高度可消化的富含蛋白质的营养组合物、其用途及其制备方法与流程

本发明涉及高度可消化的富含蛋白质的营养组合物及其例如在用于维持或增加肌肉质量的方法中的用途。

背景技术：

公认的是，摄入相当于一餐量的游离氨基酸、乳蛋白质或牛肉形式的蛋白质强烈刺激骨骼肌蛋白质合成。这种餐后肌肉蛋白质合成反应尤其取决于所摄入的蛋白质的量、时机和类型。先前的研究表明，摄入乳清蛋白与摄入酪蛋白相比引起更高的餐后蛋白质保留。参见例如dangin等人(jnutr.[营养学期刊]，2002；132：3228s-33s；jphysiol[生理学期刊]，2003；549：635-44)。

所有哺乳动物的乳都含有酪蛋白、球状蛋白，此外还含有一些非蛋白质含n组分(npn)，在牛乳中，npn占总n的约5％。在牛乳中的真蛋白质中，通常82％至83％是酪蛋白，而17％至18％是球状蛋白，也称为“球状血清蛋白”。酪蛋白是具有极少二级结构的非球状蛋白。因此它们不会由于热而变性。在所有哺乳动物的乳中，酪蛋白缔合成含有约10至30000个分子的颗粒，即所谓的酪蛋白胶束；缔合是通过弱相互作用(主要是静电和疏水相互作用)形成的。酪蛋白可以通过凝乳、酸化或微滤与其他乳成分分离。所得的高酪蛋白产物分别称为奶酪凝块、酸酪蛋白和胶束酪蛋白分离物(micellar-casein-isolate)。剩余的液体分别称为奶酪乳清、酸酪蛋白乳清和乳血清。乳清和乳血清富含球状血清蛋白(通常称为“乳清蛋白”)和npn。可以使用超滤从乳清或乳血清中分离蛋白质，得到乳清蛋白浓缩物(wpc)或血清蛋白浓缩物(spc)。wpc和spc中的大多数蛋白质都是球状蛋白，也称为“球状血清蛋白”。奶酪乳清和来自奶酪乳清的乳清蛋白浓缩物还含有酪蛋白巨肽(cmp)，其中cmp不是球状蛋白。如果来自乳的球状蛋白处于天然(折叠)状态，则在人胃中的条件下不凝结。然而，食品(乳制品)行业中应用的许多标准方法(例如，高巴氏灭菌法或高压处理)会导致球状蛋白变性和聚集。变性和聚集的球状蛋白在人胃中的条件下凝结。酪蛋白总是在人胃中的条件下凝结；它们不会变性。奶酪凝块中的酪蛋白在食用时已经凝结。如本文所用，“球状血清蛋白”也称为“乳清蛋白”。

乳清蛋白的合成代谢特性大于酪蛋白，这主要归因于球状蛋白的氨基酸组成和较快的消化和吸收动力学。后者导致餐后血浆氨基酸利用率更大程度地增加，从而导致肌肉蛋白质合成更大程度地增加。特别地，主要含有酪蛋白和/或酪蛋白酸盐的营养组合物倾向于在胃中凝结。因此，酪蛋白通常被称为“凝结蛋白或慢蛋白”，而乳清蛋白则是“非凝结蛋白或快蛋白”的一个实例。

除了蛋白质消化和吸收动力学的差异之外，乳清蛋白和酪蛋白的氨基酸组成也明显不同。乳清蛋白具有相当高的亮氨酸含量。后者也可以有助于乳清蛋白具有比酪蛋白更强的合成代谢特性，因为亮氨酸已经被鉴定为负责刺激餐后肌肉蛋白增长的主要营养信号。这与luiking等人(nutrj.[营养学期刊]，2014；13：9)的研究是一致的，该研究报道称，专门设计的富含乳清蛋白并富含亮氨酸的营养补充剂比常规乳制品产品更有效地刺激健康老年受试者中的总体餐后肌肉蛋白合成。这种作用归因于在摄取高乳清蛋白、富含亮氨酸的补充剂之后，亮氨酸和必需氨基酸的血浆水平较高。

因此，很明显，摄取乳制品蛋白(尤其是乳清蛋白)对于维持或增长骨骼肌质量非常有效。为了增强对肌肉蛋白质合成的刺激作用，通过添加乳清蛋白来增加消费产品的乳清蛋白含量将是理想的。然而，乳清蛋白部分相对昂贵。此外，细菌学安全性通常所需的巴氏灭菌热处理引起乳清蛋白的胶凝和沉淀，这导致可加工性有限的高粘性产品。因此，对于经热处理的产品，包括明显更高的乳清蛋白浓度在技术上具有挑战性。

所以，将期望提供没有上述缺点的改进的富含蛋白质的营养组合物。本发明人特别寻求制造易于消化的富含蛋白质的组合物，从而在不牺牲该组合物的粘度的情况下允许血浆亮氨酸的水平增加。其中，发明人旨在提供发酵的(例如，酸奶型)液体营养组合物，该组合物用作针对其中需要肌肉生长/恢复的受试者的膳食蛋白补充剂或治疗性蛋白补充剂，这些受试者包括运动员、老年人、婴幼儿和患病或营养不良的患者。

令人惊讶地发现，通过操纵某些工艺参数，包括对不同成分的预处理以及在制造过程期间添加成分的相对顺序，可以达到上述目标中的至少一些目标。更具体地讲，设计了一种新方法，其中在一部分非凝结蛋白(乳清蛋白或球状血清蛋白)存在下加热凝结蛋白(酪蛋白)，随后再添加另一部分非凝结蛋白作为原始或温和的巴氏灭菌成分，使得这些蛋白质基本上保持天然。因此，非凝结蛋白的一部分变得结合/聚集到凝结蛋白上，而非凝结蛋白的另一部分则保持未结合或保持天然。“组合加热”和“加热后添加”这2步工序之后任选地进行发酵步骤。作为发酵的替代方案，用无机酸/有机酸/酸化剂(例如，葡糖酸δ内酯；gdl)酸化也是可行的。所得的蛋白质致密产物表现出期望的可加工性特性与惊人的高消化率的组合，据推测这是通过调节凝结蛋白成分与非凝结蛋白成分之间的相互作用而产生的。

