本发明属于青贮饲料技术领域，具体涉及一种专用于狼尾草的青贮添加剂。
背景技术：
狼尾草（chinesepennisetum）为多年生禾本科牧草，具有产量高、耐刈割、适口性好等特点，是草食家畜的优质青饲料。由于其抗旱和耐湿性强，对土壤要求不高，近年来在南方红壤山地得到了广泛的推广和应用。狼尾草的盛产期集中在夏季，在夏季对狼尾草进行青贮有利于狼尾草季节性均衡供应并提高其利用效率。
青贮发酵一般包括、好氧呼吸期、乳酸发酵期及稳定保存期。经青贮发酵后，狼尾草青贮料中所有的生物过程和化学过程几乎完全停止，从而可使青贮饲料可以长期保存下去。近年来科技工作者对狼尾草的青贮技术开展了大量的研究，主要集中在狼尾草低水分青贮、混合青贮和添加剂青贮等方面。目前，狼尾草青贮应用较多的青贮添加剂是乳酸菌制剂，市场上乳酸菌制剂是通用型的青贮添加剂，所用乳酸菌主要分离自外界环境，这些菌株由于生活环境与狼尾草生长环境相差甚远，致使乳酸菌在狼尾草青贮料中的适应力不强、生长性能差，导致对狼尾草的青贮效果并不理想，因此筛选出价格便宜并可以改善狼尾草青贮品质的专用青贮添加剂，对狼尾草在南方畜牧业中的高效利用具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种专用于狼尾草的青贮添加剂，其不仅能够抑制狼尾草青贮过程中好氧微生物的生长，缩短青贮的好氧呼吸期，还能够促进狼尾草自身乳酸菌的快速繁殖，克服添加外源乳酸菌在狼尾草青贮料中的适应力不强、生长性能差的问题，从而显著改善狼尾草青贮发酵品质的效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种专用于狼尾草的青贮添加剂，其含五味子提取液1.00wt%、黄芪提取液2.00wt%、金银花提取液1.00wt%。
所述五味子提取液、黄芪提取液、金银花提取液的制备方法为：将五味子、黄芪或金银花于60℃烘干至恒重，然后称取25g，用250ml去离子水浸泡30min后进行煎煮，沸后文火煎煮30min，用孔径为1mm的4层纱布进行第一次过滤，得到第一次滤液和药渣；然后在药渣中加入150ml去离子水，文火煎煮30min后进行第二次过滤，弃掉滤渣；将两次所得滤液合并后，文火煎煮浓缩至药液终浓度为1g/ml，经高压灭菌后置于4℃冰箱保存。
现有研究表明，中草药对乳酸菌的影响非常复杂，不仅不同种类的中草药对乳酸菌的影响不同，即使是同一种类的中草药在不同的浓度对同一菌种的影响也不同。这可能是由于：一、中草药成分极其复杂，其中的活性物质可能同时存在对乳酸菌的促生长因子和抑制因子，这些因子在不同条件下的相互作用，表现出对乳酸菌生长的不同影响；二、与不同乳酸菌对中草药的耐受程度有关；三、中草药的活性成分受不同的浸提方法的影响，从而影响其对微生物的作用效果。
本发明以五味子、黄芪、金银花为中草药原料，采用水煎法提取其活性成分，并通过适当配比，制备得到一种复方中草药型青贮添加剂。该青贮添加剂能在不添加外源乳酸菌的情况下，促进狼尾草自身乳酸菌的快速繁殖，又能抑制青贮过程中好氧微生物的生长，从而能达到显著改善狼尾草青贮发酵品质的效果。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
1.狼尾草乳酸菌的提取纯化：称取生长旺盛、新鲜的“闽牧6号”狼尾草叶片5g，用剪刀将其剪成长1cm左右的小段，放入50ml的mrs液体培养基中37℃静止培养72h，然后取mrs发酵液0.5ml接种于9.5ml的mrs液体培养基中，室内厌氧培养。连续培养5代后将ph值高于4.0的菌液淘汰，之后继续继代培养，随时淘汰ph值高于4.0的菌液。经过10代左右的继代培养，选出一个菌系，其ph值继代培养值低且稳定。取该菌系0.5ml生长旺盛的菌液，转入装有4.5ml无菌水的试管中，充分混匀，然后反复操作稀释至10-8倍，再取稀释液0.1ml在含有琼脂的mrs培养基平板上涂皿，30℃静止厌氧培养。从平板中选择典型的菌落在同样的平板上划线分离培养，直到得到纯的单个菌株，保存备用。
经鉴定，从狼尾草叶片表面分离的该菌株革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶试验为阴性、硝酸盐还原试验为阴性、不液化明胶、不产生硫化氢、无运动性、能在15℃和45℃条件下生长，根据乳酸菌定义（郭本恒,2003），确定为乳杆菌属。
2.中草药提取液的制备：将药材置于60℃干燥箱中烘至恒重，然后称取25g，用250ml去离子水浸泡30min后进行煎煮，沸后文火煎煮30min，用孔径为1mm的4层纱布进行第一次过滤，得到第一次滤液和药渣；然后在药渣中加入150ml去离子水，文火煎煮30min后进行第二次过滤，弃掉滤渣；将两次所得滤液合并后，文火煎煮浓缩至25ml，使药液终浓度为1g/ml，即得。所得中草药提取液经高压灭菌后置于4℃冰箱保存备用。
3.中草药添加剂的组方确定
3.1单因素试验
