专利名称：细胞增生疾病的基因疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种治疗细胞增生性疾病的方法，它包括向增生细胞中插入一种抑制性生长调节(NGR)成份。
导致细胞非正常局部增生的病理状况是人体疾病的一种常见病因。人体良性疾病不同于恶性疾病(癌症)的基本点在于，良性疾病不能够从人体的一个部位扩散到另一个部位，以及它们的生长速度一般较缓慢。两种疾病都可以导致死亡，失明和致残。腹部术后的内部粘连和疤痕形成这些不利因素可以导致肠道狭窄和坏死。糖尿病患者眼内新生血管的非正常生长可以引起失明。良性神经纤维瘤可以引起毁容。像牛皮癣这种皮肤病是一种其他正常细胞的异常增生所导致的终生消耗性疾病。许多不同的人体疾病都可以归于这种类型。
由于细胞异常局部增生引起的疾病可以总称为良性增生疾病(BPD)。如果增生细胞以成纤维细胞为主，这一类疾病的亚分类称之为“纤维增生性”疾病。如果增生细胞是血管内皮细胞(存在于血管内表面的一种细胞类型)为主，则亚分类称之为“血管增生性”疾病。上皮细胞的异常增生可引起严重的皮肤病。目前，这些良性增生性疾病的治疗通常是用手术、放疗、和/或化疗中的一种或几种方法进行组织摘除。这些治疗方法一般对正常和病理组织都有损伤。其他的局部疗法，如激光或局部冷冻疗法，很少获得成功。
对于细胞增生的控制是一个复杂的过程，人们只是在近些年来对此开始有所了解。细胞的生长与否取决于抑制性和促进性生长成份表达的平衡。抑制性生长调节(NGR)成份是那些当将其在细胞中表达或提供给该细胞时可以抑制细胞生长的成份。促进性生长调节(PGR)成份一般是那些当将其在细胞中表达或提供给该细胞时刺激细胞增生的产物，或基因及基因物质。
抑制性生长基因的表达在调节和控制细胞增生过程中起着重要的作用。NGR成份的一些例子是已经识别出的在静止的或休眠状态的细胞中诱导表达的一些基因。这些基因可以命名为抑制性生长调节(NGR)基因。降低这些抑制性生长调节(NGR)基因的调节功能可以取消对细胞增生的抑制。除了某些生物或生理现象可以引起这些基因或基因产物的失活外，已经识别出在某些病理状况中抑制性生长调节基因失活或缺乏。这些基因的失活可能由于该基因的缺失、突变或调节功能低下所致，或者是由于结合该基因产物或使之失活的某种因子过盛，从而部分或全部地阻止该基因的表达或其产物的功能，并且因此阻止了其阻遏或限止细胞增生的能力。
最近，识别出了几种对肿癌细胞增生有抑制作用的称之为肿瘤抑制因子基因的NGR基因。这些基因包括，但不局限于，人视网膜神经胶质瘤基因R6-1，P53基因，DDC基因，NF1基因，维尔姆斯瘤基因，NM23基因，甲状腺激素受体基因和视黄酸受体。这些抑制生长调节基因中某些基因的缺失或失活已经与某种类型的肿瘤联系起来。
人体视网膜神经胶质瘤基因，Rb1，是这类肿瘤抑制因子基因(本文称之为抑制性生长调节(NGR)基因)的原型，在细胞中该基团的两个等位基因的缺失或该基因或基因产物表达的抑制可以引起肿瘤或异常的细胞增生。已经在分子水平上证实RB1基因的两个等位基因的缺失或失活存在于临床表现肿瘤如视网膜神经胶质瘤，和临床相关肿瘤如骨肉瘤、纤维肉瘤、软组织肉瘤和黑素瘤中。
另外，Rb-1基因功能的丧失也与其他类型的原发肿瘤如未分化小细胞肿瘤(SCLC)，软组织肉瘤，乳腺癌，宫颈癌和前列腺癌有关。
向失去Rb-基因的肿瘤细胞中导入Rb-1基因可以引起肿瘤生长的抑制。例如，当向失去内源性Rb基因的骨肉瘤细胞系SAOS2和前列腺癌细胞系DU145这种肿瘤细胞导入Rb-1的cDNA时，这些肿瘤细胞中的某些细胞生长在体内受到特异性抑制(Huang et al.，(1988)Science 2421563;Bookstein et al.，(1990)Science 247712)。这些研究者得出结论，当用视网膜神经胶质瘤基因特异性抑制肿瘤基因表现型时，对于正常细胞没有影响。
促进性生长调节(PGR)成份包括所有的原致癌基因，已经表明在某些类型的癌症、正常细胞的细胞增殖期和某些病理的细胞增生性疾病中有这些基因的表达。这些原致癌基因表达的活化对于细胞增殖是必不可少的。已经发现这类基因中的许多特异性基因编码了生长因子或它们的受体。发现当一种细胞暴露于生长因子时某些原致癌基因的表达紧紧的与增殖状态有联系。许多生长因子，如血小板产生的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，胰岛素、和转铁蛋白，这里只是列举一部分，对于细胞增殖都是必要的。不能够表达某种生长因子的特异性受体分子的细胞，即使生长因子存在在该细胞中也不会发生增生。另一方面，若细胞中该受体表达的正常抑制性调节受到干扰，而产生该受体的无控制表达，该细胞则以无控制状态进行增生。当静止细胞与血小板产生的生长因子(PDGF)或表皮生长因子(EGF)进行接触时，就会诱导包括c-fos和c-myc的几种原致癌基因的新mRNA的合成。同样，部分肝切除可以刺激体内静止肝细胞的生长。这种生长的激发与几种原致癌基因包括c-myc的加速表达有关。这些PGR基因的活化对于正常的，及异常或病现的细胞增殖都是需要的。
病理性细胞增生疾病经常与原致癌基因的异常活化有关。例如在非淋巴细胞性白血病细胞系HL-60中c-myc表达水平被高度放大。如果用化学诱导剂，如视黄酸和二甲基亚砜，诱导HL-60细胞停止增殖，则c-myc的表达水平被降低。另一方面，当把HL-60细胞与一种互补于c-myc或c-myb与5′端的DNA结构接触时，可以阻止这些mRNAs和c-myc的翻译，或者c-myb蛋白表达被降低，导致细胞增生终止和治疗细胞的分化(Wickstorm et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci 851028;Anfossi et al(1989)Proc.Natl.Acad.Sci 863379)。
一方面，本发明提供一种对存在于肿瘤、恶性细胞增生，良性增生性疾病和其他病理性细胞增生疾病中的异常的或病理性的细胞生长进行治疗的一般化方法。
另一方面，本发明提供一种对个体中细胞增生疾病的治疗方法，包括对异常增生细胞使用某种抑制性生长调节基因(NGR)成份的一种或几种活性基因复制品。
本发明的另一个方案提供了一种抑制异常细胞增生的方法，该方法是向一种异常增生的细胞中插入一种本发明的合成DNA或RNA结构，该结构使某种PGR成份的功能性表达失活。
本发明的一个实施方案提供了一种治疗个体中肿瘤和细胞增生性疾病的方法，包括使用一种抑制性生长调节(NGR)基因的一种或几种活性基因复制品。
一方面，本发明提供一种限制病理或正常细胞生长或增生的方法，该方法是插入选自下列一组基因的某种抑制性生长基因的一种或几种复制品，这组基因由人视网膜神经胶质瘤基因，P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，视黄酸受体基因，甲状腺激素受体基因，myo D基因，DCC基因，NF-1基因，和NM-23基因组成。
本发明的另一个方案提供了一种治疗病理性细胞增生性疾病的方法，包括对含PGR成份如一种致癌基因或原致癌基因的细胞使用一种本发明的核糖核酸酶(ribozyme)结构，其中所编码核糖核酸酶(ribozyme)可以破坏靶PGR基因或成份的mRNA前体和/或mRNA。
本发明的另一个实施方案提供了一种治疗病理性细胞增生疾病的方法，包括对异常增生细胞使用一种或多种NGR成份，其中所说的NGR成份选自下列一组成份，包括(1)一种抑制性生长调节基因，和(2)编码一种与PGR基因或成份的mRNA前体或mRNA特异地直接结合的核糖核酸酶(ribo zyme)的DNA。
本发明的另一个实施例提供了一种治疗病理性细胞增生疾病的方法，包括对一种含有PGR基因的细胞使用一种NGR成份，其中所说的NGR成份干扰或抑制PRG成份的正常的功能性表达。
