一种双功能型豆源多肽及其制备方法

本发明涉及一种双功能型豆源多肽及其制备方法，属于功能多肽技术领域。

背景技术：

随着人们对营养健康以及可持续发展的追求，植物基食品受到越来越多的青睐。作为植物基食品不可或缺的原料，植物蛋白及其衍生物的需求量也呈现持续增长态势。豆类是植物蛋白的主要来源，其蛋白质含量约为20～40％，比禾谷类高1～3倍，比薯类高3～5倍。但天然的豆类蛋白结构复杂而致密，极大限制了其在食品工业中的应用。因此，寻求适宜方法对豆类蛋白进行改性修饰对提高其营养和功能特性具有非常重要的意义。

酶解改性因其安全有效性被广泛应用于食物蛋白改性以提高蛋白质的功能特性或生理活性。酶解反应速度快、安全性高、便于控制、不减弱蛋白质的营养价值，且一定程度上能改善蛋白质的功能性质。此外，蛋白经酶解后生成的多肽类物质通常富含小分子生物活性物质，具有降血压、抗氧化、抗菌、免疫调节等生物活性。这些具有生物活性的多肽类物质不仅为机体提供营养元素，还对维持机体健康具有重要益处。目前我国高血压患者已超3亿，每年新增高血压病例达1000万，而且有明显的年轻化趋势。由此推知，食用具有降血压功效的多肽类物质，有助于预防和辅助控制高血压，从而有效预防和遏制心血管疾病的发生。然而目前多肽类物质的研究多是集中于单一活性的挖掘或是药物应用，关于双功能肽的研究以及其在食品工业中的应用研究相对较少。加之食品加工过程中的热处理过程易影响生物活性物质的结构与功能，因此借助乳液等包埋技术有助于保护活性物质的活性。

乳液技术除用于保护生物活性物质外，还被广泛应用于食品体系中，如饮料、奶油等。氧化变质一直是食品乳液存在的问题，因此选择适宜的乳化剂提高乳液氧化稳定性显得尤为重要。植物蛋白经改性处理产生的多肽通常具有抗氧化等潜能，对维持乳液的氧化稳定性具有重要作用。此外，豆源蛋白结构中含有亲水和疏水性基团，经适当改性修饰后可兼具亲水亲油特性，有助于维持乳液油水界面的稳定。因此，开发一种兼具生物活性和功能特性的豆源多肽乳液是目前食品领域亟待解决的热点话题，这对于植物蛋白的高效可持续发展以及改善居民膳食营养水平具有重要的指导意义。

技术实现要素：

【技术问题】

本发明实际要解决的技术问题是：提供一种同时具有降压活性和抗氧化活性的豆源多肽的制备方法。

【技术方案】

为解决上述问题，本发明以豆类蛋白为原料，采用红外处理，并通过控制性酶解技术和高压均质乳化技术制备双功能型多肽乳液，所述方法制备的乳液为一种新型双功能性植物基产品。

本发明的第一个目的是提供一种双功能型豆源多肽的制备方法，所述方法是先采用碱溶酸沉法从豆类中提取豆源分离蛋白，再对豆源分离蛋白进行红外热处理，最后经蛋白酶酶解得到豆源多肽；所述豆源多肽同时具有降压活性和抗氧化活性的双重功能。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)豆源分离蛋白提取：豆类原料粉碎过筛，加入正己烷脱脂，而后利用碱溶酸沉法提取脱脂豆粉中的蛋白质，冻干得到豆源分离蛋白；