以补益类中草药黄芪、五味子、枸杞、当归、熟地及清热解毒类中草药金银花、青蒿、瓜蒌、鱼腥草、决明子的提取液为添加剂，分别进行单因素试验，以对狼尾草乳酸菌生长的促进率为指标，研究不同添加剂在不同浓度（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%）下对狼尾草叶片表面乳酸菌增殖的影响。
其具体操作方法为：从斜面上挑取适量狼尾草乳酸菌菌苔，于mrs平板上划线活化，倒置于37℃培养箱中培养，至菌体生长。挑取平板上的单菌落，接入mrs液体培养基中，静置于37℃培养箱中培养至菌液浑浊，用生理盐水对菌液进行106倍稀释后，置于磁力搅拌器上搅拌30-40min，得工作菌液。用2×mrs液体培养基将受试药物进行梯度稀释，获得4.00%、3.00%、2.00%、1.00%、0.50%的梯度溶液。在96孔板上加入梯度溶液100μl（以2×mrs液体培养基为对照，药物浓度为0.00%），并加入100μl的工作菌液，使各药物终浓度为0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，每个浓度点设5个平行。由于有些中草药提取液的颜色很深，恐有干扰，故另取一个96孔板，以100μl生理盐水代替工作菌液，用于对各浓度点的体系进行监控，并对各浓度体系的本底值进行检测，各设2平行。将96孔板静置于37℃培养箱中培养48h后，经震荡混匀，用酶标仪检测od600值。
将实验组及对照组的od600值扣除对应浓度点的本底值，即为各浓度点的od600值。以促进率表征中草药提取液对乳酸菌生长的影响，促进率的计算方法为：促进率（%）＝（实验组od600/对照组od600－1）×100，所得结果分别见表1、2。单因素试验数据采用minitab16单因子方差分析，使用tukey法对各组间平均数进行多重比较，结果表示为平均值+标准差。
表1补益类中草药添加剂对乳酸菌生长的促进率(%)
表2清热解毒类中草药添加剂对乳酸菌生长的促进率(%)
结果表明，不同类型的中草药提取液对狼尾草乳酸菌的作用不同，即使是同一种中草药提取液在不同浓度下对乳酸菌的作用也不尽相同。
5种补益类中草药提取液中，各浓度的五味子、黄芪、当归提取液均表现出对狼尾草乳酸菌体外生长有促进作用，当浓度越大时，黄芪、当归提取液对乳酸菌的促进作用越强，而五味子提取液则存在一个峰值，达到峰值以后，随着浓度的提高，对乳酸菌的促进作用反而下降。枸杞提取液对狼尾草乳酸菌体外生长的作用不明显，低浓度对乳酸菌生长有轻微的促进作用，高浓度对乳酸菌生长有轻微的抑制作用；熟地提取液在各浓度均表现出对狼尾草乳酸菌体外生长的抑制作用，浓度越大抑制作用越强。因此，在试验设定的浓度范围内，5种补益类中草药中，1.00%的五味子提取液对乳酸菌生长的促进作用最强，促进率为15.60%；2.00%的黄芪提取液次之，对乳酸菌生长的促进率为13.88%。
5种清热解毒类中草药中，除决明子提取液外，各浓度的中草药提取液均表现出对狼尾草乳酸菌体外生长的抑制作用，且浓度越大对乳酸菌的抑制作用越强；而决明子提取液则存在一个峰值，达到抑制作用峰值以后，随着浓度的提高，对乳酸菌的抑制作用反而下降。在添加1.00%浓度时，金银花提取液对乳酸菌的抑制作用最小，为1.73%。
3.2正交优化试验
在单因素试验的基础上，从补益类中草药中筛选出促进乳酸菌生长的黄芪、五味子，从清热解毒类中草药中筛选出对好氧微生物有抑制作用的金银花组成复方中草药型青贮添加剂。采用正交试验对各组分浓度进行优化。试验采用三因素三水平5重复的正交设计进行，各因素水平如表3，正交实验,结果及相关分析依次见表4-6。正交试验数据的方差分析采用minitab16的一般线性模型，使用tukey法配对比较，检验中使用校正的ss。
表3正交试验因素水平表
表4正交试验方案及结果
表5对乳酸菌生长的促进率均值响应
表6对乳酸菌生长促进率的方差分析
由表5直观分析可知，复方中草药青贮添加剂中各组分对狼尾草乳酸菌体外生长影响的主次顺序为黄芪＞金银花＞五味子，即黄芪提取液为主要影响因素，其次为金银花提取液，再次为五味子提取液，最佳配方为黄芪3金银花2五味子2，即五味子、黄芪、金银花提取液的添加浓度分别为1.00%、2.00%、1.00%。由表6方差分析可知，添加剂中各组分对狼尾草乳酸菌体外生长的促进率有显著影响。
经验证试验测定，按上述最佳配方组成的青贮添加剂对狼尾草乳酸菌生长的促进率为16.51%，优于其他方案。
4.在狼尾草青贮中的使用效果评价
表7狼尾草青贮料发酵品质和营养成分分析
由表7可知，与不添加青贮添加剂的对照组相比，添加本发明青贮添加剂进行狼尾草青贮45天后，青贮料的ph、氨态氮/总氮、ndf、adf均有所降低，粗蛋白含量提高，差异均达到显著水平(p＜0.05)。证明本发明青贮添加剂的使用可提高狼尾草的青贮品质。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。