本发明的另一个发明目的是提供一种治疗病理性细胞增生疾病的方法，包括对一种含有致癌基因或原致癌基因的细胞使用一种含有NGR成份的DNA结构，其中所说的DNA结构抑制致癌基因、原致癌基因或其他PGR成份的活化，或者使所说的致癌基因，原致癌基因或其他PGR成份失活，其中所说的DNA结构包括一种能有效表达一种编码了核糖核酸酶的DNA顺序的重组表达载体，将它可控制地连接到一种与某种转化子宿主细胞相匹配的二级控制DNA顺序上。在一个优选方案中，DNA结构包括一种编码了所说核糖核酸酶的DNA顺序，其中所说的核糖核酸酶含有与存在于转化子宿主细胞中的致癌基因、原致癌基因或其他PGR成份的核RNA或信使RNA或基因产物互补的顺序。本发明方法可以用来灭活任何PGR成份的mRNA前体或mRNA，尤其是可以灭活选自于下列一组中的某种PGR成份，它们包括c-myc，c-fos，c-jun，c-myb，c-ras，KC和JE，转铁蛋白受体，胰岛素受体，PDGF受体，和EGF受体。在最佳方案中本发明的DNA结构通过操作连接到一种可诱导的启动子上。
本发明的另一个实施方案提供了一种治疗个体中细胞增生性疾病的方法，包括对细胞使用某种NGR基因的一种或多种活性基因复制品，其中所说的NGR基因选自于下列一组基因，包括视网膜神经胶质瘤基因，P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，视黄酸受体，甲状腺激素受体，myo D基因，DCC基因，NF-1基因，和NM-23基因。一种优选方案是，抑制性生长调节基因是一种含有有效表达一种DNA顺序的重组表达载体的DNA结构，(该顺序编码了所说的抑制性生长调节基因)所说的DNA结构最好是可控制地连接到与一种转化子宿主细胞相匹配的二级控制DNA顺序上。
另一方面，本发明提供一种阻止异常细胞增生的方法，该方法是向异常增生细胞中插入选自下列的一种NGR成份;包括一种抗致癌基因，一种抑制性生长调节基因，和编码一种能直接与促进性生长调节基因或成份结合的核糖核酸酶的DNA构件。
在一个实施方案中，NGR成份是视网膜神经胶质瘤基因，Rb-1。
本发明的另一方面提供了一种预防性治疗方法，在遗传学上有倾向的个体中阻止和防止异常细胞增生性疾病，如癌症。该方法包括下列步骤识别只具有某种NGR基因的一个活性等位基因而易于发生肿瘤的个体;向被认为是缺乏足够的所说抑制性生长基因之正常复制基因的易患病个体的卵子、精子或受精卵中，插入至少一种选自下列一组基因的某种抑制性生长基因的附加的复制基因，这组基因包括人视网膜神经胶质瘤基因，P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，视黄酸受体基因，甲状腺激素受体基因，myo D基因，DCC基因，NF-1基因，和NM-23基因;并使之继续受精或进行胚胎发育。
在本发明的一个优选方案中，使用一种反转录病毒载体将NGR成份插入到增生细胞中。最优选方案是，该反转录病毒是不完全的，并且不转化非增生细胞。
本发明的另一个方面是提供一种方法用于治疗病理性细胞增生疾病，例如，但不局限于，眼内增生性疾病;增生性皮肤病，如，但不局限于，牛皮癣，鳞癣，扁平苔癣，乳头状瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，所有器官的血管增生性疾病，和体内各种其他类似的增生性细胞疾病。
通过下面的为了描述的目的而公开的本发明的优选实施例，使本发明的其他方面、特征和优点将是很清楚的。
图1表示在人β肌动蛋白启动子的控制下的含有部分Rb-1 cDNA的质粒HuBAcpr-1-neo-Rb的构建及其结构。
图2表示转染质粒对人成纤维细胞系WS1增生的影响。
图3表示转染质粒对人膀胱癌细胞系TCCSUP增生的影响。
图4表示转染质粒对骨肉瘤SaOS2细胞增生在体外与体内的影响。
图5是核糖核酸酶(ribozyme)DNA结构的示意图。5A组表示一种核糖核酸酶DNA结构的一般图解，5B组表示编码了一种作用于RbRNA的核糖核酸酶的DNA结构，5C组表示含有质粒PT7B-Rb-FL的Rb-1，用来产生两个RNA模板以测定Rb核糖核酸酶的催化活性，5D组表示编码了一种以c-myc mRNA为靶的核糖核酸酶的DNA结构。
图6表示含有一个或几个核酸酶(6A组)基因、反义基因(6B组)，和NGR基因(Rb-1基因)(6C组)的反转录病毒载体的图解说明。
图7是用一种靶核糖核酸酶处理前后两种Rb合成RNA模板的电泳图谱。
图8表示用Rb抗体沉淀的各种蛋白的电泳图谱。
术语“抑制性生长调节成份”(NGR成份)是指包括当使用于增生细胞和导入到所说细胞的基因组中时减少细胞生长，或抑制细胞增殖的那些物质。本发明的一个具体实施方案是一种最好在强启动子启动下导入到一种载体中去的一种NGR基因，即Rb-1基因，的DNA结构。本发明的DNA结构最好是使用MuLV为基础的反转录病毒载体将其转移靶细胞中去。
术语NGR成份是指包括当存在于或加入到一个细胞中时抑制细胞生长或增生的任何基因，基因编码区或基因产物，任何自然或合成的DNA或RNA，肽，类固醇，或其他生物物质。
例如一种类型的NGR成份是选自于下列一组基因但不局限于它们的隐性人体癌基因(肿瘤抑制因子基因或抗致癌基因)。这组基因包括视网膜神经胶质瘤基因Rb-1，P53基因，DCC基因，NF-1基因，Wilm肿瘤基因，NM23基因，甲状腺激素受体基因，视黄酸受体基因，以及编码P130，P107，和P85的基因。
第二种类型的NGR成份是一种编码核糖核酸酶的DNA结构。设计的所说DNA结构能够产生一种RNA酶，它可以结合和破坏所选择的促进性生长调节(PGR)基因的RNA，如(1)选自由下面一组，但不局限于它们的致癌基因或前致癌基因，包括c-myc，c-fos，c-jun，c-myb，c-ras，KC和JE;(2)选自下面一组但不局限于它们的生长因子受体基因;血小板产生的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(FGE)，转铁蛋白和胰岛素。
术语“抑制性生长调节(NGR)基因”是指包括那些由下面一组的一种基因或基因编码区组成的一组中选出的NGR成份，这些成份包括，但不局限于，视网膜神经胶质瘤基因RB-1，P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，DCC基因，NF-1基因，Wilms′肿瘤基因，NM23基因，甲状腺激素受体基因和视黄酸受体基因。
术语“促进性生长调节成份”是指包括那些当存在于或加入到一种细胞中时可以刺激细胞生长或增生的任何基因或基因产物，任何自然或合成的DNA或RNA、肽、类固醇或其他生物学物质。PGR成份可以选自于下面一组成份，包括但不局限于，致癌基因，如病毒致癌基因vsrc，原致癌基因如c-myc，生长因子基因c-sis，生长因子受体基因如PDGF受体基因，生长因子如胰岛素，生长因子受体如胰岛素受体或转铁蛋白受体。
术语“基因的功能性表达”是指包括基因转录的抑制，基因转录本(信使RNA前体)的降解，接合的抑制，信使RNA的破坏，信使RNA的翻译抑制，蛋白质翻译后修饰的抑制，蛋白质的破坏，或蛋白质正常功能的抑制。
术语“核糖核酸酶(ribozyme)”是指一种构建的RNA，它可以识别所选择的靶基因的mRNA或mRNA前体，并与之结合，然后这种核糖核酸酶切割或者说破坏所说的mRNA前体或mRNA。如果一种基因的DNA顺序是已知的，则可以构造核糖核酸酶使之与该基因的mRNA前体或mRNA进行结合。
术语“转染质粒”是指要被转移(转染)到所选择的细胞中去的并含有所选择的NGR成份的细菌质粒，这些NGR成份选自于，但不局限于(1)NGR基因或该基因的一部分，(2)所构建的，能够破坏PGR成份的mRNA前体和/或mRNA的核酸酶。