(2)红外处理：将步骤(1)中得到的豆源蛋白进行红外热处理，破坏其分子间作用力使其蛋白结构变性；

(3)多肽制备：将步骤(2)中获得的红外蛋白粉溶于去离子水配置成底物浓度为5～20％并调节ph，加入植物蛋白酶进行酶解反应，反应结束后高温灭酶，离心收集多肽溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述豆类原料为富含蛋白质的黄豆、黑豆、豌豆、红豆或绿豆中的一种或几种。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述脱脂过程中物料与正己烷的比例为1:3～1:10(w/v，g/ml)。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述的碱溶酸沉法具体为：脱脂豆粉溶于去离子水中，氢氧化钠调节溶液ph为7.2～10.5，25～50℃恒温搅拌0.5～4.5h，离心取上清再用盐酸将ph调至2.0～5.5，上述步骤重复2～3次，将沉淀用去离子水洗涤至中性。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述红外处理可对蛋白质进行柔性热加工，破坏蛋白分子间作用力，使其伸展，有助于疏水基团暴露，提高其酶解效率、便于生物活性物质的释放。其中，红外温度为70～140℃，处理时间10～60min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述植物蛋白酶可为无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶一种或几种，添加量为500～5000u/g蛋白粉，最佳反应温度35～65℃，ph4.5～7.5，反应时间0.5～8h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述多肽溶液需低温冷藏；若未能及时使用，多肽溶液需置于-80～-10冷冻储藏。

本发明的第二个目的是提供一种应用上述方法制备得到的双功能型豆源多肽；所述豆源多肽同时具有降压活性和抗氧化活性的双重功能。

本发明的第三个目的是提供一种豆源多肽乳液，所述乳液是以上述双功能型豆源多肽和油相均质混合得到豆源多肽乳液。

在本发明的一种实施方式中，所述油相包括食用动植物油、精油等脂溶性营养物质。

在本发明的一种实施方式中，豆源多肽乳液的制备方法包括以下步骤：

(1)多肽粗乳预制：将上述多肽溶液调节到适宜浓度制成水相溶液，迷迭香提取物溶于植物油制成油相，水相和油相混合，转速8000～25000rpm条件下高速剪切分散5～20min。

(2)多肽乳液制备：将步骤(1)获得的初乳立即进行高压均质机预处理，再经超高压微射流处理，得到多肽纳米乳液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述多肽溶液的蛋白浓度为0.5～100mg/ml，迷迭香提取物的添加量是0.05～0.70g/kg。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述植物油可为菜籽油、玉米油、亚麻籽油、核桃油、橄榄油、葵花籽油、海藻油、牡丹籽油、紫苏油、红花油、茶油。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，水相与植物油的质量比1:1～20:1(v/v)。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述高压均质机的压力设定为(40～150)/(5～50)bar范围，均质后冰水浴迅速降温至2～10℃。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，高压微射流处理的压力为300～1500bar，循环2～6次。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述双功能型豆源多肽或上述豆源多肽乳液的组合物。

本发明的第五个目的是提供一种上述双功能型豆源多肽或上述豆源多肽乳液在制备食品、化妆品中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种双功能型豆源多肽微胶囊粉，其制备方法是将上述获得的多肽乳液进行喷雾干燥处理获得豆源多肽微胶囊粉末。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明提供的双功能型多肽乳液具有以下优势：

(1)本发明涉及一种双功能型豆源多肽乳液及其制备方法，原料天然、安全、健康，来源广泛；整理工艺可归纳为蛋白提取、酶解、乳化，操作过程简单易行，无需大型设备，整个工艺流程绿色安全，对环境友好；成本较低，可实现工业化规模生产，为开发植物基食品配料奠定基础。

(2)本发明制备的多肽乳液具有良好的降血压活性(蛋白浓度5mg/ml多肽，ace抑制率高达92％)，对于预防和控制高血压具有积极作用，具有应用于孕妇、老年人等慢病患者群体的潜力；而且多肽和迷迭香提取物还具有良好的抗氧化性能(dpph自由基清除能力高达100％)，克服现有乳液易氧化变质的问题，可广泛应用于功能性食品或特殊膳食品中。

(3)本发明提供的多肽乳液具有良好的乳化性和乳化稳定性(乳化稳定性超7天)，克服许多蛋白肽乳液稳定性差的缺陷，加之该乳液具有较好的氧化稳定性，存储期较长，具有广阔的市场应用前景。

(4)本发明制备的双功能型多肽乳液可以同时固定疏水性和亲水性的功能因子或营养物质，对于保持生物活性物质的生物活性及营养物质的稳定性具有重要作用，在食品和医药等领域具有潜在应用价值。