具体实施方式

因此，披露了包含至少4wt％蛋白质的营养组合物，该营养组合物包含相对重量比在22∶78至70∶30范围内的凝结蛋白和非凝结蛋白的混合物，并且其中所述非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合，并且其中所述非凝结蛋白的剩余部分未结合，该营养组合物在受试者中用于下列用途中的任何一项或多项：

a)防止或减少上胃肠道中的凝结；

b)增加胃排空速率；

c)增强蛋白质消化和氨基酸吸收；

d)增加游离必需氨基酸、优选亮氨酸的血清浓度；

e)增强肌肉质量和/或肌肉力量。

特别地，本发明提供了包含至少4wt％蛋白质的营养组合物的用途，该营养组合物包含相对重量比在从22∶78至70∶30范围内的非凝结蛋白和凝结蛋白的混合物，其中非凝结蛋白包括乳清蛋白和球状血清蛋白，并且凝结蛋白包括酪蛋白或酪蛋白酸盐，并且其中所述非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合，并且其中所述非凝结蛋白的剩余部分未结合，该营养组合物在受试者中用于：

a)防止或减少上胃肠道中的凝结；

b)增加胃排空速率；

c)增强蛋白质消化和氨基酸吸收；

d)增加游离必需氨基酸、优选亮氨酸的血清浓度；和/或

e)增强肌肉蛋白合成，增加肌肉质量、力量和功能。

因此，本文还提供了一种方法，该方法用于在受试者中：

a)防止或减少上胃肠道中的凝结；

b)增加胃排空速率；

c)增强蛋白质消化和氨基酸吸收；

d)增加游离必需氨基酸、优选亮氨酸的血清浓度；和/或

e)增强肌肉蛋白合成，增加肌肉质量、力量和功能，

该方法包括向该受试者施用包含至少4wt％蛋白质的营养组合物，该营养组合物包含相对重量比在从22∶78至70∶30范围内的非凝结蛋白和凝结蛋白的混合物，其中该非凝结蛋白包括乳清蛋白，并且该凝结蛋白包括酪蛋白或酪蛋白酸盐，并且其中所述非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合，并且其中所述非凝结蛋白的剩余部分未结合。

在一个实施例中，该富含蛋白质的组合物在医学应用中使用。例如，提供了包含至少4wt％蛋白质的营养组合物，该营养组合物包含相对重量比在22∶78至70∶30(优选地22∶78至50∶50)的范围内的凝结蛋白和非凝结蛋白的混合物，其中非凝结蛋白包括乳清蛋白和球状血清蛋白，并且凝结蛋白包括酪蛋白或酪蛋白酸盐，并且其中所述非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合，并且其中所述非凝结蛋白的另一部分未结合，该营养组合物在治疗和/或预防与肌肉质量和/或力量损失有关的障碍或病症的方法中使用。在一个方面，该障碍选自由以下各项组成的组：瘦体重下降、肌肉功能下降、骨质量下降、肌肉减少症、恶病质、活动减少或任何形式的不活动引起的肌肉损失、骨质疏松症，以及它们的任何组合。

本发明的另一个实施例涉及用于提供包含至少4wt％蛋白质的营养组合物的方法，其中非凝结蛋白包括乳清蛋白和球状血清蛋白，并且凝结蛋白包括酪蛋白或酪蛋白酸盐，该蛋白质包括非凝结蛋白和凝结蛋白，其中非凝结蛋白与凝结蛋白的比率在从22∶78至70∶30、优选地从22∶78至50∶50的范围内，该方法包括以下步骤：

(i)在实现非凝结蛋白与凝结蛋白结合的条件下，加热包含所述凝结蛋白和所述非凝结蛋白的混合物；以及

(ii)向所述已加热的混合物中添加非凝结蛋白源，其中所述源中的至少50w％的非凝结蛋白处于天然状态，以获得其中所述非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合并且其中所述非凝结蛋白的剩余部分是天然的且未结合的组合物。

包含经热处理的凝结蛋白和非凝结(乳制品)蛋白的混合物的营养组合物是本领域已知的。例如，wo2010/131952涉及用于减少蛋白质的消化凝结的方法。披露了抗凝结蛋白在制造还包含凝结蛋白的营养组合物中的用途，用于防止或减少所述营养组合物中的所述凝结蛋白在受试者的上胃肠道中的凝结。根据wo2010/131952，优选的凝结蛋白包括酪蛋白酸盐，并且优选的抗凝结蛋白包括豌豆蛋白或大豆蛋白或这两者。wo2010/131952没有提及任何组合加热处理和/或在加热前后添加非凝结蛋白。

wo2014/011039涉及制备包含至少两种不同蛋白质的组合物的方法，其中至少一种蛋白质是凝结蛋白，优选酪蛋白，并且至少一种蛋白质是抗凝结蛋白，优选豌豆蛋白、大豆乳清蛋白或它们的组合，该方法包括以下步骤：a)对包含所述凝结蛋白的第一液体组分进行加热灭菌，b)对包含所述抗凝结蛋白的第二液体组分进行加热灭菌，以及c)将所述第一组分与所述第二组分混合以获得它们的混合物。所获得的混合物可用作在上胃肠道中的凝结减少的食品成分。与本发明形成对照，执行wo2014/011039的方法的加热-灭菌步骤a)和b)，使得第一液体组分和第二液体组分在加热步骤a)和b)期间不相互混合。尽管根据wo2014/011039，可以将另一种蛋白作为第三组分添加到混合物中，但是该第三种蛋白不同于凝结蛋白和抗凝结蛋白。此外，第三种蛋白优选地也被加热灭菌。

wo2016/097308涉及在物理特性和感官特性这两方面均具有良好品质的酸奶产品，这些酸奶产品包含大量的蛋白质，包括大量的天然乳清蛋白，以及用于制造此类酸奶产品的方法。披露了一种方法，包括：将富含酪蛋白的部分与天然乳清蛋白浓缩物混合，从而获得酪蛋白和天然乳清蛋白的混合物，其中与原料乳中的乳清蛋白与酪蛋白的比率相比，乳清蛋白与酪蛋白的比率增加；然后对酪蛋白和天然乳清蛋白的混合物进行热处理，并向经热处理的酪蛋白和乳清蛋白的混合物中添加发酵剂培养物，以提供发酵的混合物。根据wo2016/097308，通过以足以使酪蛋白和天然乳清蛋白的混合物中仅30％至70％的天然乳清蛋白变性的温度和时间段加热该混合物来进行该热处理。因此，尽管wo2016/097308也涉及加热酪蛋白和乳清的混合物，但是与本发明的方法相比，该热处理较温和，并且变性程度较低。此外，wo2016/097308没有教导或建议将天然/未变性乳清添加到已加热的混合物中的后续步骤。

