用于培养微生物的坚实的固体培养基的制备方法

文档序号:541258阅读:1232来源:国知局
专利名称:用于培养微生物的坚实的固体培养基的制备方法
技术领域
本发明涉及医学和生物学领域,更确切地说是关于制备以合成凝胶为基的培养各种微生物的坚实的固体培养基的方法。
按照所提供的方法所制备的固体培养基可用于各种微生物学的目的。
在生理盐水中使重量比为0.5-40.0∶2.5-12.0的丙烯酰胺与N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺进行自由基共聚至生成聚丙烯酰胺凝胶以制备为医学和生物学目的的坚实的固体培养基的方法是已知的。所得含最大水量的凝胶用生理盐水洗涤并用营养基质浸泡。(U.S.A.977466)。
所得的固体培养基用于研究微生物的生物特性。然而这种固体培养基的特点是在其上灭菌和接种微生物时对表层具有高损伤性,用细菌环剥离菌落时也一样。在重复接种情况下剥离微生物是用生理盐水冲洗的方法实现,而这在多数微生物培养中是不采用的。
同样已知如下制备培养微生物的固体培养基的方法在生理盐水中使重量比为15-20∶0.019-0.132的丙烯酰胺与N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺进行自由基共聚至生成聚丙烯酰胺凝胶。所得凝胶用生理盐水洗涤,然后于50-60℃将其于生理盐水中溶胀16-20小时。然后将聚丙烯酰胺凝胶用营养基质浸泡(DE,A,3430316.2)。
所得固体培养基用于培养微生物。它是具有弹性的,透明的,并有良好的粘性。微生物培养物分布在它的表面上,在它的内部不生长,用细菌环可完全地剥离。然而在培养皿中保存及在培养的过程中在这种固体培养基表面观察到有液体渗出,并且在恒温器中长时间干燥也不消失。除此之外,在上述培养基上某些种类的微生物(其中包括运动类型)在特性形态的、生物化学的、抗原的特性方面不能进行菌落的典型生长。这限制了上面所述的培养基的使用,如用于传染病的诊断。
本发明的任务在于提供引入聚丙烯酰胺凝胶补助结聚剂制备固体培养基的方法,这种培养基给具有典型的生物特性的广谱微生物提供生长的可能性。
任务以提出下述培养微生物的固体培养基的制备方法完成。本方法包括丙烯酰胺与N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺重量比为(15-20)∶(0.019-0.032)于生理盐水中进行自由基共聚至生成凝胶,该凝胶在生理盐水中洗涤并溶胀,用营养基质浸泡,根据本发明,本方法中的自由基共聚在有聚乙烯醇的存在下进行,丙烯酰胺与聚乙烯醇之重量比为(15-20)∶(1.0-3.0)。
可用水溶液态的聚乙烯醇。
配制丙烯酰胺,N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺,引发剂,聚乙烯醇在含有0.8-0.9重量%氯化钠的生理盐水中的溶液。使用N,N′-四甲基乙二胺和过硫酸铵作为引发剂。作为生理盐水可以使用Рuнгер-Пока溶液,Эрпа溶液,Хэнкса溶液。
从溶液配制含丙烯酰胺,N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺和聚乙烯醇重量比为(15-20)∶(0.019-0.132)∶(1.0-3.0)之反应混合物。将反应混合物加入反应器并进行自由基共聚至生成园片形聚丙烯酰胺凝胶。已知,具有高含水量的凝胶体系很不稳定。于制备过程中所达到的聚合物-液相平衡于不同因素(例如温度、湿度)影响下被破坏。因此必须对所制得的丙烯酰胺凝胶进行稳定,这种稳定通过在制备过程中对凝胶进行辅助结聚来实现。为此向反应混合物中加入聚乙烯醇,以水溶液形式加入更好,以改善它在反应混合物物料中的分布。聚乙烯醇在水中或在生理盐水中的溶液本身就是结聚液体。