附图说明

图1为本发明制备双功能型多肽乳液得工艺流程图。

图2为实施例中多肽粗乳液的显微镜图：(a)黑豆多肽粗乳液；(b)绿豆多肽粗乳液；(c)红豆多肽粗乳液。

图3为实施例1中双功能型黑豆多肽乳液的粒径分布图。

图4为实施例2中双功能型绿豆多肽乳液的粒径分布图。

图5为实施例3中双功能型红豆多肽乳液的粒径分布图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

生物材料：实施例中所用到的无花果蛋白酶购于sigma-aldrich公司，cas号：9001-33-6，酶活为1.5×10⁵u/g；菠萝蛋白酶购于acrosorganics公司，cas号：37189-34-7，酶活为1×10⁵u/g；木瓜蛋白酶购于百灵威公司，cas号：9001-73-4，酶活为2400units/mg。

1、血管紧张素转移酶(ace)抑制活性测定

具体过程如下：

标准曲线制作：马尿酸(ha)溶于0.05m硼酸盐缓冲液(ph8.2，含0.3mnacl)，制备3.125～100μm浓度的ha标准工作液，加入60μl1mhcl和120μl吡啶，再加入60μl苯磺酰氯，混合均匀1min后立即冷却，410nm波长下的吸光值，绘制吸光度值与相应浓度的标准曲线。

ace活性测定：12μl多肽溶液与8μlace或硼酸盐缓冲溶液(0.05m，ph8.3，含0.3mnacl)混合，分别命名为a组和b组，而12μl硼酸盐缓冲溶液与8μlace混合(c组)，混合液与40μl的底物(5mmhhl，硼酸盐缓冲溶液配制)混合，37℃条件下孵化30分钟，随后加入60μlhcl(1m)灭活反应。将120μl吡啶和60μl苯磺酰氯依次加入混合液中，酶标仪410nm下测定吸光值。计算公式如下：

2、抗氧化活性评价

(1)dpph自由基清除能力测定，所述方法如下：

用95％乙醇溶液配置0.1mmdpph，在96孔板中每孔加入50μl酶解液和50μldpph，震摇10s后在室温下反应30min，于517nm波长下测定得到的吸光值为asample；以50μl酶解液和50μl95％乙醇作为对照组，同条件测定其吸光值为asampleblank；以50μldpph和50μl去离子水作为空白组，同条件下测定其吸光值为acontrol，每个样品作3个平行，震摇30s后在室温下反应30min，于517nm波长下测定样品的吸光度。

(2)金属离子螯合能力测定，所述方法如下：

取50μl酶解液于96孔板，依次加入100μl20μm氯化亚铁溶液，100μl0.5mm菲洛嗪溶液混匀，室温静置10min后，于562nm处测定吸光值asample；以50μl去离子水代替酶解液作为参比，同条件下测得吸光值asampleblank；以50μl酶解液与200μl去离子水作为空白，同条件下测得吸光值acontrol。计算公式如下：

3、乳化性质测定

所述方法如下：

采用浊度法测定乳化性及乳化稳定性。15ml样品与5ml植物油混合，室温下20000r/min均质1min，立即吸取50μl底部乳状液与5ml0.1％sds混合，500nm处测吸光值a0。静置60min后按同样方法测定吸光值a1，c设为样品的蛋白浓度，按如下公式计算乳化性及乳化稳定性。

乳化性：

乳化稳定性：

实施例1：一种制备双功能型黑豆多肽的方法

本实施例主要包括以下步骤：

(1)豆源分离蛋白提取：黑豆粉碎过筛，加入3倍体积正己烷脱脂；脱脂黑豆粉溶于去离子水中，氢氧化钠调节溶液ph为9.0，30℃恒温搅拌1.5h，离心取上清再用盐酸将ph调至4.0，上述步骤重复2次，10000rpm离心10min收集蛋白沉淀，将沉淀用去离子水洗涤至中性，最后冷冻干燥即可得到黑豆分离蛋白。