术语“基因疗法”是指包括为了调节基因表达和/或该基因产物的功能，向一个细胞，一组细胞、组织、病理损害、器官或生物体内插入一种基因的全部或一部分，一种DNA构件，RNA，或基因产物。
术语“预防基因疗法”是指包括那些可以用来部分或全部阻止或防止疾病和疾病扩散的基因，以及还包括可以用来补充或取代细胞、组织或细菌系中缺失或失活的抑制性生长(调节基因)的一些基因。
术语“细胞增生性疾病”是指包括那些影响到任何一种或几种器官、空腔或身体部位的任何人体或动物的疾病或不适，其特征是细胞，细胞群或组织的单一或多发性局部异常增生，不管是良性还是恶性的。
术语“原核生物”是指包括能够用DNA进行转化以表达本发明重组分子的所有细菌。
术语“真核生物”是指包括能够用DNA转化以表达本发明重组分子的所有酵母菌、真菌、动物和植物细胞。
本发明DNA构建所用的DNA可以是合成的，或者可以是从任何种类哺乳动物中得到的。所要求的是用于NGR成份的基因顺序要在原核生物或真核生物有机体中进行功能性表达。最好是合成的DNA。
使用任何在本领域中普通技术人员公知的技术，可以用一种编码本发明DNA构件的重组DNA分子转化一种宿主。
制备融合的，可操作连接的基因并将其在细菌中表达的方法是已知的，并且在例如被本文所参考和结合的美国专利NO.4，366，246对此有所描述。在该专利中所述的基因结构和方法可用来构建本发明的DNA构件，并在原核生物或真核生物宿主中转染。
原核生物宿主可以包括革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌，如，大肠杆菌，伤寒杆菌，粘质沙雷氏杆菌，和枯草芽胞杆菌。
真核生物宿主可以包括酵母菌如毕赤氏巴氏德酵母(Pichia Pastoris)或哺乳动物细胞。
一般情况下，含有能促进所插入DNA片段的有效转录的启动子顺序的表达载体要与宿主联合使用。典型的表达载体通常含有一种复制区，启动子，终止子，以及能够在转化细胞中进行表现型选择的特定基因。可以根据本领域已知的方法对转化的宿主进行发酵和培养以达到最佳细胞生长。
本发明所使用的有代表性的启动子包括，但不局限于人β肌动蛋白启动子，金属硫堇启动子，SV40复制区，和MMTV LTR启动子以及MuLV LTR启动子。对可用于本发明的某些有代表性的质粒或嗜菌体的描述见Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratories，1982。还有一些本领域熟练人员已知的其他质粒或嗜菌体，可以容易地得到。
基因是一种DNA顺序，它能够通过其模板或信使RNA而编码一种具有特异性肽氨基酸特征的顺序，术语cDNA包括那些已经去掉干涉顺序的基因。术语“重组DNA”(rDNA)是指一种通过体外连接cDNA或基因组DNA顺序而重组的分子。
克隆载体是一种能够在宿主细胞中复制的质粒或嗜菌体DNA或其他DNA顺序，并且以被一个或几个核酸内切酶识别位点为其特征，在这些位点上这些DNA顺序可以以可测定的方式被切割而不丧失该DNA的基本生物学功能，并且它含有一种适用于识别转化细胞的标记。这些标记例如是四环素拮抗或氨苄青霉素拮抗。有时用“载体(vector)”一词来表示克隆载体。
表达载体是一种类似于克隆载体且能够在宿主中，一般是在某种控制顺序的控制下，表达一种给定的结构基因的载体。
术语“个体”是指包括动物和人。
术语增生细胞生长的“生物抑制”或“抑制”是指包括部分或全部生长抑制，并且还指包括细胞生长或增生率的降低。通过测定实验NGR成份对组织培养中的恶性或异常增生靶细胞生长(见实施例3-4和图2-4)动物体内或细胞培养中肿瘤生长的影响，或本领域中普通熟练技术人员已知的其他方法，可以确定本发明NGR成份或基因的生物学抑制剂量。
用于本发明方法的NGR成份或基因的给药途径可以是局部的、眼内的、非肠道的、口服、鼻内、静脉、肌内、皮下，或任何其他合适的方法。治疗眼科疾病的优选给药方法是眼内或眼周注射。治疗皮肤细胞增生性疾病的优选给药方法是局部用药或皮下注射。
在另一个实施例中，可以将本发明的DNA构件直接提供到局部增生性病灶中。在眼科增生性疾病情况下，可以将本发明的DNA构件直接注射到眼内。使用一种可用来将注射针头直接导入到病灶的理想设备，可将本发明的DNA构件直接提供到内脏器官、躯体空腔或类似部位的局部病灶中。有时也可以在手术时将本发明的DNA构件，施用于病灶。
DNA用药剂量取决于个体的年令，疾病或遗传学发病倾向的临床阶段的程度。部位、体重、共同使用的治疗方法种类、以及如果可能的话还取决于病理学特征或恶性状况。用于本发明方法的有效释放系统例如用于口服的胶囊剂、片剂、液体溶液、悬浮液或酏剂、或者是灭菌液体剂型如溶液、悬浮液或乳剂。最好是使用任何惰性载体，如盐水、磷酸盐缓冲液、或者是本发明方法中所用的化合物在其中具有合适溶解性质的任何这种载体。
对于眼内传递和其他局部病灶传递，用于本发明方法的传递系统最好是灭菌液体形式如溶液、悬浮液或乳液。局部用药可以使用软膏、乳膏或喷雾剂的形式。最好是使用惰性载体，如盐水，或磷酸盐缓冲液，或者是能够使本发明方法中所用的化合物在其中具有合适溶解性质的任何这种载体。
对于NRG成份或基因的细胞局部给药，可以通过本领域中熟练人员已知的方法将本发明的DNA用药于该细胞，这些已知方法包括，但不局限于，细胞的转染、电击、微量注射，或者是在载体如脂质体、Lipofectin.中、或裸露的DNA或RNA给药。可以通过已知的基因传递系统来传递本发明的DNA，这些基因传递系统可以是，但不局限于，反转录病毒(Gilboa(1982)J.Virology 44845;Hocke(1986)Nature 320275;Wilson et al.，Proc Natl Acad Sci USA 853014)，牛痘病毒系统(Chakrabarty et al.，(1985)Mol.Cell Biol.53403)或者是本领域熟练技术人员已知的其他有效DNA传递系统(Yates et al.，(1985)Nature 313812)。这些参考文献只是一些典型代表例并通过参考结合于本文中。为了特异性地传递或转染正在异常增生的细胞而不伤害未分裂细胞，最好使用本领域熟练技术人员已知的一种反转录病毒传递系统。由于反转录病毒DNA整合过程中需要宿主DNA复制以及由于缺少其生活周期所必要的反转录病毒基因使得反转录病毒自身不能自我复制，因而将这种反转录病毒传递系统用于本发明的NGR成份，可以把所说的抗增生性NGR成份以异常增生细胞为靶，而使得非分裂细胞不受任何损害。
可以将本发明的DNA与任何生物有效载体一起给药。这些生物有效载体包括反转录病毒，脂质体，和其他任何能够将外界DNA导入到细胞基因组中去的转染机构。这些转染机构对于本领域的熟练人员是已知的。这些载体还包括本发明构件能与之相配合并且在给药剂量下对所治疗个体或细胞无毒性的任何制剂或溶剂。
有很多种病理细胞增生状态使用本发明方法可以进行有效的治疗。这些病理状态可以出现于几乎所有能够进行异常细胞增生的细胞类型当中。表现出病理性或异常生长的细胞类型是(1)成纤维细胞。这种情况下发生的疾病是已知的纤维增生性疾病;(2)血管内皮细胞，这些情况发生的疾病为已知的血管增生性疾病和(3)上皮细胞，此时发生疾病为皮肤增生性疾病。由上可以看出，本发明方法可以用于治疗个体的所有或几乎所有器官和组织系统的局部或扩散的病理状况。
例如，就眼睛而言，使用本发明方法可以治疗由于正常、良性或恶性细胞或组织的异常增生而引起的各种病理疾病状态，这些增生包括，但不限于，下列纤维增生性，血管增生性和/或肿瘤的眼科疾病视网膜早熟病，增生性玻璃体视网膜炎，增生性糖尿病视网膜炎、毛细血管瘤、脉络膜新血管网形成、视网膜下新血管网形成、由于视网膜下病变引起的衰退性黄斑变性，新血管形成，角膜新血管形成，由于视网膜上膜增生引起的黄斑皱起，由于核心硬化引起的成年人白内障，外伤或手术后的纤维向内生长，眼神经胶质瘤，神网膜血管瘤病，血管增生性青光眼，空洞性血管瘤，虹膜发红，镰刀细胞增生性视网膜病，眼睛手术或外伤后的上皮向下生长，后发性白内障膜，乳头状瘤，地中海贫血症并发视网膜新血管形成，假性黄瘤伸缩引起的神网膜下新血管形成，和1型、2型神经纤维瘤，神网膜神经胶质瘤，葡萄膜黑素瘤，眶部假性肿瘤。
