本发明涉及牡蛎产品加工领域，具体涉及一种具有改善微循环功效的牡蛎粉的制备方法。
背景技术：
微循环是微动脉与微静脉之间的脉管网络，对机体的能量代谢和组织器官功能的调节起重要作用，微循环可以调节微血管生理从而避免毛细血管静水压力波动过大，在确定机体的外周阻力中发挥重要作用。当微循环出现血液流速减慢，微血管畸形，管腔狭窄等异常改变时会出现不同程度的微循环障碍。通常微循环障碍分为结构障碍和功能障碍两大类，微循环障碍以微血管病变为基础，与心脑血管疾病的发生、发展密切相关，且微循环障碍是心、脑、肾等靶器官损害的重要基础及加重因素，在这种病理情况下，将严重影响机体组织的物质交换和器官的正常功能。
牡蛎(ostrea)又名生蚝，营养价值高，蛋白质含量高，氨基酸含量丰富且均匀，有“海洋牛奶”之称。牡蛎肽是指通过化学或生物方法对牡蛎本身含有的蛋白质进行水解或降解得到的多肽，牡蛎肽相对分子量小，与蛋白质相比，更易吸收和利用。
常用的牡蛎肽制备方法以酶解法为主，包括单一酶解法，复合酶解法，多酶分布酶解法，酶解水解结合法等。不同方法制备得到的牡蛎肽分子量分布不同，也带来不同的功效。目前已报道的牡蛎肽的生物活性包括免疫调节、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降血压、抗氧化和抗衰老等，这多功效和改善微循环障碍至今存在一定的联系。
中国专利申请cn111334549a公开了一种牡蛎肽及牡蛎肽提取方法，以新鲜无壳牡蛎为原料，经过鲜蛎肉专用蛋白酶酶解提取牡蛎肽，把牡蛎生物酶水解后变成全部可溶于水的活性成分，产品小肽含量高，再经过活性炭去味，改进牡蛎肽的口感，更有利于牡蛎活性成分的吸收和利用。该牡蛎肽及牡蛎肽提取方法，操作简单、蛋白质降解效果好、牡蛎肽得率高、感官接受度较高的优势，易于工业化规模生产，得到的牡蛎肽的分子量分布均匀，通过生物酶解技术，把牡蛎通过生物酶水解后变成全部可溶于水的活性成分，吸收完全而迅速，产品小肽含量高，更有利于牡蛎活性成分的吸收和利用；经过活性炭去味后牡蛎肽在口感上更易被接受。
中国专利申请cn109825545a公开了一种牡蛎低聚肽冻干粉的制备方法，包括如下步骤：牡蛎浆液经预处理后，先采用碱性蛋白酶进行酶解，然后再采用中性蛋白酶foodpropnl和风味蛋白酶lap进行酶解；将酶解液离心，将所得上清液进行超滤，然后将滤过液浓缩、层析；将层析后的物料采用真空冷冻干燥技术进行冻干、粉碎。本发明采用可持续的分步酶解方法，使牡蛎酶解的更彻底，提高了原料利用率，并改善产品口感；本发明将真空冷冻干燥和超微粉碎技术结合起来用于牡蛎低聚肽的制备，既可以保全其活性成分，又可以提高其生物利用率。
中国专利申请cn109504732a公开了一种牡蛎活性肽的制备方法，包括以下步骤：1)牡蛎肉的预处理；2)蛋白质的提取；3)将提取的蛋白质以1:8～15g/ml的料液比加至蒸馏水中，该蒸馏水中含有质量浓度0.5～0.7％的蛋白酶，在45～55℃的恒温水浴锅中酶解3～5小时，酶解过程中保持震摇，之后水浴加热至90℃灭酶，离心，取上清，得到酶解液；4)用体积浓度70％的乙醇溶液醇沉酶解液，冷冻干燥，即得到牡蛎活性肽。本发明制备的牡蛎活性肽的纯度高，生物活性强，其分子量5000da以下小分子多肽的占比高达56.51％以上，更有利于人体吸收。该牡蛎活性肽可有效抑制α-淀粉酶和超氧阴离子并有效清除dpph·，具有良好的降糖活性和抗氧化活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有改善微循环功效的牡蛎粉的制备方法，所述制备方法制备的牡蛎活性肽具有小分子醇类进行封端，可以延长活性物质在体内的代谢时间，延长功效。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种具有改善微循环功效的牡蛎粉的制备方法，包括以下步骤：