在共聚和生成凝胶的过程中构成了相互渗透的聚合网络,致使凝胶系统稳定,在这种情况下凝胶保持亲水性很重要。
聚乙烯醇(пвс)的量视基体的时间稳定性和在该基体上所制备的培养基上生长的运动类型微生物的特性菌落结构的保持而定。加入пвс的量较上述的少,对基体的必须的稳定将是不够的,加入пвс的量较上述的多,基体失去透明性,这是不期望的。这样,在反应混合物中пвс的量少于1克不能使基体稳定,于37℃在恒温器中培养的时间过程中在基体表面观察到了液体渗出,在这种基体上运动类型微生物在保持其它的特性情况下不进行典型的菌落生长。
在反应混合物中пвс的量多于3克使基体稳定到导致获得很硬的基体,这是不期望的。在这样的基体上所制得的固体培养基表面非常干燥,在用细菌环接种时会受到损伤。在这种培养基上培养出的微生物有非典型的生长,不易从培养基表面剥离。
所得凝胶用作制备固体培养基的基体。为此园片用生理盐水洗涤并进行溶胀至重量增加到3.5-5倍。这赋于培养基弹性和坚实性,与琼脂培养基相近。这样制得的聚丙烯酰胺凝胶用营养基质浸泡。作为营养基质可用Хоттuнгер胰蛋白重煮,肉汁和其它。然后将培养基进行灭菌,干燥并接种被试微生物。
所得固体培养基具有稳定的结构和良好的粘性、弹性和良好的透明性,并确保各种(其中包括运动类型)微生物的培养特性的稳定效果。
下面举出实施所提供的方法的具体实施例。
实施例1为制备凝胶按下述操作方法制备在含氯化钠0.85重量%的生理盐水中的A、B、C、D四种溶液,所述的组分的量以1000毫升溶液计算。
1.制备溶液A5毫升N,N′-四甲基乙二胺(ТМЗД)溶于995毫升生理盐水中。
2.制备溶液B将0.742克N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺(МЪА)溶于500毫升生理盐水中,加热至60℃并加入470克丙烯酰胺(AA),将其搅拌至全部溶解,过滤所得溶液,用生理盐水加至1000毫升。
3.制备溶液C将1.78克过硫酸铵溶于1000毫升生理盐水中。
4.制备溶液D将100克聚乙烯醇溶于900毫升生理盐水中。
由制得的溶液配制反应混合物。为此,A、B、C、D四种溶液以A∶B∶C∶D=16∶32∶52∶10之体积比混合。反应混合物含比例为15∶1之丙烯酰胺与聚乙烯醇(ПВС)。将反应混合物倒入反应器,在反应器中进行自由基共聚至生成园片形凝胶。60分钟后取出凝胶用生理盐水洗涤一小时,然后进行溶胀至重量增加到3.5倍。
所得凝胶用作制备固体培养基的基体。为此将园片浸入液体营养基质-肉汁,并于56℃保持2-3小时。将所得培养基用120℃的蒸汽进行灭菌30分钟。进行干燥后在恒温器中于37℃接种试验微生物。
固体培养基具有良好的粘性、弹性、坚实性、透明性,在用细菌环接种微生物时不受损伤。
用肉汁作液体营养基质,而金色葡萄球菌用作被试细菌。于37℃经一昼夜接种培育后长出典型的边缘光滑的园形金色菌落。用显微镜观察确证培养典型性。
在固体培养基上无液体渗出。用细菌环能将培养物完全剥离。
实施例2用如实施例1中所述的方法制备的溶液A、B、C、D配制反应混合物。将体积比为A∶B∶C∶D=16∶32∶52∶20之溶液进行混合,倒入反应器进行共聚,反应混合物含重量比为15∶20之丙烯酰胺及ПВС。一小时后用实施例1中所述方法处理所得凝胶片,至重量增加到5倍。
所得凝胶与实施例1一样用营养基质浸泡。用含200毫克%胺氮的Хоттuнгер胰蛋白重煮作营养基质,用绿脓杆菌作试验细菌。于37℃培养后长出园的平的粘质菌落,同时生成蓝绿色典型可溶色素。在固体培养基上没有观察到液体渗出。培养物不在培养基内生长,用细菌环能完全剥离。
实施例3使用按实施例1制备的溶液A,C和D。将0.594克N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺溶于500毫升含0.85重量%氯化钠的生理盐水以制备溶液B,加入470克丙烯酰胺并用上述浓鹊纳硌嗡又 000毫升体积。