wo2010/123351涉及乳清蛋白及其在用于体重管理的(基于乳的)组合物中的用途。披露了在热处理脱脂乳之后，将乳清蛋白单独地添加到其中的高(8wt％)蛋白酸奶。然而，与本发明形成对照，所使用的乳清蛋白源是hiprotal60mp或vivinalalpha，这两者均主要包含变性的(即，非天然的)乳清蛋白。

us2016/262412涉及包含水果风味剂和高蛋白变性乳清蛋白组合物的高蛋白、水果风味饮料，并且涉及该饮料的生产方法。但是，没有提及关于消化率特性的内容或与其相关的具体应用，例如，治疗和/或预防与肌肉质量力量损失有关的疾病或病症。us2016/262412披露了包含乳清蛋白和酪蛋白的酸奶基料，向其中添加了包含乳清蛋白的水果混合物。该水果混合物中的乳清蛋白主要作为热变性乳清蛋白存在，该热变性乳清蛋白为0.5至10微米尺寸范围内的不溶性乳清蛋白颗粒的形式。

wo2014/011040涉及消化凝结减少的包含蛋白质和脂质的组合物。披露了制备包含至少两种不同蛋白质的组合物的方法，其中至少一种蛋白质是酪蛋白并且至少一种蛋白质是抗凝结蛋白(优选非乳制品蛋白，诸如豌豆蛋白或大豆蛋白)。该方法包括以下步骤：a)对包含酪蛋白的第一液体组分进行加热灭菌，其中酪蛋白的量为第一组分的总蛋白含量的至少85wt％，b)对包含抗凝结蛋白的第二液体组分进行加热灭菌，以及c)将第一组分与第二组分混合以获得它们的混合物。尽管乳清蛋白可以与大豆蛋白或豌豆蛋白结合并加热灭菌，但是wo2014/011040完全没有提及向该混合物中添加天然乳清源。相比之下，wo2014/011040教导了任何另外的任选蛋白质也必须进行加热灭菌。此外，所得的产品被加热灭菌，因此将不包含任何大量的天然乳清。

因此，用于提供本发明组合物的方法以及如本文所披露的组合物的方法和用途并非源自现有技术。

组合物的用途

基于与包含结合的和未结合的非凝结蛋白的组合物的胃排空、消化率和氨基酸释放有关的独特且有益的特性，本领域技术人员将认识到并理解该组合物的各种各样可能的治疗性用途和非治疗性用途。

在一个方面，该用途具有非医疗或非治疗性质。例如，该组合物在受试者中用于以下用途中的任何一项或多项：

a)防止或减少上胃肠道中的凝结；

b)增加胃排空速率；

c)增强蛋白质消化和氨基酸吸收；

d)增加游离必需氨基酸、优选亮氨酸的血清浓度；

e)维持或增强肌肉质量和/或肌肉力量，或者减轻肌肉质量损失和/或肌肉力量损失；

任选地，其中所述用途不是出于对动物体或人体进行治疗的目的。

在一个实施例中，受试者是健康受试者，如婴幼儿、儿童、青少年、成人或老年受试者。受试者可以是身体活跃的受试者，例如运动员。在一个具体方面，该组合物用于需要肌肉生长增强和/或肌肉恢复增强的受试者。例如，该组合物被用于参与负重训练的受试者，以便促进肌肉生长。在这种情况下，使用举起重物和进食蛋白质相结合的方法来构建新的(收缩)肌肉组织。对于耐力运动员来说，摄取蛋白质也可能是重要的。除了高品质的蛋白质食物(例如，鱼/家禽肉/乳制品/肉类/蛋等)之外，蛋白质补充剂也是耐力运动员的工具包中的有用补充物。摄取蛋白质将不仅有助于肌肉恢复，还可以增加线粒体蛋白的合成，这进而将改善肌肉的能量代谢(即，更有效地利用能量)。实际上，如本文所提供的富含蛋白质的组合物，其必需氨基酸亮氨酸(激活肌肉蛋白合成过程的关键触发因素)的含量高，并且通常比完整食物消化得更快，从而提供有效的恢复策略。

如本文所披露使用的营养组合物可以在任何时间消耗，例如作为膳食的补充，作为膳食之间，运动之前、期间和之后的零食，以及作为在白天期间摄取蛋白质的额外机会在睡前消耗。

在另一个实施例中，本发明提供了用于治疗和/或预防与受试者中的肌肉质量和/或力量的损失有关的病症的组合物。在又一个实施例中，本发明提供了用于治疗和/或预防与受试者中的肌肉质量和/或力量的损失有关的病症的方法，该方法包括向该受试者施用本发明的组合物。受试者可以是年老或患病的人、营养不良的人或无法活动(例如，受伤、生病、太空航行、打石膏、被固定、住院)的人。例如，该受试者(任选地是老年受试者)患有瘦体重下降、肌肉消瘦、肌肉衰退、骨衰退、肌肉减少症、恶病质、骨质疏松症和/或骨肌减少症。

骨质疏松症和肌肉减少症的联合作用对(脆弱的)老年人构成严重的威胁。肌肉骨骼衰退与独立性和生活质量下降以及由于肌肉质量下降而引起的死亡率过高有关。肌肉无力是跌倒风险增加的原因，因此是与年龄相关的骨折风险的原因。肌肉质量的损失促使机械负荷减小，而机械负荷通常刺激骨形成。患有骨肌减少症的老年人更可能经受行动不便，并且具有最高的无创伤骨折患病率。女性与同龄男性相比更可能经受骨肌减少症，因为她们通常具有较低的瘦肌肉质量和力量，以及较低的骨矿物质密度(bmd)。

营养组合物

根据本发明使用的营养组合物富含蛋白质，以确保向受试者供应充足的蛋白质/氨基酸。

该组合物包含至少4wt％的蛋白质，即，每100g该组合物至少4g蛋白质。该组合物可以是固体、液体或半液体(例如可匙取)形式。例如，根据本发明使用的蛋白质致密的液体营养组合物每100ml该组合物包含至少4g蛋白质。存在于该营养组合物中的总蛋白质，即存在的所有蛋白质的组合，也可以称为该营养组合物的“蛋白质部分”。因此，该营养组合物包含占该组合物4wt％(即，每100g至少4g)的蛋白质部分。在一个优选的实施例中，该组合物包含至少5wt％、更优选地至少6wt％、最优选地7wt％或更高的蛋白质部分。蛋白质浓度的上限不是关键的，并且可以高达约60wt％，例如对于粉末状产品来说。通常，蛋白质含量高达约50wt％，优选地高达约40wt％。