使用本发明方法可以治疗的其他良性细胞增生性疾病包括，但不局限于，牛皮癣，鳞癣，乳头状瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，和史蒂文斯-约翰逊综合征。
根据本发明方法，可以通过导入一种NGR成份或多种NRG成份以防止或抑制各种细胞增生性疾病中的异常增生来控制细胞增生过程。对这种增生过程的控制可以通过向一种靶增生细胞中导入一种编码了NGR成份的DNA构件来实现。这种NGR成份包括一种NGR基因，或者是对PGR成份的功能性表达的灭活或抑制。
为了阐述通过本发明方法使用某种NGR成份抑制非恶性或非肿瘤细胞中异常细胞的增生，将人体视网膜神经胶质瘤基因，Rb-1导入到一种正常人体纤维细胞系中。如实施例中所更为详细地描述的，向正常人体纤维细胞，WS1，中导入一种人Rb cDNA可以导致细胞生长的停止。同样，正如实施例3和4中所进一步描述的，向几种不同类型的癌细胞中导入这种人视网膜神经瘤基因导致了体外或体内这些细胞的生长的抑制。
我们以及他人的研究都已经表明，当处于细胞生活周期的G1/S分界期及S期的细胞进行增殖时，人视网膜神经胶质瘤基因产物被强烈地磷酸化(Buckovich et al.，(1989)Cell 581097;Mihara et al.，(1989)Science 2461300;De caprio(1989)Cell 581085 and chen et al.，(1989)Cell 581193)，但是当细胞在G1期不进行增殖时，该基因产物则未被磷酸化或是低磷酸化的。将静止细胞与分裂素接触可以引起能够使Rb蛋白磷酸化的某种激酶复合物的活化。从而使细胞进入DNA复制和有丝分裂期。因此，为了使细胞起动DNA复制，可能必须通过磷酸化使人视网膜神经胶质瘤基因产物失活。
在本发明的一个实施例中，通过导入RB-1基因的另外复制品，引起Rb-1蛋白质的过量产生，或者通过诱变该Rb-1基因使其不能被磷酸化，而抑制或干涉Rb-1蛋白质的正常细胞磷酸化。
当向正常非肿瘤细胞中导入一种高度表达的视网膜神经瘤基因时，可以表达出大量的视网膜神经胶质瘤蛋白。因此所处理过的细胞中含有过量的活化Rb蛋白质，且其增生受到抑制。当通过血清去除而使增生细胞生长受到抑制时，通常以多磷酸化形式存在的视网膜神经胶质瘤蛋白质则进行脱磷酸化。这种过量的Rb蛋白可以覆盖细胞激酶使Rb基因产物磷酸化而灭活的能力。因此，在一个实施方案中，通过向细胞中导入NGR基因，如Rb-1基因，可以阻止或抑制细胞增生。同样，也可以使用其他的NGK基因来实施本发明。为了保证生长抑制过程，所导入的基因应当在一种强启动子的控制之下，人β-肌动蛋白是一种这样的强启动子。实施例1中对包含有处于强启动子如人β肌动蛋白基因控制下的Rb基因的DNA构件的构造过程进行了描述。尽管如此，对于本领域的熟练人员来说，显然可以用其他NGR成份代替RB-1基因，以及也可以使用其他的强启动子来实施本发明。
另一个实施方案中，在向细胞内导入之前，先将Rb-1基因的磷酸化位点诱变。Rb蛋白上有7-12个潜在的磷酸化位点。Rb-1cDNA中的丝氨酸或苏氨酸编码顺序诱变成丙氨酸或缬氨酸或其他顺序，可以产生一种不能够通过磷酸化而失活的永久活性Rb蛋白。因此宿主细胞不能够通过磷酸化而灭活该Rb蛋白质。因而向细胞中导入这种突变的Rb-1基因可以引起生长抑制。另外，也可以对其他NGR基因的磷酸化位点，如，但不限于，P53，P85，P107和P130进行诱变以防止该基因产物的磷酸化，并导入到异常增生细胞中以限制这些细胞的增生。
通过导入一种NGR基因的额外复制品来阻止细胞生长的另一种方法是破坏促进性调节成份或基因产物的表达。已经识别出在RNA代谢中起酶作用的天然RNA分子。这类分子，总称之为核糖核酸酶(ribozymes)，存在于植物和动物病毒中。其中一种核糖核酸酶已由Symons及其同事在卫星烟草环状病毒(STobRV)中识别出，并称这种自我切割RNA为锤头状结构(Forster and Symons(1987)Cell.509)。Uhlenbeck指出，一种由一个模仿这种锤头结构的RNA短链组成的RNA片段在生理条件下，可以用作一种酶来切割合成的RNA片段。发现对氯霉素转乙酰酶(CAT)具有特异性的一种核糖核酸酶能够在体外有效地切割CAT RNA(Haseloff and Gerlach，(1988)Nature 334585)，并且当通过遗传工程方法将这种相同结构加入到一种表达载体中时，可以在体内干预定位点上对CAT RNA进行切割(Cameron and Jennings(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.869139)。而且在转染细胞中可以抑制这种CAT表达。由STobRV的催化区构成的核酸酶其切割特异性非常广泛。它可以在三联体5′GUX3′的末端进行切割，其中X可是A、C或U。一种设计的核酸酶的特异性位于催化区两侧的顺序中，所选择的这些顺序要与被切割RNA的位点周围的顺序互补。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过导入一种或几种DNA质粒而终止细胞增生的方法，这些质粒在细胞中编码了产生可以特异性破坏PGR成份的核酸酶。实施例5是这种方案的具体实现。如实施例5所述，对编码了核糖核酸酶，并且含有能使核酸酶准确地作用于任何特异性PGR成份之顺序的DNA构件进行构建，这种核糖核酸酶结构在图5A中以一般的形式作出了图解说明。实施例5中还对能切割RB-1基因的核糖核酸酶的构建进行了描述。根据本发明的一个实施例，可以将一种核糖核酸酶构件导入到一种细胞中以破坏靶PGR成份的核或信使RNA。实施例5对c-myc核糖核酸酶的这种导入进行了描述。本领域的熟练技术人员可以显而易见地看出按照本文的教导，可以把按本发明的教导制备的任何PGR成份和核糖核酸酶构件用来切割任何PGR成份或基因产物。抑制细胞中基因表达的另一种方法是利用反义RNA。反义RNAS是与所指基因的部分或全部信使RNA相互补的RNAS。已经表明过量地产生反义RNA可以防止使用靶RNA进行翻译，并且阻遏了基因产物的表达。
为了停止细胞的增生，向增生细胞中导入能够表达与细胞中各种促进性调节成份特异性结合的反义和/或核糖核酸酶的DNA构件。
可以在同一位点上同时使用不只一种本发明的DNA构件。例如，在同一时间可以将作用于各种不同PGR基因的不同核酸酶构件用于同一局部病灶。另外，可以同时使用几种不同的DNA构件如一种或几种核糖核酸酶和一种或几种NGR基因或NGR成份。
以上是本发明进行的一般性描述，参阅下列具体实施例可以对本发明有更为完整的了解。这些实施例只是用于解释本发明，除了另外说明之外，并不对本发明起限定作用。