由上述溶液制备体积比为A∶B∶C∶D=16∶32∶52∶30的混合物并在反应器内进行共聚。反应混合物含重量比为15∶3.0之丙烯酰胺和聚乙烯醇。按实施例处理所得凝胶,至重量增加到5倍。
所得凝胶按实施例1用营养基质浸泡。用含200毫克%胺氮的ХоТТuнгер重煮作营养基质。肠杆菌E.Coli055培养物作试验细菌。
于37℃培养一昼夜后培养物长成具有平滑边缘的平滑的微凸的有光泽的菌落。以形态学和可凝集特性确证培养典型性。在培养基表面无液体渗出。
将E.Coli055培养物接种在DE,A,3430316申请所述制备的固体培养基上以进行比较。
于37℃培养一昼夜后培养物长成不规则形的平面菌落。在固体培养基个别部分上观察到液体渗出。
实施例4将2.4克聚乙烯醇溶于250毫升水中。所得溶液倒入含0.25克МЪА,0.25毫升ТМЗД和159克丙烯酰胺的470毫升含0.9重量%氯化钠的生理盐水溶液中。将所得溶液混合物加入含有0.35克过硫酸铵的160毫升上述浓度生理盐水溶液中并倒入反应器进行聚合。
反应混合物含有AA和ПВС,其重量比为20∶3。一小时后取出凝胶片,用生理盐水洗涤并置于生理盐水中溶胀至重量增加到4倍。
所得凝胶如实施例1用营养基质浸泡。使用含200毫克%胺氮的ХоТТuнгер重煮作为营养基质。沙门氏伤寒菌(SalmonellaTyphimurium)用作试验细菌。于37℃在恒温器中培养后长出有光滑边缘的平整的微凸菌落。研究其形态学、糖异化和可凝集特性确证培养典型性。
实施例5将0.8克聚乙烯醇溶于250毫升水中。所得溶液倒入含有0.25克МЪА,0.25毫升ТМЗД和159克丙烯酰胺的470毫升含0.8重量%氯化钠的生理盐水溶液中。将所得混合物加入含0.35克过硫酸铵的160毫升上述生理盐水溶液中,并倒入反应器中进行聚合。
反应混合物重量比为20.0∶1.0的丙烯酰胺和聚乙烯醇。一小时后用生理盐水洗涤凝胶片,在生理盐水中进行溶胀至重量增加到4.5倍。
所得凝胶如实施例1用营养基质浸泡。使用含200毫克%胺氮和2%葡萄糖的ХоТТuнгер重煮作为营养基质。用长成典型菌落形态的生脓链球菌(Streptococcuspyogenes)作为试验培养物。
实施例6使用按实施例1准备的溶液A,C,D。为配制B溶液将4.125克N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺溶于500毫升含0.9重量%氯化钠的生理盐水中,加入470克丙烯酰胺,用上述浓度的生理盐水将体积增至1000毫升。由上述溶液制备体积比A∶B∶C∶D=16∶32∶52∶15的混合物B并在反应器中进行共聚。在反应混合物中丙烯酰胺与N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺的重量比为15∶0.132,而丙烯酰胺与聚乙烯醇之比为15∶1.5。
对所得凝胶按实施例1进行处理,至重量增加到3.5倍。所得凝胶如实施例1用营养基质浸泡。用肉汁作营养基质。用弗氏志贺式菌(ShigellaHexneri)培养物作为实验细菌。于37℃在恒温器中经一昼夜培养后培养物长成有光泽的具有平滑边缘的微凸菌落。研究其形态学、糖异化和可凝集特性确证培养物典型性。在培养基表面无液体渗出。
实施例7使用按实施例1配制的溶液A,C,D。为配制溶液B将0.594克N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺溶于500毫升含0.85重量%氯化钠的生理盐水中,加入25克丙烯酰胺,用上述浓度的生理盐水将体积增至1000毫升。由上述溶液制备体积比A∶B∶C∶D=16∶32∶52∶30的混合物,在反应器中进行共聚。在反应混合物中丙烯酰胺与N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺之重量比为20∶0.019,而丙烯酰胺与聚乙烯醇之比为20∶3.0。