在本发明的一个优选实施例中，蛋白质含量在从约5wt％至18wt％的范围内。在本发明的一个更优选的实施例中，蛋白质含量在从6wt％至15wt％的范围内。在本发明的另一个优选的实施例中，蛋白质含量在从6wt％至18wt％的范围内。例如，在一个方面，蛋白质含量在从6wt％至9wt％或从7wt％至9wt％的范围内。在本发明的另一个实施例中，蛋白质含量在从6.5wt％至18wt％的范围内。例如，蛋白质含量可以在从7wt％至17wt％的范围内。在本发明的又一个优选的实施例中，蛋白质含量在从7wt％至15wt％的范围内。在本发明的一个更优选的实施例中，蛋白质含量在从7wt％至13wt％的范围内。在本发明的另一个优选的实施例中，蛋白质含量在从7wt％至12wt％的范围内。在本发明的又一个优选的实施例中，蛋白质含量在从6wt％至12wt％的范围内，并且在本发明的一个最优选的实施例中，蛋白质含量在从6wt％至10wt％的范围内。

其他优选的组合物每100g或每100ml组合物包含至少6g、优选地至少7g的蛋白质部分，例如8g或更多、9g或更多的蛋白质。在一个具体方面，该组合物是液体组合物，每100ml该组合物包含4至20g蛋白质，优选地每100ml该组合物包含6至15g、更优选地6至12g蛋白质。在另一个具体方面，该组合物是固体组合物，例如或运动棒，并且每100g该组合物包含4至20g蛋白质，优选地每100g该组合物包含4至15g、更优选地5至12g蛋白质。在又一个方面，该组合物是半固体，例如酸奶，并且每100g该组合物包含4至20g蛋白质，优选地每100g该组合物包含4至15g、更优选地5至12g蛋白质。在另一个具体方面，该组合物作为在使用前将被再水合的粉末提供，并且被配制为每100g最终复溶组合物提供4至20g蛋白质，优选地每100g最终组合物提供4至15g、更优选地5至12g蛋白质。例如，该粉末状组合物包含基于总固体20w％至60w％的蛋白质。在一个优选的实施例中，该粉末包含30w％至55w％的蛋白质(ts)。

本发明的组合物的特征还含在于，该组合物包含凝结蛋白和非凝结蛋白的混合物，并且其中非凝结蛋白与凝结蛋白的重量比在从22∶78至70∶30的范围内。

根据本发明，非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合，并且所述非凝结蛋白的剩余部分处于未结合状态，例如，作为游离或天然蛋白质。

在一个优选的实施例中，为了提供改善的消化率特性，该组合物中至少50w％的未结合的非凝结蛋白处于天然状态。例如，该组合物中至少60w％、或更好至少70w％，或甚至更好至少75w％的未结合的非凝结蛋白处于天然状态。在一个实施例中，天然的、未结合的非凝结蛋白以基于该组合物的总重量至少0.1wt％、优选地至少0.3wt％、最优选地至少0.5％的量存在。例如，在一个实施例中，该组合物包含至少0.1w％的天然球状血清蛋白。

在一个方面，结合的非凝结蛋白与凝结蛋白的重量比为至少1至20、优选地至少1至10、更优选地至少1至8，并且非凝结蛋白的剩余部分未结合并且是天然的。

使用其中天然的、未结合的非凝结蛋白以按该组合物中的总蛋白重量计至少1.5％、优选地至少5％、更优选地至少10％的量存在的组合物获得了良好的结果。

在根据本发明使用的组合物中，凝结蛋白是乳制品蛋白或乳蛋白，特别是酪蛋白或酪蛋白酸盐。在一个实施例中，该组合物包含一种或多种选自由以下各项组成的组的凝结蛋白：胶束酪蛋白、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸钾和酪蛋白酸镁。

非凝结蛋白在本文中被定义为在正常消化条件下在人的胃中不凝结的蛋白质。给定蛋白质的凝结能力可以通过本领域已知的体外方法来确定。例如，对于非凝结蛋白，这意味着在如实例1中所定义的人工消化液存在下开始，在37℃下约10至60分钟之后，至少85％、优选地至少90％在胃消化模型中保持在液相中。根据本发明，非凝结蛋白包括乳清蛋白和球状血清蛋白，或者由它们组成。在一个优选的实施例中，凝结蛋白是胶束酪蛋白，并且非凝结蛋白是球状血清蛋白。

乳中的球状蛋白由β-乳球蛋白(约65％)、α-乳白蛋白(约20％)、牛血清白蛋白(约6％)和免疫球蛋白的混合物组成。这些球状蛋白在其天然形式下是可溶的，与ph无关。如上文所阐释，在本发明中使用的非凝结蛋白可以使用不同的方法从乳中获得。例如，它们通常通过微滤获得，或者从凝乳过程产生的奶酪乳清获得。因此，在一个实施例中，非凝结蛋白是来自奶酪乳清的乳清蛋白浓缩物(wpc)中的蛋白质。在另一个实施例中，非凝结蛋白是来自下述wpc的蛋白质：其中该wpc来源于通过酸化乳获得的酸酪蛋白乳清。在又一个实施例中，非凝结蛋白是通过对乳进行微滤获得的血清蛋白浓缩物(spc)中的蛋白质。为了确保所得的组合物具有有利的消化率特性，明显优选的是尚未经受或者暴露于蛋白质变性条件(诸如高温(例如uht)处理或钙螯合)的乳清蛋白源。微粒化乳清蛋白(mpw或mpwpc)是指经历过热和机械处理以使乳清蛋白变性并产生与乳中的脂肪球的尺寸相似的颗粒的乳清蛋白。因此，使用微粒化乳清蛋白与本发明不符。

根据本发明的用作非凝结蛋白的乳清蛋白可以是完整的，也可以被(部分)水解。完整的乳清蛋白可以例如是乳清蛋白浓缩物(wpc)、乳清蛋白分离物(wpi)、血清蛋白浓缩物(spc)或血清蛋白分离物(spi)。如上文所指出的，wpc、wpi、spc和spi可以通过本领域已知的方法(诸如对甜乳清或酸乳清的加工方法，超滤或微滤方法)获得。基于干物质，乳清蛋白浓缩物(wpc)通常包含约35w％至约80w％的蛋白质。基于干物质，乳清蛋白分离物(wpi)和血清蛋白分离物(spi)通常包含约85w％或更多的蛋白质。在一个实施例中，非凝结蛋白包含蛋白水解物或由蛋白水解物组成。例如，(部分)水解蛋白获自酸乳清蛋白、甜乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物或脱矿物质乳清粉末。例如，水解产物是部分水解的乳清蛋白、部分水解的β-乳球蛋白和/或部分水解的α-乳白蛋白。