(2)红外处理：将上述获得的蛋白进行红外热处理，红外温度为120℃，处理时间20min。

(3)多肽制备：红外蛋白粉溶于去离子水配置底物浓度12％，并调节ph为6.0，加入2250u/g无花果蛋白酶于60℃恒温反应器中酶解60min，反应结束后高温灭酶，4℃、8000rpm离心15min收集多肽溶液。

对实施例1制备得到的多肽测定ace抑制活性、dpph自由基清除能力和金属离子螯合能力，测定的结果为：ace抑制率为87.35％，dpph自由基清除能力为80.36％，金属离子螯合能力为95.78％。这说明本实施例制备得到的多肽具有较好的降压活性和抗氧化活性。

实施例2：一种制备双功能型绿豆多肽的方法

本实施例主要包括以下步骤：

(1)豆源分离蛋白提取：绿豆粉碎过筛，加入4倍体积正己烷脱脂；脱脂绿豆粉溶于去离子水中，氢氧化钠调节溶液ph为8.5，室温搅拌2h，离心取上清再用盐酸将ph调至4.5，上述步骤重复2次，10000rpm离心10min收集蛋白沉淀，将沉淀用去离子水洗涤至中性，最后冷冻干燥即可得到绿豆分离蛋白。

(2)红外处理：将上述获得的蛋白进行红外热处理，红外温度为100℃，处理时间25min。

(3)多肽制备：绿豆蛋白粉溶于去离子水配置底物浓度10％，并调节ph为7.0，加入2500u/g菠萝蛋白酶于55℃恒温反应器中酶解3h，反应结束后高温灭酶，4℃、8000rpm离心15min收集多肽溶液。

对实施例2制备得到的多肽测定ace抑制活性、dpph自由基清除能力和金属离子螯合能力，测定的结果为：ace抑制率为91.87％，dpph自由基清除能力为84.63％，金属离子螯合能力为98.74％。这说明本实施例制备得到的多肽具有较好的降压活性和抗氧化活性。

实施例3：一种制备双功能型红豆多肽的方法

本实施例主要包括以下步骤：

(1)豆源分离蛋白提取：红豆粉碎过筛，加入4倍体积正己烷脱脂；脱脂红豆粉溶于去离子水中，氢氧化钠调节溶液ph为9.0，室温搅拌2h，离心取上清再用盐酸将ph调至4.3，上述步骤重复2次，10000rpm离心10min收集蛋白沉淀，将沉淀用去离子水洗涤至中性，最后冷冻干燥即可得到红豆分离蛋白。

(2)红外处理：将上述获得的蛋白进行红外热处理，红外温度为100℃，处理时间20min。

(3)多肽制备：红豆蛋白粉溶于去离子水配置底物浓度10％，并调节ph为6.5，加入4000u/g木瓜蛋白酶于55℃恒温反应器中酶解4h，反应结束后高温灭酶，4℃、8000rpm离心15min收集多肽溶液。

对实施例3制备得到的多肽测定ace抑制活性、dpph自由基清除能力和金属离子螯合能力，测定的结果为：ace抑制率为92.55％，dpph自由基清除能力为81.39％，金属离子螯合能力为94.31％。这说明本实施例制备得到的多肽具有较好的降压活性和抗氧化活性。

实施例4：一种豆源多肽乳液的制备

以实施例1-3制备得到的豆源多肽为原料，制备豆源多肽乳液，包括如下步骤：

(1)多肽粗乳预制：将多肽溶液的蛋白浓度调节为5mg/ml作为水相溶液，0.15g/kg迷迭香提取物溶于葵花籽油制成油相，水相和油相混合，质量比是4:1，于转速20000rpm条件下高速剪切分散5min。

(2)多肽乳液制备：上述获得的初乳立即在150/30bar压力下进行高压均质机预处理，均质结束后立即用冰水浴迅速降温至5℃，再经超高压微射流处理，压力为1000bar，循环3次，获得相应的多肽纳米乳液。