实施例1Rb-1 cDNA表达质粒的构建Maniatis等人对质粒构建和DNA制备的一般过程进行了描述(Maniatis，T.，Fuitsch，E.F.，and Senbrook，J.(1982)Mole-cular CloningA laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，U.S.A)，所有质粒都生长在从Bethesda Research Laboratory(BRL)购买的大肠杆菌宿主DH5-α中。对人β-肌动蛋白表达载体系统，pHB APr-1-neo的结构及特性进行了描述(Gunning et.al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，4831-4835)。Rb-1 cDNA顺序也已进行过描述(Fung et al.，(1989)in Oncogenes，Chapter 13，Molecular Biology of the Human Retinoblastoma Gene，Benz，and Lin，(eds.)Kluwen Academic Publishers.)图1A-C组对HuBAcpr-1-neo-Rb-8342的结构进行图解说明。为了构建HuBAcpr-1-neo-Rb-8342，从λ嗜菌体克隆4-14-5上切割下含有部分第一外含子(exon)的BamH1-Eagl DNA片段(T′Ang et al(1989)Oncogene 4，401-407)，并将其连接到Rb-1 cDNA质粒PGH2的5′端的BamHl-Eagl位点上(Fung et al，(1987)Science 2361657-1661)。(见图1，A组)，使所得到的质粒进行生长，并将含有Rb-1启动子区和Rb-1 cDNA5′部分的HindIII Ecor1片段转移到质粒PT7BRB的HindIII和EcoR1位点(见图1，B组)，产生质粒pBRB2.9。用EcoR1从PG3.8上切割下Rb cDNA的3.8Kb3′一半(Fung et al(1987)Science 2361657-1661)，并将其亚克隆到pBRB2.9的EcoR1位点上以产生PT7BRBFL。(见图1，C组)，最后，将含有Rb-1 cDNA的BamH1片段及其启动子亚克隆到HuBAcpr-1-neo的BamH1位点上以产生HuBAcpr-1-neo-Rb-8342。
为了构建HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ，用BamH1和Eag1消化一种双股人工接头(本文只列出了其中一股)5′ ACGGATC CGCGTCATG CCG CCCAAA ACC CCC CGA AAA ACG GCCG 3′，并将其亚克隆到质粒PT7BRBFL的BamH1/Eag1位点上(见图1，C组)，以取代Rb启动子。然后用酶ppuml对这种质粒进行部分消化使其在核苷酸＃2797-2799处线性化。将一种含有一个多A信号(AATAAA)和邻侧为ppuml位点的BamH1位点的人工接头插入到线性化PT7BRBFL的ppuml位点上。发展所得到的质粒，并将含有Rb1 cDNA编码区的BamH1片段切割下来，然后插入到质粒HuBAcpr-1-neo的BamH1位点上以产生质粒HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ。
图1D表示在人β-肌动蛋白启动子的控制下含有部分Rb-1cDNA的质粒HuBAcpr-1-neo-Rb的一般结构。
构建两种不同的HuBAcpr-1-neo-Rb表达质粒。对于HuBAcpr-1-neo-Rb-8342来说，X是位于最长开放阅读框架的第一ATG之前的BamH1 2Kb片段(T′Ang et al.，(1989)Oncogene 4401)而y是Rb cDNA的完整3′未翻译区。
对于 HBApr-1-neo-RB-PQ来说，X是位于第一ATG之前的人工接头(5-GATCCGCGTC-3)而y是一种在核苷酸＃2801后面的含有一个多A尾信号AATAAA的人工接头。
实施例2转染质粒对人纤维细胞系WS1增生的影响。
如果将正常角化细胞与限制多种类型细胞生长的肿癌生长因子β(TGFβ)接触，角化细胞中的视网膜神经胶质瘤蛋白会很快地脱磷酸化，且角化细胞停止生长。该SV40巨大T抗原，当视网膜神经胶质瘤基因产物与其结合时会失活，也只能与低磷酸化(活性)形式的视网膜神经胶质瘤蛋白质结合。因此，当将使细胞处于生长抑制状态时，与之相关的变化则是视网膜神经胶质瘤蛋白质的脱磷酸化。通过与分裂素接触重新激发静止细胞进行生长，可以在起始DNA合成之前使视网膜蛋白进行强烈的磷酸化。在正常和肿瘤细胞中观察到的这种现象表明，由于磷酸化使视网膜神经胶质瘤蛋白失活对于发生细胞增生是必需的过程。因此，视网膜神经胶质瘤蛋白与正常和肿瘤细胞的生长缓慢或抑制有关。
为了研究RB cDNA对细胞生长的影响，将HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ转染到正常人纤维细胞系WS1中。作为对照，从质粒PATV-6D3A上切割下处于RSV LTR控制之下含有对抗新霉素基因的DNA片段，将人工Sall接头连接到该片段上，用Sall进行消化，然后连接到PPVUO上(kalderon and Smith，(1984)Virology.139109-137)以产生PPVUO-Neo.然后对这种含有用于SV40巨大T抗原的基因的质粒，PPVUO-Neo进行转染以控制转染效率。为了进行转染，将该质粒DNA每100μg与107指数生长的WS1细胞在最终体积为0.8ml的RPM1 1640培养基(Gibco)加10%FCS中于一种电击穿室单位Cell-PoratorTM(BRL)中进行混合。在200伏和1180UF下进行电击穿。使电击穿过的细胞于室温下恢复10分钟，然后将其在加有10%胎牛血清(FC5)的RPM1 1640中稀释，再以2×104细胞/cm2的细胞密度在60mm培养皿中进行平板培养。使细胞附着并在同一培养基中生长两天。之后，将培养基换成RPM11640+10%FCS+15μg/ml G418(GIBCO)。每三天一次，将复制皿取下，用一种兔多克隆抗-Rb蛋白抗体RB1-ABA1或RB1-AB18(Mihara K.et al(1989)Science 2461300)(图2A)，或用鼠单克隆抗-SV40巨大T抗原抗体PAB101(图2B)对其进行组织免疫化学染色。使用实施例8中所述的染色方法。如图2A所示，在G418培养基中转染和选择13天后，正在表达转染Rb cDNA质粒HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ的WS1细胞被抗-Rb蛋白抗体强烈染色。但是表达Rb蛋白的细胞仍然是单细胞而没有分裂。相反，在图2B中被鼠抗SVLT抗体染色阳性的这组细胞，表明表达转染SV40巨大T抗原(SVLT)的细胞继续分裂成许多菌落。
因此，细胞中Rb cDNA的过量表达导致细胞生长的极度缓慢或静止。
实施例3转染质粒对人膀胱癌细胞系TCCSUP增生的影响使用实施例2中所述的相同方法，将Rb-1基因转染到不含有内源性Rb蛋白的人膀胱癌细胞TCCSUP中。所用质粒，转染方法和免疫染色方法与图2中的所述方法相同。
从图3A中可以看出，正在表达转染R-1b cDNA的细胞没有分裂。相反，表达转染SVLT的细胞分裂形成菌落(图3B)。Rb cDNA的过度表达导致体外癌细胞生长的极度缓慢。
实施例4转染质粒对骨肉瘤SaOS2细胞系增生的影响。
除了在培养基中使用了100μg/ml G418之外，用于SaOS2细胞转染的质粒和条件与实施例2中所述相同。
不是所有的癌细胞都可以在单细胞水平上受到生长抑制。骨肉瘤细胞系SaOS2就是较好的实例。将Rb cDNA质粒HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ转染到这种细胞系中表现出三种不同的细胞反应。可能SaOS2细胞系是由一种以上的细胞群组成。从图4A和B可以看出，用HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ转染的表达Rb蛋白的SaOS2细胞有2/3没有分裂，而另外1/3则分裂。大约1/3表达Rb蛋白的转染SaOS2细胞可以分裂并形成菌落。表达Rb蛋白的剩余2/3细胞具有两种不同的形态学特征。一种较小，而另一种的细胞体积要大5-10倍。这两种细胞群以相同比例存在。