如本文所述使用的组合物包含相对重量比在从22∶78至70∶30、优选地22∶78至65∶35的范围内的非凝结蛋白和凝结蛋白的混合物。在本发明的一个优选实施例中，非凝结蛋白和凝结蛋白的重量比为从25∶75至60∶30，更优选地从30∶70至40∶60，并且最优选地从30∶70至55∶45。例如，该组合物包含相对重量比在从22∶78至70∶30、优选地25∶75至60∶40、更优选地从30∶70至60∶40，并且最优选地从30∶70至55∶45的范围内的乳清蛋白和酪蛋白。

根据本发明使用的示例性组合物具有在从4％至20％(w/w)范围内的蛋白质含量，以及在从22∶78至50∶50(w/w)范围内的乳清蛋白(即，天然和变性的乳清蛋白和球状血清蛋白)与酪蛋白的重量比。

如本文所提供的营养组合物可以具有任何合适的形式。例如，在一个实施例中，本发明提供了可饮用或可匙取液体形式的组合物。在另一个实施例中，该组合物是可咀嚼的物质，例如，用作健身前或健身后的零食的恢复蛋白棒、曲奇饼等。它可以还包含复合碳水化合物，诸如燕麦。

在又一个实施例中，该营养组合物可以作为粉末提供，该粉末例如特别适合用作饮料组分以提供蛋白质强化饮料的干燥粉末。因此，在本发明的另一个方面，提供了包含本发明组合物的饮料，诸如高蛋白健康或运动饮料和奶昔，以供运动员、从事娱乐活动的人、老年人或病人使用。

在一个特定的方面，该营养组合物是发酵的营养组合物，优选地选自由以下各项组成的组：酸乳产品和/或酸化的新鲜产品，例如酸奶、发酵乳、威利(villi)、发酵奶油、酸奶油、软干酪、酪乳、开菲尔(kefir)和乳浓缩饮料(dairyshotdrinks)。在一个方面，该发酵的营养组合物是酸奶或软干酪。

在一个实施例中，它是酸奶，该酸奶可以是凝固型或搅拌型。凝固型酸奶是在最终包装中发酵并冷却的酸奶类型，其特征在于使其具有坚固的果冻样质地的三维凝胶基质。在一个优选的实施例中，酸奶是搅拌型酸奶。搅拌型酸奶是在罐中发酵的酸奶类型，在冷却和包装之前，通过搅拌使最终的凝结物破碎。在搅拌型酸奶中，三维凝胶基质不再可见。搅拌型酸奶是由弱缔合的蛋白质簇组成的弱凝胶体系。例如，它是包含5wt％至8wt％总蛋白的酸奶，并且其中乳清蛋白/酪蛋白的比率在30∶70至60∶40、优选地40∶60至55∶45的范围内。

在一个具体方面，它是希腊风味酸奶，包含7w％至12w％的总蛋白，并且具有在30∶70至50∶50的范围内的乳清/酪蛋白比率。

在另一个实施例中，它是软干酪。例如，它是低脂软干酪，包含8wt％至12wt％的总蛋白，包含基于该组合物的总重量至少0.5wt％的天然的、未结合的乳清蛋白。

制造方法

如上文所提及，所述非凝结蛋白的结合部分适当地通过引起大部分蛋白变性的方法获得，例如在所述非凝结蛋白和所述凝结蛋白的混合物(的溶液)暴露于包括热处理(优选(高温)巴氏灭菌)或高压处理或均化的方法时。在单独的后续步骤中，将非凝结蛋白源添加到所述已加热的混合物中(其中大部分所述非凝结蛋白处于天然状态)以获得其中所述非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合并且其中所述非凝结蛋白的另一部分是天然的且未结合的组合物。

因此，本发明的另一个实施例涉及用于提供包含至少4wt％蛋白质的营养组合物的方法，该蛋白质包括非凝结蛋白和凝结蛋白，其中非凝结蛋白包括乳清蛋白和球状血清蛋白，并且凝结蛋白包括酪蛋白或酪蛋白酸盐，并且其中非凝结蛋白与凝结蛋白的重量比在22∶78至70∶30的范围内，该方法包括以下步骤：

(i)在用于获得蛋白质变性的条件下加热包含凝结蛋白和非凝结蛋白的混合物；以及

(ii)向所述已加热的混合物中添加非凝结蛋白源，其中至少50w％的所述非凝结蛋白处于天然状态，以获得其中所述非凝结蛋白的一部分与所述凝结蛋白结合并且其中所述非凝结蛋白的另一部分是天然的且未结合的组合物。

优选地，在步骤(i)中使用加热过程，其中使非凝结蛋白和凝结蛋白的混合物暴露于升高的温度足够长的时段以引起蛋白质的至少60％或优选80％变性，从而导致至少部分非凝结蛋白聚集到凝结蛋白上。因此，凝结蛋白不再在胃中凝结，从而使凝结蛋白在消化率方面“更快”。该加热过程优选地包括高巴氏灭菌，例如在85℃下至少6分钟，特别地至少10分钟，或者更短或更长的时间，具体取决于温度。在本发明的方法中，加热灭菌用任何合适的方法进行，诸如干馏灭菌、超高温(uht)处理或直接蒸汽喷射(dsi)。加热灭菌包括加热到至少80℃、优选至少90℃的温度。

该混合物优选地包含酪蛋白或酪蛋白酸盐(更优选地选自由胶束酪蛋白、非胶束酪蛋白、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸钾和酪蛋白酸镁组成的组)，以及乳清蛋白(优选球状血清蛋白)。待加热的混合物(即，在添加天然非凝结蛋白之前)中的非凝结蛋白与凝结蛋白的重量比为至少5∶95或优选地至少10∶90至20∶80。例如，使用球状血清蛋白：酪蛋白的重量比为17∶83的(脱脂)乳。乳可以是生的，也可以是经预处理的。例如，根据标准工序，对乳适当地进行热化(或巴氏灭菌)和/或离心除菌，以使活细菌和/或细菌孢子的负载最小化，从而确保食用安全。