s1：将洗净的牡蛎肉加水，超声破碎得浆液a。
s2：在浆液a中加入正己烷萃取脱脂，弃去正己烷相，得浆液b；
s3：在浆液b中加入阿拉伯糖和干性酵母进行脱腥，得浆液c；
s4：调节浆液c的ph＝6-8，加入中性蛋白酶进行酶解、灭酶、离心得酶解液；
s5：将酶解液浓缩、干燥得多肽粉a，加入硫酸的乙醇溶液进行醇解，得醇解液；
s6：将醇解液浓缩，超滤，滤渣干燥、磨粉即得所述牡蛎粉。
进一步地，s1中，加水量为牡蛎肉质量的10-15倍，超声频率为20-25hz。
进一步地，s2中，所述萃取是加入牡蛎肉质量10-15倍的正己烷，萃取2-3次。
进一步地：s3中，阿拉伯糖的添加量为牡蛎肉的1％-2％，干性酵母的添加量为牡蛎肉的0.3％-0.5％。
进一步地，s4中，反应液中，以牡蛎肉为基准，中性蛋白酶的添加量为1000-1500u/g。
进一步地，s4中，所述酶解温度为30-40℃。
进一步地，s4中，所述酶解时间为5-8h。
进一步地，s4中，所述酶解的终点为酶解液中多肽的平均分子量为3k-5kda。
进一步地，s5中，所述硫酸的乙醇溶液中，硫酸的质量浓度为2-4％。
进一步地，s5中，所述硫酸的乙醇溶液质量为多肽粉a质量的20-30倍。
进一步地，s5中，所述醇解的反应温度为70-90℃。
进一步地，s5中，所述醇解的反应时间为3-5h。
进一步地，s5中，所述醇解的反应终点为醇解液中小分子肽的平均分子量为0.5k-1kda。
进一步地，s6中，所述超滤使用截留分子量为200-300的超滤膜。
进一步地，s6中，所述超滤时，使用-10-0℃的乙醇洗涤滤渣至滤液ph＝6-7。
本发明的优势在于：
1.本发明的制备方法制备得到的牡蛎粉可以有效改善微循环障碍，在高血压、糖尿病、以及职业环境如高温、噪音等导致的微循环障碍中具有较好的应用前景。
2.本发明的制备方法制备牡蛎粉中以小分子牡蛎肽为主，由乙醇进行封端，在经过口服进入体内后，延缓降解速率，延长体内代谢是时间，一次服用，可以较长时间地发挥作用。
3.本发明的制备方法制备得到的小分子牡蛎肽，由乙醇进行封端，可以降低产品制成小分子肽粉后的吸水率，延长保存时间。
4.本发明采用酶解和醇解两步复合处理牡蛎，通过检测酶解反应和醇解反应的分子量来检测反应终点，得到的小分子量的多种化合物的混合，并且这些化合物由乙醇封端，在对抗微循环障碍中具有较好的效果。
具体实施方式
本发明所使用的牡蛎是来源于山东的乳山牡蛎。
本发明中的平均分子量通过凝胶渗透色谱(gpc)进行分析和计算。
实施例1
一种具有改善微循环功效的牡蛎粉的制备方法，包括以下步骤：
s1：将洗净的牡蛎肉中加15倍重量的水，20khz超声下，破碎2h，得浆液a。
s2：在浆液a中加入牡蛎肉15倍重量的正己烷，萃取2次脱脂，弃去正己烷相，得浆液b；
s3：在浆液b中加入牡蛎肉1％重量的阿拉伯糖和0.3％重量的干性酵母进行脱腥，得浆液c；
