定中包括了立体化学结构，并开始进行新药研究，随后merck公司将mevinolin开发成为第一个他汀类上市新药命名为lovastatin，并申请了专利。1985年美国科学家goldstein和brown进一步找出了monacolink通过竞争性抑制还原酶hmg-coa来抑制胆固醇合成的作用机理，并因此获得诺贝尔奖。由此可知：monacolink(莫拉可林)与lovastatin(洛伐他汀)是同一化合物。
后来经研究发现，红曲中monacolink是两种同分异构体，内脂式monacolink和酸式monacolink，一般分别简称为闭环和开环monacolink。闭环的monacolink只是一种前体药物，它本身无活性，需经人体产生的羧基酯酶水解改变结构，变成有活性的物质开环的monacolink，才能发挥降脂作用。另外，药理研究表明，在洛伐他汀等计量的情况下，红曲的降脂效果比洛伐他汀化学药品更好，并且没有副作用，说明红曲中应该还存在着具有调节血脂效果的其他活性物质。有文献报道，从降脂红曲中分离出降脂成份的植物甾醇(豆甾醇)，因此洛伐他汀并非红曲降脂功能的唯一成分。
1995年法国blanca教授证实某些红曲株产生毒性物质桔青霉素(桔霉素、桔霉素)；桔霉素(citrinin)是一种真菌毒素，具有肾脏毒性(也称为肾毒素)，可引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。由于桔霉素具有肾毒素和潜在的致畸性，会对人体产生一定的潜在危害，所以红曲安全性问题引起了全世界的广泛关注。
日本率先制定出红曲色素中桔青霉素的国家限定标准，最大限量为0.2mg/kg；美国食品药品管理局明确提出，对红曲色素中含有的桔霉素进行安全性评价，合格后方可作为食品添加剂使用。2014年3月6日，欧盟发布(eu)no212/2014号法规，修订了(ec)no1881/2006号法规中关于食品中污染物桔霉素在红曲霉发酵大米食品补充剂中最大限量值2000ug/kg。我国关于红曲产品的标准中，并没有全部规定桔霉素的限量，目前只有gb1886.66-2015红曲黄色素(≤1.0mg/kg)和qbt2847-2007功能性红曲米(粉)(≤50ug/kg)标明限量。
由于红曲产品所引发的安全性问题，其产品的推广受到制约。因此，选育安全、低产桔霉素的菌株，或利用现代微生物生物技术，有目的地构建或改造现有红曲菌株，或优化培养条件以控制桔霉素的含量是企业的首要任务。
专利cn103468585b公开了一株降脂红曲菌株，其不具备合成桔霉素能力，鉴定为丛毛红曲菌(m.pilosus)。cn1065432c公开了十九个红曲菌菌种，以及其发酵制备的降脂红曲；cn1373208a公开了高产洛伐他汀的红曲霉变异株及其应用，应用制剂含洛伐他汀15-20mg/g；cn1448503公开了一种无桔霉素高色价功能红曲粉的制备，含莫拉可林k4-12mg/g，其中开环结构的莫拉可林k的比例70-90％，产品不含毒性物质桔霉素；cn1908156b公开红曲新菌株具有高洛伐他汀产率、含有开环结构，多不饱和脂肪酸含量高，不产、极低产桔霉素。
综上所述，除了高产莫拉可林k以外，还没有同时产生降脂活性物质植物甾醇，且几乎不含桔霉素的红曲霉菌株的报道。
另外，目前降脂红曲多采用固态发酵法生产，专利cn105349438中功能红曲制备方法包括浸米、沥干、蒸米等步骤，cn102406127中降脂红曲的制备方法包括浸米、洗米、蒸煮装袋、培养过程喷水管理等，其缺点是：人工繁杂，效率低，周期长。
技术实现要素：
本发明根据现有技术的不足公开了一种降脂红曲粉的制备方法，该方法效率高、成本低、周期短，得到的降脂红曲粉同时含有莫拉可林k和植物甾醇两种降脂成份，且桔霉素含量符合安全标准。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，菌株编号5046紫色红曲(monascuspurpureus)。其微生物学特征为：在麦芽汁琼脂培养基上，菌丝初生白色，后逐渐变成浅红色，气生菌丝厚，质地毡绒毛状，边缘整齐，背面有皱褶呈暗红褐色；菌丝不规律分枝，透明，有横隔，宽度3-8μm；孢子囊呈倒梨形或球形，着生在菌丝顶端或侧枝顶端，分生孢子单生或链生，直径7-20μm。