实施例1制备得到的黑豆多肽乳液的结果如下：

对步骤(1)中得到的多肽粗乳测定乳化特性并观察微观形态，测定的结果为：乳化指数为24.17m²/g，乳化稳定性为983.94min，乳液均匀分布，粒径维持在10μm左右(附图2a)。

对步骤(2)中得到的多肽纳米乳液测定粒径以及稳定性，测定的结果为：多肽纳米乳液的平均粒径为311.47nm，存储8d后乳液平均粒径406.09nm，乳液保持相对稳定，次级氧化产物抑制率高达88.61％，氧化稳定性良好(附图3)。

实施例2制备得到的绿豆多肽乳液的结果如下：

对步骤(1)中得到的多肽粗乳测定乳化特性并观察微观形态，测定的结果为：乳化指数为52.45m²/g，乳化稳定性为4686.63min，乳液均匀分布，粒径维持在5μm左右(附图2b)。

对步骤(2)中得到的多肽纳米乳液测定粒径以及稳定性，测定的结果为：多肽纳米乳液的平均粒径为261.17nm，存储8d后乳液平均粒径311.47nm，乳液保持相对稳定，次级氧化产物抑制率高达90.33％，氧化稳定性良好(附图4)。

实施例3制备得到的红豆多肽乳液的结果如下：

对步骤(1)中得到的多肽粗乳测定乳化特性并观察微观形态，测定的结果为：乳化指数为21.85m²/g，乳化稳定性为897.63min，乳液均匀分布，粒径维持在15μm左右(附图2c)。

对步骤(2)中得到的多肽纳米乳液测定粒径以及稳定性，测定的结果为：多肽纳米乳液的平均粒径为370.13nm，存储8d后乳液平均粒径495.60nm，乳液保持相对稳定，次级氧化产物抑制率高达86.27％，氧化稳定性良好(附图5)。

实施例5：一种豆源多肽微胶囊粉末的制备

将实施例4中的豆源多肽乳液进行喷雾干燥，进口温度140℃，出口温度75℃，干燥后获得多肽微胶囊粉末，偏乳白色，颗粒大小均一，氧化稳定性良好。

对比例1：

参照实施例1的方法制备黑豆多肽，区别在于，调整红外处理前后顺序，对黑豆粉先进行红外处理，再进行碱溶酸沉，其他条件同实施例1。制备得到的黑豆多肽的ace抑制率为4.29％，dpph自由基清除能力为62.31％，金属离子螯合能力为70.08％。且以该黑豆多肽制备的乳液不稳定，次级氧化产物抑制率仅为12.56％，氧化稳定性极差。

对比例2：

参照实施例2的方法制备黑豆多肽，区别在于，调整红外处理条件，其他条件同实施例1，结果表1。

表1不同红外条件对多肽功能的影响

总结分析表中数据可以发现，红外处理温度过高、时间过长，豆源蛋白结构被严重破坏，ace抑制率和抗氧化活性均受到限制；红外处理温度过低、时间过短，蛋白酶无法有效酶解豆源蛋白片段，获得的具有ace抑制以及抗氧化活性的肽段较少。因此，优选地，红外温度为70～140℃，处理时间10～60min。

对比例3：

参照实施例1的方法制备黑豆多肽，区别在于，省略红外处理，其他条件同实施例1。

对比例4：

参照实施例1的方法制备黑豆多肽，区别在于，不添加蛋白酶，其他条件同实施例1。

对比例5：

参照实施例4的方法制备黑豆多肽乳液，区别在于，不经超高压微射流处理，其他条件同实施例4。

表2不同处理对黑豆源多肽乳液的影响对比

总结分析表中数据可以发现，无红外处理的豆源蛋白处于球状折叠结构，蛋白酶无法有效水解，制备得到的肽段分子量偏大，获得的具有ace抑制以及抗氧化活性的肽段明显较少，从而影响乳液粒径和氧化稳定性；无蛋白酶的酶解作用，豆源蛋白无法有效生产活性肽段；纳米乳液制备过程无超高压微射流处理，制备得到的纳米乳液粒径偏大，稳定性差，从而影响肽和迷迭香提取物在油水相的分布，进而影响其氧化稳定性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。