为了增加蛋白含量，可以将乳浓缩或补充附加的(乳)蛋白质，例如补充脱脂乳粉(smp)。

在用于提供根据本发明的营养组合物的方法的步骤(ii)中，通过将天然非凝结蛋白源添加到包含与凝结蛋白结合的非凝结蛋白的组合物中，来获得所述非凝结蛋白的非结合部分。为了防止不需要的蛋白质变性，天然的非凝结乳清蛋白源没有经过处理、也没有暴露于高温处理或其他变性条件。然而，为了延长保质期，同时维持最终组合物的良好粘度和高蛋白质消化率，可以对该乳清蛋白源进行温和的热处理(在适当的ph、时间和温度条件下进行温和的巴氏灭菌，以防止变性)。例如，合适地使用已在约72℃下处理10秒至60秒、优选地15秒至30秒的天然球状血清蛋白。在另一个实施例中，使用生乳清。在混合时适当地添加天然的非凝结蛋白。它可以作为粉末、液体或它们的组合添加。

由于本发明的包括“组合加热”和“加热后添加”的2步方法，非凝结蛋白的一部分结合到凝结蛋白，而非凝结蛋白的剩余部分未结合。因此，非凝结蛋白以变性形式以及天然形式存在于该组合物中。这提供了蛋白质利用率和蛋白质消化率的最佳组合。因此，优选的是，在步骤(ii)之后不进行uht处理或类似的剧烈热处理。

如上文所述，本发明在一个优选的实施例中提供了富含蛋白质的高度可消化的发酵产品。例如，提供了发酵营养组合物，优选地选自由以下各项组成的组：酸乳产品和/或酸化的新鲜产品，例如酸奶、发酵乳、威利、发酵奶油、酸奶油、软干酪、酪乳、开菲尔和乳浓缩饮料。

为此，在组合加热和加热后添加的过程之后，接着是通过本领域已知的方法，通常使用合适的细菌培养物(在本领域中称为“发酵剂培养物”)发酵该组合物以提供乳酸发酵的步骤。以常规量添加发酵剂培养物，之后在足以获得适当酸化的时间内进行发酵，通常以获得约4.6或更低(例如，ph4.5)的ph。发酵在常规温度(通常在约35℃至约45℃的范围内)下进行。在一个实施例中，发酵在约38℃至40℃的温度下进行约10小时至15小时。在一个实施例中，将已加热的混合物发酵，然后干燥以获得粉末，之后借助干混添加附加的天然血清蛋白粉末。替代性地，在加热步骤之后添加天然血清蛋白，然后发酵，接着干燥

本发明的示例性方法包括以下过程：

·组合加热并后添加乳清蛋白/球状血清蛋白，之后发酵，并任选地干燥。

·组合加热、发酵、接着后添加乳清蛋白、球状血清蛋白，并任选地干燥

·组合加热、发酵，任选地进行浓缩步骤(例如，离心或过滤)，接着后添加干燥形式或者中性或酸化液体形式的乳清蛋白/球状血清蛋白，并任选地干燥。

·组合加热、发酵和干燥，接着后添加乳清蛋白/球状血清蛋白粉末(干混)

可以在发酵步骤中使用的微生物是本领域众所周知的。例如，链球菌属(streptococcus)菌种和明串珠菌属(leuconostoc)菌种用于生产酸奶油和酪乳，而保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)也可以用于生产保加利亚酪乳。链球菌属菌种主要用于生产奶酪，通常与其他菌种诸如青霉属(penicillium)菌种、短杆菌属(brevibacterium)菌种或乳杆菌属(lactobacillus)菌种联合使用。对于酸奶生产，所使用的微生物包括乳杆菌属菌种，诸如保加利亚乳杆菌或嗜酸乳杆菌(l.acidophilius)，或者链球菌属(streptococci)，诸如嗜热链球菌(strep.thermophilus)或乳酸链球菌(strep.lactis)。为了制备开菲尔，典型的发酵剂培养物包含乳酸链球菌、乳脂链球菌(strep.cremoris)、几种酵母菌种和其他乳酸细菌的混合物。

附图说明

图1：在体外胃模型中分析不同的测试酸奶。详细信息请参见实例2。

图2：实例3的产品a、b和c、d的生产过程的直观图示。

图3：说明添加乳清蛋白可以以溶液或干燥粉末的形式进行

图4：摄入添加了变性形式(三角形；对比样品)或天然蛋白质(圆形；根据本发明)的乳清蛋白的酸奶之后，血液中的总必需氨基酸(eea)浓度随时间推移的变化。详细信息请参见实例4。

图5：在体外胃模型中分析不同的测试软干酪。圆圈代表酪蛋白/乳清蛋白的比率为20∶80的参照软干酪。正方形代表本发明的富含乳清蛋白的软干酪(酪蛋白/乳清蛋白的比率为50∶50)。曲线显示了液相中的蛋白质的百分比随时间的变化。详细信息请参见实例5。

图6：在体外胃模型中分析受测试的不同希腊风味酸奶(蛋白质为8.8％，并且乳清蛋白/酪蛋白的比率为40∶60)；圆圈代表天然的富集样品，正方形代表变性的富集参照样品(详细信息请参见实例6)。该图展示了液相中的蛋白质的百分比随时间的变化。

实验部分

实例1：胃消化模型系统

使用已建立的体外消化胃模型获得蛋白质消化数据。鉴于液体通过胃的传输时间比(半)固体的传输时间快得多，因此快速排空的液体部分(或液相)中的蛋白质的量是快速消化的关键因素。

胃期

-准备380ml模拟胃液：

ο243.2mlsgf电解质储备溶液；

ο在sgf电解质储备溶液中配制的60.8ml25,000u/ml猪胃蛋白酶储备溶液(来自猪胃粘膜的胃蛋白酶，3,200至4,500u/mg蛋白质，西格玛公司(sigma))；

ο190μl的0.3mcacl2；

ο1900μl的1mhcl，以达到ph3.0；

ο73.9ml水。

-启动applikonadi1010(控制器)和adi1025(发酵罐)，在发酵罐中用移液管移取350ml样品，标准化为3.3wt％的蛋白质浓度。将样品加热至37℃。搅拌棒可以设置为100rpm。

-将350mlsgf添加到350ml样品中。

-取第一个样品并启动ph分布。这给出了adi1010按照表1所描绘的设定ph曲线添加1mhcl的起始信号。所有测试样品的下降斜率都是相同的。确保记录了hcl的添加量。