s4：调节浆液c的ph＝6，以牡蛎肉质量为基准，加入中性蛋白酶的量为1000u/g，在35℃进行酶解5h、灭酶、离心得酶解液；此时检测酶解液中多肽的平均分子量约为4.8kda；
s5：将酶解液浓缩、干燥得多肽粉a，加入多肽粉质量20倍的3％硫酸乙醇溶液，升温至80℃，反应3h，得醇解液，检测得小分子肽的平均分子量为0.78kda；
s6：将醇解液浓缩，使用截留分子量为300da的超滤膜进行超滤，滤渣使用-10℃的乙醇洗涤至滤液ph＝7，滤渣干燥即得所述牡蛎粉。
实施例2
一种具有改善微循环功效的牡蛎粉的制备方法，包括以下步骤：
s1：将洗净的牡蛎肉中加10倍重量的水，25khz超声下，破碎4h，得浆液a。
s2：在浆液a中加入牡蛎肉10倍重量的正己烷，萃取3次脱脂，弃去正己烷相，得浆液b；
s3：在浆液b中加入牡蛎肉1％重量的阿拉伯糖和0.5％重量的干性酵母进行脱腥，得浆液c；
s4：调节浆液c的ph＝6，以牡蛎肉质量为基准，加入中性蛋白酶的量为1300u/g，在35℃进行酶解8h、灭酶、离心得酶解液；此时检测酶解液中多肽的平均分子量约为3.3kda；
s5：将酶解液浓缩、干燥得多肽粉a，加入多肽粉质量30倍的4％硫酸乙醇溶液，升温至80℃，反应5h，得醇解液，检测得小分子肽的平均分子量为0.53kda；
s6：将醇解液浓缩，使用截留分子量为200da的超滤膜进行超滤，滤渣使用0℃的乙醇洗涤至滤液ph＝6，滤渣干燥即得所述牡蛎粉。
实施例3
一种具有改善微循环功效的牡蛎粉的制备方法，包括以下步骤：
s1：将洗净的牡蛎肉中加12倍重量的水，22khz超声下，破碎3h，得浆液a。
s2：在浆液a中加入牡蛎肉15倍重量的正己烷，萃取2次脱脂，弃去正己烷相，得浆液b；
s3：在浆液b中加入牡蛎肉1％重量的阿拉伯糖和0.3％重量的干性酵母进行脱腥，得浆液c；
s4：调节浆液c的ph＝8，以牡蛎肉质量为基准，加入中性蛋白酶的量为1500u/g，在35℃进行酶解5h、灭酶、离心得酶解液；此时检测酶解液中多肽的平均分子量约为4.2kda；
s5：将酶解液浓缩、干燥得多肽粉a，加入多肽粉质量25倍的2％硫酸乙醇溶液，升温至70℃，反应3h，得醇解液，检测得小分子肽的平均分子量为0.96kda；
s6：将醇解液浓缩，使用截留分子量为200da的超滤膜进行超滤，滤渣使用0℃的乙醇洗涤至滤液ph＝6，滤渣干燥即得所述牡蛎粉。
对比例1
和实施例1的区别在于，s4中，增加蛋白酶的用量和作用时间，降低酶解液中肽的平均分子量，没有醇解步骤。
一种牡蛎粉的制备方法，包括以下步骤：
s1：将洗净的牡蛎肉中加15倍重量的水，20khz超声下，破碎2h，得浆液a。
s2：在浆液a中加入牡蛎肉15倍重量的正己烷，萃取2次脱脂，弃去正己烷相，得浆液b；
s3：在浆液b中加入牡蛎肉1％重量的阿拉伯糖和0.3％重量的干性酵母进行脱腥，得浆液c；
s4：调节浆液c的ph＝6，以牡蛎肉质量为基准，加入中性蛋白酶的量为5000u/g，在35℃进行酶解5h、灭酶、离心得酶解液；此时检测酶解液中多肽的平均分子量约为0.73kda；
s5：将酶解液浓缩，使用截留分子量为300da的超滤膜进行超滤，滤渣使用-10℃的乙醇洗涤至滤液ph＝7，滤渣干燥即得所述牡蛎粉。
对比例2
和实施例1的区别在于，不使用酶解，只有醇解步骤。
一种牡蛎粉的制备方法，包括以下步骤：
s1：将洗净的牡蛎肉中加15倍重量的水，20khz超声下，破碎2h，得浆液a。