对所得凝胶按实施例1进行处理,至重量增加到4.6倍。所得凝胶如实施例1用营养式荨S煤 00毫克%胺氮的ХоТТuнгер胰蛋白重煮作为营养基质。普通变形杆菌(ProteusVulguris)培养物用作试验细菌。在恒温器中培养24小时后培养物长成典型的中等光泽的不规则形的微凸菌落,通过形态学研究确证培养物典型性。在培养基表面未观察到液体渗出。
实施例8使用按实施例1配制的溶液A,C,D。为制备B溶液将4.135克N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺溶于500毫升含0.8重量%氯化钠的生理盐水,加入25克丙烯酰胺,用上述浓度生理盐水将体积增至1000毫升。由上述溶液配制A∶B∶C∶D=16∶32∶52∶10的混合物,并在反应器中进行共聚。在反应混合物中丙烯酰胺与聚乙烯醇之重量比为20∶1.0。
所得凝胶按实施例1进行处理,至重量增加到4.0倍。所得凝胶如实施例1用营养基质浸泡。用肉汁作营养基质。用肠杆菌E.ColiOIII作试验培养物。于37℃在恒温器中接种培养后培养物长成具有平滑边缘、平整表面的、有光泽的园形微凸菌落。研究其形态学、糖异化和可凝集特性确证培养物典型性。在培养基表面未观察到液体渗出。
实施例9使用按实施例1配制的溶液A,C,D。为配制溶液B将1.78克N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺溶于500毫升含0.85重量%氯化钠的生理盐水中,加入625克丙烯酰胺并用上述浓度生理盐水将体积补增至1000毫升。由上述溶液配制A∶B∶C∶D=16∶32∶53∶25的混合物。在反应器中进行共聚。在反应混合物中丙烯酰胺与N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺的重量比为20∶0.057,而丙烯酰胺与聚乙烯醇之比为20∶2.5。
所得凝胶按实施例1进行处理,至重量增加到4.3倍。所得凝胶如实施例1用营养基质浸泡。用Дuфко肉汁作营养基质。蜡样芽胞杆菌(Bac.Cereus)培养物作试验细菌。在恒温器中培养24小时后培养物长成具有粗糙表面的典型的园形平菌落。通过形态学研究确证培养物典型性。在培养基表面未观察到液体渗出。
权利要求
1.用于培养微生物的坚实的固体培养基的制备方法,采用将重量比为(15-20)∶(0.019-0.132)的丙烯酰胺和N,N1-亚甲基-二-丙烯酰胺在生理盐水中进行自由基共聚至生成凝胶,在生理盐水中洗涤和溶胀,并用营养基质浸泡,其特征在于共聚是在聚乙烯醇存在下进行,丙烯酰胺与聚乙烯醇之重量比为(15-20)∶(1.0-3.0)。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于使用聚乙烯醇水溶液。
全文摘要
用于培养微生物的固体培养基的制备方法在于将重量比为(15-20)∶(0.019-0.132)∶(1.0-3.0)的丙烯酰胺和N,N′-亚甲基-二-丙烯酰胺和聚乙烯醇在生理盐水中进行自由基共聚至生成凝胶,接着进行洗涤,在生理盐水中溶胀并用营养基质浸泡。
文档编号C12N1/20GK1032363SQ87107790
公开日1989年4月12日 申请日期1987年10月7日 优先权日1987年10月7日
发明者夫拉迪米尔·夫拉迪斯沃维奇·加辛斯基, 塔蒂亚那·伊瓦诺纳·克拉英米科瓦, 纳塔利亚·夫拉迪米罗纳·科科沙, 利迪亚·彼特罗夫纳·彼沃瓦维奇 申请人:包格奠尔兹院士基辅医学院
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