为了证实在体外分裂的这种SaOS2是否能在体内生长，用本领域已知方法对SaOS2细胞进行单细胞克隆化。总地来讲，为了进行单细胞克隆，用一个克隆园筒分离出一簇转染的G418抗SaOS2细胞。对克隆园筒内的细胞进行胰蛋白酶化，然后将大约200个细胞置于一个60mm培养皿中。使以单细胞形式附着在培养皿上的细胞生长至大约200个细胞菌落，并用克隆园筒回收这些菌落，并胰蛋白酶化。然后使这些细胞生长，并取下样本进行组织免疫染色，确保所有细胞都呈抗-Rb抗体Rb1-ABA1和RB1-AB18染色阳性。然后将大约103个细胞注射到10个裸鼠的每个鼠的眼前室中。做为对照，将来代SaOS2细胞注射到相同裸鼠的对侧眼内以进行比较。如图4C所示，用Rb构件转染的SaOS2在眼内不生长，而亲代SaOS2细胞则增生并形成肿瘤。
实施例5
生长抑制核糖核酸酶的构建对编码了核糖核酸酶并且含有可将该核酸酶准确地作用于任何特定PGR成份的顺序的DNA构件进行构建的过程，在图5A中以一般形式进行了图解说明。图5B表示了切割RB-1基因的一种核糖核酸酶的示意图。根据本发明的一个实施例，可以将一种核糖核酸酶构件导入到细胞中，该核酸酶则会破坏任何PGR成份的核或信使RNA。用c-myc核糖核酸酶实施上述过程的图解说明见图5D。图5D表示了c-myc基因的mRNA顺序的一部分和一种设计核糖核酸酶。
以类似的方式可以对给定的mRNA在不同位点切割几种核糖核酸酶。当使用在本实施例中所运用的特定核糖核酸酶时，唯一的要求是在该顺序中含有一个GUX三联体。显然也可以使用在RNA分子上具有不同切割位点的其他RNA切割酶。这些酶可以是人工制备的或者是其他自然存在的RNA切割分子。
因此核酸酶含有催化区5′-CUG AUG AGU CCG UGA GGACGA AAC - 3′该区附着在互补于mRNA的3′和5′顺序的核苷酸顺序5′和3′两边，紧临近于所要切割的位点GUX处，X可以是A、C、或U。
在图5A中所描述的一般核酸酶中，N和N′＝G，A，UC而且N′与对Rb RNA有特异性的核酸酶的N.B.结构互补。
按照下述方法构造一种能在核苷酸1771和1772之间的Rb基因切割位点处使Rb mRNA失活的抗-Rb核糖核酸酶，并在图5B中表示。
为了切割Rb mRNA，合成一种互补于Rb mRNA顺序5′-CUU GAA UCU GCU UGU CCU CUUAAU CUU CCU - 3′的核糖核酸酶。
为了制备核酸-Rb DNA结构，合成下面的两个引物Sal 1a)5′-TCG TCG ACA AGA TTA AGAGCT GAT GAG TCC GTG AGGACG 3′b)5′-CTGGATCCAAGCCTAATCTGCT TGT TTC GTCCTCACGGAC TC AT-3′两种引物中各取1μg在40μl的10mM TRIS HCl pH7.5，0.1mM EDTA中加热至90℃1分仲。向加热的引物中加入10μl的10X引物扩展缓冲液，使最后的溶液含有50mM TRIS HCl pH7.2，10mM MgSO4，0.1mM二硫苏糖醇，50μg/ml牛血清白蛋白，dATP，dGTP，dCTP和dTTP各0.1mM。向混合物中加入4单位的DNA聚合酶Klenow片段(NE Biolab)，并将反应液于室温下保温1小时。加入1μl的0.5M EDTA终止该反应，并运用本领域已知的标准方法纯化DNA，例如用Maniatis等人所述的方法(Maniatis，T.，Fuitsch，E.f.，and Senbrook，J.(1982) Mole-cular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，U.S.A.)。用Sall和BamH1切割纯化的DNA，并将其亚克隆到pGEM4载体中(Pro-mega Biotech)，以便与T7聚合酶一起在体外表达，并测定其催化活性。
为了测定该核糖核酸酶的催化活性，在将质粒于适当位点线性化到所需RNA的理想长度之后，通过体外转录从PGEM-ribo-Rb-3(用于核糖核酸酶RNA)和从PT7BRBFL(用于底物RNA)中制备RNA。为了进行体外转录，将2μM的线性化质粒DNA于40℃在50μl的反应混合液中培养1小时。该混合液含有25单位的T7 RNA聚合酶、1mM ATP，CTP和GTP，50单位的RNasin，0.1mM UTP和10uCi的[q-32P]UTP，40mM TRIS HCl pH7.9，20mm MgCl2，10mM NaCl和10mM DTT。反应之后，通过在一种6%7M尿素-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来纯化核糖核酸酶RNA。将凝胶于室温下暴露于X-线胶片10分钟来识别合成的核糖核酸酶。
切下含有核酸酶的凝胶块，将该凝胶块在0.1%SDS，0.5M乙酸铵pH6.9，1mM EDTA中涡旋回收RNA。将提洗液过滤，然后用0.1体积的5M乙酸钠pH5.3和2体积的100%乙醇进行沉淀。
反应完成之后，通过在等体积的酚中涡旋并离心将两直分开来纯化RNA样本。用乙醚萃取含有RNA的水相。然后向水相中加入0.2体积的5M乙酸钠pH5.3，和2体积的100%乙醇。
通过在BamH1位点(模板A)或M1u位点(模板B)上使PT7BRBFL线性化来制备图5C所示的两个模板。模板A是4.7Kb而模板B是1.8Kb。如果按照所设计的在核苷酸＃1700处切割该核糖核酸酶，那么模板A的大小应当显著地缩小，而模板B的大小只是最少地缩小。
为了测定该核糖核酸酶的催化活性，将1pmo1的Rb核糖核酸酶与1pmole的模板A(图7，谱带1，2)或模板B(图7，谱带3，4)在10μl的75mMTRIS-HCl和2mM EDTA中混合，将混合物加热到95℃2分钟后，在冰上冷却。加入MgCl2至最终浓度为20mM来起始该反应。在4℃或42℃下放置12小时后，加入2μl的200mM EDTA pH7.9终止该反应。按照以前所述的甲醛琼脂凝胶电泳方法对反应产物进行分析(Fung et al(1987)Science 2361657)。如图7，谱带2所表明的，正如所预计的模板A RNA产物(谱带1)被降解至其原来大小的一半，而模板B RNA的产物大小也正如所预计的未明显缩小。
因此，可以明显地看出Rb-核糖核酸酶构件可以在所指定的位点切割Rb RNA，从而使Rb RNA灭活。一旦推断出RNA的顺序，则可以根据上述的方法构造出一种能直接作用于任何特定RNA的核糖核酸酶。还可以发现，为了更有效地破坏或灭活靶RNA，构造多个能直接作用于相同靶RNA上不同位点核糖核酸酶也是有用的。
C.对c-myc mRNA有特异性的核糖核酸酶的构建为了切割c-myc mRNA，合成一种互补于c-myc顺序5′-U CCU CAC AGC CCC CUG GUCCUC AAG AGG-3′的核糖核酸酶。所得到的结构如图5D所示，它在指定位置对靶c-myc mRNA进行切割。
一种切割位点在核苷酸888和889之间的c-myc mRNA的核糖核酸酶如图5D所示。
为了在细胞内破坏c-myc RNA，需要一种编码了该核糖核酸酶的DNA质粒。构造这种核糖核酸酶质粒的过程包括下列步骤1.合成核糖核酸酶区2.将核糖核酸酶区亚克隆到哺乳动物表达载体中。
1.合成核糖核酸酶区图5D中所示的用于c-myc mRNA的核糖核酸酶的制备方法如下合成两个寡聚核苷酸。
Sall(a)5′-TC GTC GAC CCT CTT GAG CTCATG AGT CCG TGA GGA CGA -3′BamH1 HindⅢ(b) 5′CT GGA TCC AAG CCT GCC CCCTGG TTT CGT CCT CAC CGA C-AT-3′在(a)中划线部分的核苷酸是与c-myc mRNA3′的切割位点互补的顺序。
在(b)中划线部分的核苷酸是那些c-myc mRNA5′中切割位点的顺序。