一种降脂红曲粉制备方法，包括以下步骤：
(1)液体种子制备
按下列配方制备培养基，甘油3-6％，米粉4-8％，牛肉膏0.3-0.8％，蛋白胨1％，硝酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.15％，用乳酸调ph至3.5-5，灭菌，种子液摇瓶，无菌接种(接2厘米见方菌块)，置于30-34℃，180-250rpm条件下培养40-48h，得红曲摇瓶种子液；
(2)固体发酵培养基
以籼稻脱壳后的糙米为原料，先经过粗粉碎至5-20目，得糙米粗粉，以糙米粗粉为100％基准，先称量糙米粉和占其重量5-10％的黄豆粉混合拌匀得到混合物a，糖蜜5-7％，甘油3-5％，蛋白胨3-5％，玉米浆1-2％，磷酸氢二钾0.2％，称量混合得到混合物b，向混合物b中加入20-40％的蒸馏水溶解，用乳酸调ph至3.5-6.5，制成营养液，最后混合物a与营养液掺匀，灭菌后趁热打散，冷却；
(3)发酵培养
按接种量8-20％(优选接种量12-18％)，向固体发酵培养基中接入红曲摇瓶种子液，搅拌均匀后，第一阶段培养：28-34℃，55-85％rh培养2-3天，每24h摇瓶一次使发酵均匀；第二阶段：降温至20-26℃，静止发酵培养至结束。
(4)干燥、粉碎
发酵结束后，使用闪蒸干燥机快速烘干，进风温度95-110℃，出风温度40-55℃，干燥过程保证干燥室温度在60℃以下，然后粉碎、过筛、混合得降脂红曲粉。
通常半小时就能烘干得到干料100kg左右，烘干后得到的物料水分在10％以下。
步骤3)所述的培养时间为15-18天。
上述步骤1)和步骤2)所述的灭菌条件优选为121℃0.1mpa灭菌30min。
本发明有益的效果：
1、本发明首次使用脱壳糙米和糖蜜为原料，成本较低；糙米更易被利用，使发酵周期缩短，减少一般工艺需浸米、蒸米、喷水过程的工作量；加上使用闪蒸干燥机低温短时干燥物料，减少活性物质的破坏。可大幅提高生产效率。
2、本发明中使用糙米粗粉后，糙米的外果(种)皮可以起到疏松、保湿作用，可使发酵后期不需要人工摇瓶和喷水，减少工作量和染菌风险。以粗粉后的糙米为原料，不仅提高红曲中降血脂成份莫拉可林k的含量，同时带来另一种降脂成份植物甾醇的积累。
3、通过本发明的发酵培养方法，本发明得到的降脂红曲粉，同时含有莫拉可林k和植物甾醇两种降脂成份。在发酵培养18天时，莫拉可林k的含量可高达15.9mg/g，植物甾醇的含量可高达11.3mg/g，且桔霉素含量符合安全标准。
本发明的降脂红曲粉具有制备工艺简单，成本低廉、生产效率高的优点，且降脂活性物质更多，成份明确，非常适宜用做降脂功能保健产品的原料。
具体实施方式：
以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应
理解为对本发明总的技术方案的限定。
菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，菌株编号5046紫色红曲(monascuspurpureus)。
实施例1
(1)摇瓶种子制备
按下列配方制备培养基，甘油3％，米粉5％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，硝酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.15％，用乳酸调ph至4.0，种子液分装100/500ml摇瓶，121℃0.1mpa灭菌30min，无菌接种(接2厘米见方菌块)，置于32℃，220rpm条件下培养48h，得红曲摇瓶种子液。
(2)固体培养基配制
以籼稻脱壳后的糙米为原料，先经过粗粉碎至10-20目，得糙米粗粉。以糙米粗粉重量为100％基准，添加黄豆粉5％，混合拌匀得到混合物a，再称量糖蜜5％，甘油5％，蛋白胨3％，玉米浆2％，磷酸氢二钾0.2％(均以糙米粗粉为100％基准)，混合得到混合物b，向混合物b中加入混合物b重量的25％蒸馏水溶解，用乳酸调ph至4.5，制成营养液，最后将营养液与混合物a搅拌掺匀。量取200g分装至1000ml三角瓶灭菌，121℃，0.1mpa，30min，趁热打散，冷却待用。