表1：ph曲线

表2：成人体外消化模型的测试设置

在消化过程中，在测试系列期间取样(每个取样点通常1*50ml)进行分析。由于ph可能略有不同，所以基于时间点而不是基于ph来取样。在取50ml样品的同时拍摄发酵罐的照片。在滤纸上取样后立即过滤样品。

将观察结果写在日志中。将样品分开用于不同的分析。如下灭活样品中存在的酶：

1)将过滤后的50ml样品置于冰上冷却。

2)使用凯氏定氮分析法(kjeldahlnitrogenanalysismethod)对每个样品中的蛋白质含量进行分析。

实例2：示例性酸奶的消化率

材料：

脱脂奶粉(smp)从promex(菲仕兰坎皮纳公司乳粉(frieslandcampinamilkpowder))获得

乳清蛋白浓缩物(nutriwhey800f)是从菲仕兰坎皮纳公司dmv获得的酸wpc，按干物质计含有80％的蛋白质

所用的发酵剂培养物是yomix860(杜邦公司(dupont))

方法：

由表3所示的组成生产了一系列酸奶(所有量均以百分比表示)：

表3：酸奶组成

各个样品的生产方法的细节汇总如下：

关于酸奶样品1、2和5的生产：

·将脱脂乳标准化为0％脂肪；3.4％蛋白质

·将乳称量到桶中，然后将桶放入7℃的水浴中

·将smp(对于样品1和2、3和4)或wpc(样品5)轻轻地添加到乳中，充分搅拌，以避免结块

·混合约1小时，直到所有粉末均充分溶解并水合

·在85℃下巴氏灭菌10min

·冷却至5℃

·使用无菌移液管将发酵剂培养物接种到乳中

·在39℃下发酵12至15小时，直到ph≤4.3

·首先用刮刀轻轻地破坏酸奶的凝胶结构

·在冷却至7℃的同时，用螺旋桨式搅拌器以700至800rpm的速度搅拌酸奶。冷却时间约30min

·填充到500mlpe烧杯中

关于样品3和样品4的生产：

·将脱脂乳标准化为0％脂肪；3.4％蛋白质

·将乳称量到桶中，然后将桶放入7℃的水浴中

·将smp轻轻地添加到乳中，充分搅拌，以避免结块

·混合约1小时，直到所有粉末均充分溶解并水合

·在85℃下巴氏灭菌10min

·开始冷却至5℃

·在单独的桶中，将3.6％wpc溶解在36.1％水中(轻轻地充分搅拌，以避免结块)，并将该溶液混合1小时以使蛋白质能够水合(对于样品3，该溶液按原样使用，而对于样品4，将其加热至85℃维持10分钟)

·在冷却该乳的同时，在≤39℃下将wpc溶液(样品3未加热，样品4已加热)添加到乳中并轻轻搅拌

·使用无菌移液管将发酵剂培养物接种到乳中

·在39℃下发酵12至15小时，直到ph≤4.3

·首先用刮刀轻轻地破坏酸奶的凝胶结构

·在冷却至7℃的同时，用螺旋桨式搅拌器以600至700rpm的速度搅拌酸奶。冷却时间约30min

·填充到500mlpe烧杯中

准备酸奶样品，用于在体外胃模型中分析。这些样品的组成示于表4中。

表4：准备用于在体外胃模型中分析的样品的组成

在上述5个样品中的每个样品中，在体外胃模型中分析了350ml。将这些样品标准化为3.3wt％的蛋白质浓度

图1中的数据显示，高天然乳清蛋白酸奶(样品3)构成(体外)胃中的液相中的最高蛋白质部分。由于液体通过胃的传输时间较短，因此该组成可能导致小肠中蛋白质的更快增加，由此导致更快的消化。通过在加热之前将乳清添加到乳中(样品5)或在加热之后单独添加变性乳清(样品4)来增加酸奶的亮氨酸含量，导致液相中的蛋白质含量降低；甚至比乳清蛋白∶酪蛋白的比率为20∶80的参照酸奶(样品1和样品2)还低。此外，包含变性乳清蛋白的酸奶(样品4和样品5)具有不期望的坚硬和凝胶状稠度。

实例3：不同酸奶的消化率

样品制备

在该实例中，将本发明的两种发酵营养组合物(样品c和样品d)的消化率与两种已知的富含蛋白质的酸奶(参照样品a和参照样品b)进行了比较。所用材料在实例2中描述，组成在表5中示出。