s2：在浆液a中加入牡蛎肉15倍重量的正己烷，萃取2次脱脂，弃去正己烷相，得浆液b；
s3：在浆液b中加入牡蛎肉1％重量的阿拉伯糖和0.3％重量的干性酵母进行脱腥，得浆液c；
s4：将浆液c浓缩、干燥得多肽粉a，加入多肽粉质量20倍的3％硫酸乙醇溶液，升温至80℃，反应3h，得醇解液，检测得小分子肽的平均分子量＞8kda；
s5：将醇解液浓缩，使用截留分子量为300da的超滤膜进行超滤，滤渣使用-10℃的乙醇洗涤至滤液ph＝7，滤渣干燥即得所述牡蛎粉。
对比例3
和实施例1的区别在于，s4和s5中采用的参数不同。
一种牡蛎粉的制备方法，包括以下步骤：
s1：将洗净的牡蛎肉中加15倍重量的水，20khz超声下，破碎2h，得浆液a。
s2：在浆液a中加入牡蛎肉15倍重量的正己烷，萃取2次脱脂，弃去正己烷相，得浆液b；
s3：在浆液b中加入牡蛎肉1％重量的阿拉伯糖和0.3％重量的干性酵母进行脱腥，得浆液c；
s4：调节浆液c的ph＝5，以牡蛎肉质量为基准，加入中性蛋白酶的量为1000u/g，在35℃进行酶解3h、灭酶、离心得酶解液；此时检测酶解液中多肽的平均分子量约为7.3kda；
s5：将酶解液浓缩、干燥得多肽粉a，加入多肽粉质量20倍的2％硫酸乙醇溶液，升温至80℃，反应3h，得醇解液，检测得小分子肽的平均分子量为2.6kda；
s6：将醇解液浓缩，使用截留分子量为300da的超滤膜进行超滤，滤渣使用-10℃的乙醇洗涤至滤液ph＝7，滤渣干燥即得所述牡蛎粉。
本发明改善微循环的功效通过盐酸肾上腺素诱导的微循环障碍动物模型验证。
实验动物：spf级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22g。
实验方法：分为空白对照组、模型组、实施例1，对比例1、对比例2和对比例3，其中空白对照组和模型组正常饲料喂养，同时每天同一时间灌胃1ml蒸馏水。实施例1，对比例1、对比例2和对比例3各组小鼠正常饲料喂养，同时每天同一时间灌胃给予相应实施例的产品，剂量为1g/kgbw，持续15天。第15天灌胃后1h，小鼠腹腔注射5％水合氯醛(3ml·kg-1)麻醉，将麻醉好的小鼠腹部向下固定在小鼠观察台上，调节耳托高度，使耳廓平展在耳托上，在耳廓表面滴加少许香柏油，将观察台置于显微镜的载物台上，使用医学图像分析系统(bi-2000医学图像分析系统)观察每只小鼠耳廓细动脉、细静脉管径和毛细血管开放数，然后除空白对照组外，其他各组，立即尾静脉注射ad(盐酸肾上腺素)注射液(10mg·kg-1)，5min后，观察小鼠耳廓细动脉、细静脉管径和毛细血管开放数。根据注射ad前后血管状态的变化判断各组产品对抗微循环转障碍的效果。注射ad前后血管状态变化越小，则效果越好。实验结果见表1。
表1各实验组小鼠血管变化情况(
和模型对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
可以看出，在小鼠持续摄入产品的情况下，进行微循环障碍造模实验中，摄入本申请牡蛎粉的实验组，造模后血管状态变化较小，造模后的血管状态更接近与正常组，而且和模型对照组在个各方面均具有极显著性差异。而对比例各组在造模后，和正常组的血管状态差别较大，和模型组相比，血管状态无法达到各方面均具有极显著性差异的效果，因此可以看出对比例对微循环障碍的抵抗性能较差。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。