将两种引物各取1μg在40μl的10mM Tris HCl pH.7.5，0.1mM EDTA中加热至90℃1分钟。向加热的引物中加入10μl的10X引物扩展缓冲液，使最后溶液含有50mM Tris HCl pH7.2，10mM MgSO4，0.1mM二硫苏糖醇，50μg/ml牛血清白蛋白，dATP，dCTP，dCTP和dTTP各0.1mM。向混合液中加入4单位的DNA聚合酶Klenow片段(NEBiolab)，并且将其在室温下孵育1小时。加入1μl的0.5M EDTA终止该反应，并通过惯用技术纯化DNA。用Sall和BamH1对纯化的DNA进行切割，并将其亚克隆到PGEMA载体中(Promega diatech)，以便在体外与T7聚合酶一起进行表达，并测定其催化活性(见下面)，或者将其亚克隆到HBApr-1-neo的Sal1/BamH1位点上以得到HuBAcpr-1-neo-Ribo-c-myc-1。
实施例6从重组构件中 制备 反转录病毒为了用一种反转录病毒载体将核糖核酸酶构件HuBAcpr-1-neo-ribo-c-myc-1转移到细胞中去，切割下EcoR1/Hind Ⅲ片段，并将其亚克隆到以鼠白血病病毒为基础的反转录病毒载体PMV7的EcoR1/Hind Ⅲ位点中。所得到的反转录病毒构件PMV7-HBAp-ribo-c-myc-1的结构如图6A所示。
图6A是对存在于一种MuLV载体中的用于c-myc mRNA的核糖核酸酶的图解说明，其中Z可以是(1)将核糖核酸酶亚克隆到MuLV载体中去的人工接头短链，或(2)人β-肌动蛋白启动子。该核糖核酸酶结构如图5D所示。
运用电击穿方法，将所得到的适用于核糖核酸酶的反转录病毒质粒DNA，或反义或者是带有抑制性生长调节基因的DNA转染到ψm或PA12细胞中，并如实施例2所述方法分离抗G418集落。每天收集组织培养上清液，并且通过在一种Sorval HB-4离心机中于4℃下以10，000rpm转速离心使其澄清。用一系列上清稀释液与NIH3T3细胞一起孵育来测定病毒滴度。使细胞在加有10%FCS和100μg/mlG418的RPM1 1640培养基中生长。根据所得到的抗G418菌落数目确定病毒滴度。如果只是得到低的滴度，则可以用该病毒感染ψ2细胞，并对从抗G418 ψ2细胞中得到的上清进行如上的测定病毒滴度的分析。如果病毒滴度仍然较低，再用从ψ2中得到的上清液来感染未被感染的ψm细胞，并且测定从ψm中得到的上清液的病毒滴度。运用这种感染方法，通常可以得到一个103-105/ml的病毒滴度。使能够表现出高滴度103-5/ml的细胞菌落进行生长以产生病毒。然后则使用这种病毒用于治疗目的。
还记载有另一种用于核糖核酸酶的载体(Cotten M.and Birns-tiel M.L.(1989)EMBO J83861)。把核糖核酸酶亚克隆到tRNAMet的结构基因中。发现所得到的杂交分子ribo-tRNAMet对其需要的RNA底物具有催化活性。可以运用这种也可以是其他的核酸酶系统(Kuo，et al.(1989)J.Virol 624439;Herschlag and Cech (1990)Nature 344 7405;Robertson and Joyce(1990)Nature 344467)。
实施例7核酸酶体外和体内的催化活性的分析为了在体外产生核糖核酸酶，将2μM的核糖核酸酶质粒pGEM-ribo-c-myc-1在50μl反应液中于40℃下孵育1小时;该反应液含有0.5单位/μl T7 RNA聚合酶;40mM TRIS-HCl pH7.9，20mM MgCl2;10mM NaCl;10mM DTT，0.1mM UTP，10uCi的[q32P]UTP，各为1mM的ATP，CTP和GTP;和1单位/μl的人胎盘RNase抑制因子。
反应完成之后，向反应混合物中加入50μl含有95%甲酰胺，1mM EDTA，0.1%(w/v)二甲苯胺兰，0.1%(w/v)溴苯酚兰的填充溶液。
将该溶液于65℃加热5分钟，然后装置于6%7M的尿素-聚丙烯酰胺凝胶上。在1×TBE缓冲液(50mM Tris-borate pH8.4和1.5mM EDTA)中进行电泳。通过在室温下对该凝胶进行X-线胶片显影10分钟来确定合成的核糖核酸酶。切割下含有核酸酶的凝胶块，将其在0.1%SDS，0.5M乙酸铵pH6.9，1mM EDTA中涡旋提洗来洗脱RNA。将洗脱液过滤，然后用0.1体积的5M乙酸铵pH5.3和2体积的100%乙醇使其沉淀。
为测定该核糖核酸酶的催化活性，将上述分离的1pmol核糖核酸酶与1pmol的c-myc mRNA在75mM TRIS-HCl和2mM EDTA混合，将混合液加热至95℃2分钟，然后在冰上快速冷却。使混合液调至最终体积为10μl，并含有50mM TRIS-HClpH7.5，1mM EDTA和10-20mM MgCl2，在一层石蜡油下于37℃起动该反应进行12小时。加入2μl的200mM EDTA pH7.9终止该反应。通过Northern印迹分析对反应产物进行分析。
实施例8细胞中Rb蛋白质的免疫组织化学定位将细胞在含有10%FCS和0.1%青霉素/链霉素的RPM1 1640培养基中进行培养。用冷PBS(磷酸盐缓冲液)对细胞漂洗两次。用含有5%醋酸和95%乙醇的溶液于4℃下将该细胞固定12小时。
固定之后，用冷PBS将细胞洗涤两次。将细胞在一种含有1%普通马血清，3%牛血清白蛋白和0.2%Triton X-100的PBS溶液中于4℃下孵育1小时，来阻遏非特异性结合。然后将细胞在PBS中漂洗两次。再将该细胞于4℃在PBS中含有11600的RB1-AB18稀释液或1100的RB1-ABA1稀释液于37℃下孵育1小时。然后用冷PBS和含有1%Triton X-100的PBS以及PBS按顺序洗涤该细胞。将其与生物素化的(biotinylated)羊抗-兔IgG抗体(在PBS中1200稀释)于37℃下孵育1小时可以观察到RB1抗体与该细胞的特异性结合。用冷PBS将细胞洗涤三次之后，把细胞与ABC试剂(抗生物素蛋白生物素复合物)于37℃下孵育30分钟，用冷PBS洗涤，然后再与新鲜的DAB(3，3′-二氨基联苯(Diaminobenzidine)-四氢氯化物)溶液(10ml的0.05M TRIS-HCl，pH7.6，0.3%叠氮化钠和10μl过氧化氢中含有6mg的DAB)于室温下孵育4分钟。用蒸馏水洗涤细胞并在光学显微镜下观察。
实施例9用于c-myc和c-myb的反义RNA构件。
以前曾描述过使用作用于c-myc和c-myb的反义RNA来抑制非淋巴细胞性白血病细胞系HL-60和其他细胞生命的生长(Wack-strom et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.851028;Anfossi et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci 863379)。通过将细胞在体外与寡聚核糖核苷酸一起孵化来完成本实验。为了在体内使用，按下述方法制备所给定的反义RNA的一对寡聚核苷酸对于c-myc来说，互补子开放阅读框架的前15个碱基(c-myc mRNA的核苷酸＃559-573)的顺序两侧是5′端的EcoR1位点，和3′端Hind Ⅲ位点5′AATTCAACGTTGAGGGGCATA 3′3′GTTGCAACTCCCCGTATTCGA 5′EcoR1 HindⅢ将这对寡聚核苷酸于90℃下加热1分钟，然后在2X连接缓冲液(20mM TRIS HCl pH7.5，10mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇(DTT)和0.2mM ATP)中退火，再连接到反转录病毒载体PMV7的EcoR1/HindⅢ位点上。
以类似的方法构建用于促进性生长调节因(例如c-fos，PDGF受体等)的编码反义RNA的cDNA。