表5：组成

关于样品a和样品b的生产(另请参见图2)：

·将脱脂乳标准化为0％脂肪；3.4％蛋白质

·将乳称量到桶中，然后将桶放入7℃的水浴中

·将smp(对于样品a)或smp和wpc(样品b)轻轻地添加到乳中，充分搅拌，以避免结块

·混合约1小时，直到所有粉末均充分溶解并水合

·在85℃下巴氏灭菌10min

·冷却至5℃

·使用无菌移液管将发酵剂培养物接种到乳中

·在39℃下发酵12至15小时，直到ph≤4.3

·首先用刮刀轻轻地破坏酸奶的凝胶结构

·在冷却至7℃的同时，用螺旋桨式搅拌器以700至800rpm的速度搅拌酸奶。冷却时间约30min

·填充到500mlpe烧杯中

关于样品c的生产(另请参见图2)：

·将脱脂乳标准化为0％脂肪；3.4％蛋白质

·将乳称量到桶中，然后将桶放入7℃的水浴中

·将smp轻轻地添加到乳中，充分搅拌，以避免结块

·混合约1小时，直到所有粉末均充分溶解并水合

·在85℃下巴氏灭菌10min

·开始冷却至5℃

·在单独的桶中，将wpc溶解在水中(轻轻地充分搅拌，以避免结块)，并将该溶液混合1小时以使蛋白质能够水合

·在冷却该乳的同时，在≤39℃下将wpc溶液添加到乳中并轻轻搅拌

·使用无菌移液管将发酵剂培养物接种到乳中

·在39℃下发酵12至15小时，直到ph≤4.3

·首先用刮刀轻轻地破坏酸奶的凝胶结构

·在冷却至7℃的同时，用螺旋桨式搅拌器以600至700rpm的速度搅拌酸奶。冷却时间约30min

·填充到500mlpe烧杯中

关于样品d的生产(另请参见图2)：

·将脱脂乳标准化为0％脂肪；3.4％蛋白质

·将乳称量到桶中，然后将桶放入7℃的水浴中

·将smp轻轻地添加到乳中，充分搅拌，以避免结块

·混合约1小时，直到所有粉末均充分溶解并水合

·在85℃下巴氏灭菌10min

·开始冷却至5℃

·在冷却时，在≤39℃下将wpc轻轻地添加到乳中，充分搅拌，以避免结块。注意不要混入空气。

·混合约1小时，直到所有粉末均充分溶解并水合

·使用无菌移液管将发酵剂培养物接种到乳中

·在39℃下发酵12至15小时，直到ph≤4.3

·首先用刮刀轻轻地破坏酸奶的凝胶结构

·在冷却至7℃的同时，用螺旋桨式搅拌器以600至700rpm的速度搅拌酸奶。冷却时间约30min

·填充到500mlpe烧杯中

测试设置

所有测试样品(参见表6)均在体外胃模型(参见实例1)中在胃条件下温育，以便沿循液相中的蛋白质的量随(体外)胃中的时间的变化。将这些样品标准化为3.3wt％的蛋白质浓度。

表6：450ml酪蛋白样品的组成

结果示于图3中。结果说明，当仅通过向乳中添加来自乳清的附加的非凝结球状蛋白来制备具有增加的乳清蛋白的酸奶(b)时，与参照高蛋白酸奶(a)相比，液相中的蛋白质的量降低。相比之下，当使添加的乳清蛋白保持天然时，液相中的蛋白质的量明显增加(c和d)。显然，对于根据本发明的样品c和样品d，在所有时间点，溶液中蛋白质的量均高于参照样品。因此，天然的非凝结蛋白是作为干燥粉末还是作为溶液添加并没有区别。

实例4：示例性酸奶组合物的消化率

本实例示出了摄入高蛋白酸奶组合物之后血液中的氨基酸分布的分析。

为此，在健康的男性和女性(年龄18至65岁)中进行了随机单盲交叉试验，以便比较摄入包含在417克根据上文实例3的产品b(比较样品)或产品d(本发明)中的固定量蛋白质(25克)之后的餐后血液氨基酸浓度。

摄入产品之后，消耗了283克水以匹配700ml的总体积

在禁食状态以及摄入产品之后15、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240和300分钟采集血样。随后使用phenomenexez：faast氨基酸试剂盒(https：//www.phenomenex.com/products/aminoaciddetail/ezfaast)分析血清样品中20种氨基酸的浓度。数据示于图4中。

出乎意料的是，发现与参照产品b相比，根据本发明的包含天然乳清蛋白的产品d在血液中的必需氨基酸中具有更高的峰值，而两者具有相同的蛋白质组成。重复测量血液中的氨基酸动力学，证实样品b和样品d的总必需氨基酸(eea；参见图4)之间以及总氨基酸(数据未示出)之间存在显著(p≤0.05)差异。

实例5：示例性软干酪组合物的体外消化

常规的低脂(普通)软干酪含有约10w％的蛋白质，乳清蛋白与酪蛋白的比率为20∶80。该实例表明，本发明也适用于软干酪组合物。如下制备富含天然乳清蛋白的软干酪(其最终的乳清蛋白与酪蛋白的比率为50∶50)：

1.将低脂商业天然软干酪(在50ml管中)在20℃下以5000xg离心20分钟以分离酸乳清。

2.将天然乳清蛋白浓缩物(wpc80)溶解在酸乳清中，使蛋白质的最终水平达到10w％。为此，在室温下，在用磁力搅拌器搅拌下，将12.5gwpc80粉末逐渐添加到87.5g酸乳清中。

3.将75g该wpc悬浮液与125g初始天然软干酪混合，以便获得相同的最终蛋白质含量，但乳清蛋白/酪蛋白的比率增加。

纯的初始软干酪用作对照样品

使这样获得的两个样品：

-参照软干酪20∶80-低脂软干酪；蛋白质为10％，乳清蛋白/酪蛋白的比率为20∶80

-富集的软干酪50∶50-富含乳清蛋白的软干酪；蛋白质为10％，乳清蛋白/酪蛋白的比率为50∶50，

经受实例1的体外消化分析。

图5示出，在消化的至少最初30分钟期间，液相(即，可以通过过滤器的液体)中的蛋白质的量高于未添加天然乳清蛋白的软干酪的蛋白质的量。

实例6：示例性希腊风味酸奶组合物的体外消化

希腊风味酸奶是一种被浓缩为使得具有高蛋白(8.77w％)浓度(标准乳清蛋白/酪蛋白的比率为20∶80)的酸奶。在该实例中，由这种希腊风味酸奶制备了两种富含乳清蛋白的组合物；一者中添加的乳清蛋白是天然的，另一者中添加的乳清蛋白是变性的。

标准希腊风味酸奶的制备方式如下：

-将脱脂乳(大约3.5w％蛋白质)在92℃下巴氏灭菌6分钟，冷却至发酵温度42℃，添加酸奶培养物，然后发酵，直到ph为4.4

-用分离器(离心以除去血清)浓缩该酸奶，直到蛋白质含量为8.8w％，随后冷却并填充产品。

-对于该实例，将血清储存以用于乳清蛋白富集

对于该实例，如下所述使该希腊风味酸奶富含乳清蛋白：

1.将wpc80以8.8％的蛋白质水平溶解在血清(酸乳清)中。为此，在室温下，在用磁力搅拌器搅拌的同时，将54.6gwpc80粉末逐渐添加到445g血清(从对该酸奶的离心中保留下来的)中。让该混合物水合至少2小时。

2.将250g这种wpc溶液与750g希腊风味酸奶混合，以便在相同的8.8w％蛋白质含量下获得增加的40∶60的乳清蛋白/酪蛋白比率。

3.将在点2处获得的混合物分成两半；将一半样品按原样用作“天然富集”样品，并且将另一半样品加热以变成“变性富集”样品。

4.对于“变性富集”样品，将水浴设定在95℃，一旦水浴变热，就将装有产品的瓶子浸入水浴中，并将产品保持在高于83℃的温度持续5分钟。

使获得的两个样品：

-天然富集希腊风味酸奶；蛋白质为8.8w％，乳清蛋白/酪蛋白的比率为40∶60

-变性富集希腊风味酸奶；蛋白质为8.8w％，乳清蛋白/酪蛋白的比率为40∶60，

经受实例1的体外消化。图6示出，在整个消化过程期间，天然富集样品的液相(能够通过滤纸)中的蛋白质的量比变性富集实例的高。