(3)发酵培养
按接种量18％，向固体培养基中接入红曲摇瓶种子液，搅拌均匀后，第一阶段培养：32℃，65％rh培养3天，每24h摇瓶一次使发酵均匀；第二阶段：降温至23℃，静止发酵培养15天结束。
(4)干燥、粉碎
发酵结束后，混合所有发酵好的降脂红曲，使用闪蒸干燥机快速烘干，进风温度95-110℃，出风温度40-55℃，干燥过程保证干燥室温度在60℃以下，烘干料水分控制在10％以下，通常半小时就能烘干得到干料100kg左右。然后粉碎、过筛、混合得降脂红曲粉。
红曲粉成品指标含量：莫拉可林k15.3mg/g，植物甾醇10.8mg/g，桔霉素未检出。检测方法依据《qbt2847-2007功能性红曲米(粉)》附录a、b。
实施例2
(1)摇瓶种子制备
按下列配方制备培养基，甘油4％，米粉5％，牛肉膏0.6％，蛋白胨1％，硝酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.15％，用乳酸调ph至4.0，种子液分装100/500ml摇瓶，121℃0.1mpa灭菌30min，无菌接种(接2厘米见方菌块)，置于30℃，200rpm条件下培养45h，得红曲摇瓶种子液。
(2)固体培养基配制
以籼稻脱壳后的糙米为原料，先经过粗粉碎至10-20目，得糙米粗粉。以糙米粗粉为100％基准，添加黄豆粉8％，混合拌匀得到混合物a，再称量糖蜜5％，甘油5％，蛋白胨4％，玉米浆1％，磷酸氢二钾0.2％，混合得到混合物b，向混合物b中加入混合物b重量的30％蒸馏水溶解，用乳酸调ph至4.1，制成营养液，最后将营养液与混合物a搅拌掺匀。量取200g分装至1000ml三角瓶灭菌，121℃，0.1mpa，30min，趁热打散，冷却待用。
(3)发酵培养
按接种量15％，向固体培养基中接入红曲摇瓶种子液，搅拌均匀后，第一阶段培养：30℃，70％rh培养3天，每24h摇瓶一次使发酵均匀；第二阶段：降温至25℃，静止发酵培养至15天结束。
(4)干燥、粉碎
发酵结束后，混合所有发酵好的降脂红曲，使用闪蒸干燥机快速烘干，进风温度95-110℃，出风温度40-55℃，干燥过程保证干燥室温度在60℃以下，烘干料水分控制在10％以下，通常半小时烘干得到干料100kg左右。然后粉碎、过筛、混合得降脂红曲粉。
红曲粉成品指标含量：莫拉可林k15.9mg/g，植物甾醇11.3mg/g，桔霉素未检出。检测方法依据《qbt2847-2007功能性红曲米(粉)》附录a、b。
实施例3
(1)摇瓶种子制备
按下列配方制备培养基，甘油5％，米粉5％，牛肉膏0.4％，蛋白胨1％，硝酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.15％(以水重量为100％计)，用乳酸调ph至4.5，种子液分装100/500ml摇瓶，121℃0.1mpa灭菌30min，无菌接种(接2厘米见方菌块)，置于33℃，220rpm条件下培养42h，得红曲摇瓶种子液。
(2)固体培养基配制
以籼稻脱壳后的糙米为原料，先经过粗粉碎至10-20目，得糙米粗粉。以糙米粗粉为100％基准，添加黄豆粉10％，混合拌匀得到混合物a，再称量糖蜜5％，甘油4％，蛋白胨3％，玉米浆2％，磷酸氢二钾0.2％，混合得到混合物b，向混合物b中加入混合物b重量的35％蒸馏水溶解，用乳酸调ph至4.6，制成营养液，最后将营养液与混合物a搅拌掺匀。量取230g分装至1000ml三角瓶灭菌，121℃，0.1mpa，30min，趁热打散，冷却待用。
(3)发酵培养
按接种量12％，向固体培养基中接入红曲摇瓶种子液，搅拌均匀后，第一阶段培养：34℃，75％rh培养3天，每24h摇瓶一次使发酵均匀；第二阶段：降温至22℃，静止发酵培养至15天结束。
(4)干燥、粉碎
发酵结束后，混合所有发酵好的降脂红曲，使用闪蒸干燥机快速烘干，进风温度95-110℃，出风温度40-55℃，干燥过程保证干燥室温度在60℃以下，烘干料水分控制在10％以下。然后粉碎、过筛、混合得降脂红曲粉。
红曲粉成品指标含量：莫拉可林k14.6mg/g，植物甾醇10.2mg/g，桔霉素未检出。检测方法依据《qbt2847-2007功能性红曲米(粉)》附录a、b。