实施例10用与Rb蛋白类似或相同的结构区进行新蛋白质的免疫测定发明人近来发现有一组蛋白质与Rb蛋白具有类似或相同的结构区。这些蛋白质可能是新的抑制性生长调节基因的产物。使用抗RB基因产物的抗体通过免疫沉淀方法对这些蛋白质进行测定。用抗-Rb抗体RBIAB20和RBIAB18和RBIABAI进行免疫沉淀。对这三种抗体的制备和使用以前已有记载(Mihara et al(1989)Science 2461300)。另外，已经制备出抗肽P3(CRTPRRGQNRSARIAKQLEND，一种含有Rb蛋白的肽，氨基酸数250至270并在N末端上带有一半胱氨酸残基)的兔多克隆抗体RBIABC。
为了进行免疫沉淀，将随意人群的融合人体癌细胞SW613(6×106个细胞)在Dulbecco′s最低基础培养基(DMEM)和5%透析的胎牛血清(FBS)中，蛋氨酸缺乏(如果用[35S]蛋氨酸作为标记物或磷酸盐缺乏(如果用32P磷酸盐做为标记物的情况下进行孵育。于37℃孵育1小时后，用2ml含有5%透析FBS和300UCi的[32S]蛋氨酸(1000Ci/mmol)或300uCi的[35P]正磷酸盐(9120Ci/mmol)的DMEM取代该培养基并于37℃下孵育2小时。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞洗涤两次，并且用0.5ml的EBC(40mM TRIS-HCl pH8.0，120mM NaCl，0.5%NP-40，抑肽酶(2μg/ml)，胃酶抑素(2μg/ml)，亮肽素(2μg/ml)和苯甲基磺酰氟化物(100μg/ml)于0℃提取该蛋白质1小时。通过于4℃下以15，000rpm转速离心10分钟来使细胞溶融物澄清。用5-10μl的抗Rb抗体或者是已经与100μg的免疫肽在4℃下孵育2小时或更长时间的抗体和上清液一起在4℃下孵育2小时。在蛋白A-琼脂(Calbiochem)上收集这种免疫复合物，并用EBC洗涤5次。通过在样本缓冲液[62.5mM TRISHCl pH6.8，5%β-巯基乙醇，2.3%SDS，10%甘油，和0.001%溴酚兰]中于87℃下加热10分钟来洗脱免疫沉淀的蛋白质，并通过SDS-PAGE进行分离。将凝胶固定并对X-线胶片曝光。
如图8中所示，至少有四组蛋白质可以用抗Rb抗体使之沉淀。这些蛋白质与Rb蛋白必然有一类似结构区，因而可以被抗Rb蛋白的抗体所识别。其他蛋白质可能会与Rb蛋白联合在一起，而被一起沉淀。过些蛋白质的特征列举如下。
(1)P110-P130是一组分子量为110到130Kd的异种蛋白。最好根据所用的凝胶电泳标记物的迁移情况估计该分子量。这些蛋白质的分子量可以是107到150Kd。
这些蛋白质首先是从含有Rb蛋白的人体癌细胞系SW613中检测出来的。正如图8，谱带1，9和13所示，RBIAB20沉淀的一组蛋白质分子量在105-130千道尔顿(Kd)之间。用免疫肽P5预先吸附抗体后不能够免疫沉淀这些蛋白质(图8，谱带2，10和14)这一现象表明，这些蛋白质可以被抗Rb抗体特异性识别。这组蛋白质不但不与Rb蛋白结合形成复合物，而且似乎与Rb蛋白具有相同的结构区。用RB1AB20在例如乳腺癌细胞系BT-549和视网膜神经胶质瘤细胞系Y79(图8，谱带11)这两种都不含有内源性Rb蛋白质的细胞中可以检测出这种蛋白，这一现象可以对此有所证实。另外，这表明这些蛋白质不是由Rb1基因编码的。
这组蛋白质中的一种或几种可以与最近报道的P107/P120蛋白有关(Ewen M.E.et al(1989)Cell 58257;Dyson N.et al(1989)Cell 58249).P107/P120是一种能够与SV40和JC病毒的巨大T抗原及腺病毒EIA蛋白结合的蛋白质。由于可以使用相同的病毒抗原区与它们及Rb蛋白结合，因而这些蛋白质具有能被这些病毒蛋白所识别的结构区。通过Rb基因的缺失结构测定已经确定出对结合这些病毒抗原有重要意义的氨基酸链＃393-572和＃646-772。实际上可以与Rb蛋白的这些区相结合的抗体可以识别P107/P120这种蛋白。但是应当指出的是，能够与RB1AB20结合的氨基酸链P5不在可以与E1A或SV40巨大T结合的区域以内。P5可以是存在于这些蛋白中的区域的一部分。图8，谱带3和4代表P107-110Kd，它也可以被抗体识别。对宫颈癌细胞系ME180的细胞溶解产物进行免疫沉淀表明有105Kd和110Kd蛋白质存在，见图8，谱带3。用肽P5预先吸附该抗体可以导致两条谱带的消失。不过，由于强磷酸化的Rb105Kd蛋白具有一个大约107-110Kd的分子量，它可以使该区域中其他的蛋白质不能清楚地表现出来。为了测定这些蛋白质是否被磷酸化的Rb蛋白质掩盖，用宫颈癌细胞系C33A(图8，谱带5和6)和膀胱细胞系J82(图3，谱带7和8)进行相同的实验，其中，Rb蛋白已被诱变而不能被磷酸化。对两种细胞系细胞溶解产物的免疫沉淀表明存在有105Kd未磷酸化的Rb蛋白和107Kd蛋白。因此，RB1AB-20能够使分子量在107-130Kd之间的一组蛋白质沉淀。这些蛋白质与Rb蛋白具有一个相同的结构区，并且可以被抗Rb抗体所识别。
(2).在人体癌细胞系SW613中已检测出分子量大约为85Kd的一种蛋白质P85，可用抗体RBIAB20和RBIABC检测出P85。如图8谱带1和2所示，正如图8，谱带1和2所见到的P85可以容易地被检测出来(图8，谱带1)，但是如果用免疫肽(P5)阻遏抗体则不能检测出(图8，谱带2)。当用TGF-β与增生的正常人角化细胞作用时，生长抑制与P85蛋白表达的正向调节有关。更重要的是，P85表达的增加依赖于用TGF-β处理的时间及剂量。众所周知TGF-β作用可以引起许多种细胞的生长抑制。用TGF-β处理可以增强细胞内P85表达这一事实，与P85可能是另一种与Rb蛋白有相同结构区的抑制性生长调节基因产物相一致。
(3).用RB抗体可以沉淀另一种分子量大约为53Kd的蛋白质P53。肿瘤抑制因子基因产物P53可以被RBIAB20(图8，谱带13和14)和RBIAB18(图8，谱带15-18)抗体沉淀这一发现，可以说是最有力地证明了与Rb蛋白有相同结构区的蛋白质都抑制性生长调节基因产物。为了证明P53不是由于与Rb联结而被共沉淀，对含有P53基因而去除了Rb基因的人乳腺癌细胞系MDAMB468进行测定。也可以用这两种抗体在人乳腺癌细胞系MDAMB468中沉淀出P53。
因此，用抑制性生长调节基因可以编码这组蛋白质。也可以将这些基因导入到异常增生靶细胞中而抑制细胞生长来实施本发明。
现已对本发明进行了完整地描述，显然，对于本领域的普通熟练技术人员来说，在不超出下面本发明权利要求保护范围或精神的情况下，可以对本发明进行多种变动和修改。
权利要求
1.一种治疗病理性细胞增生疾病的方法，包括对增生细胞使用一种DNA构件，该构件可以通过抑制促进剂生长调节基因或抑制由所说促进剂生长调节基因编码的核或信使RNA来限制细胞增生。
2.如权利要求1的方法，其中所说的DNA构件包括一种含有编码了核糖核酸酶(ribozyme)或抑制性生长调节基因的DNA顺序的重组表达载体。
3.如权利要求1的方法，其中所说的DNA构件包含一种含有编码了核糖核酸酶(ribozyme)的DNA顺序的重组表达载体。
4.如权利要求1的方法，其中所说的DNA构件包含一种含有编码抑制性生长调节成份的DNA顺序的重组表达载体。
5.如权利要求2的方法，其中所说的编码所说核糖核酸酶(ribozyme)的DNA顺序，还在所说核糖核酸酶(ribozyme)顺序的3′和5′端包含有可编码核苷酸的DNA顺序，所编码的核苷酸互补子由存在于靶宿主细胞中的促进剂生长调节基因所编码的核RNA或信使RNA中的至少一种。
6.如权利要求5的方法，其中所说的促进剂生长调节基因选自下列一组基因c-myc，c-fos，JUN，myb，Kc，JE，转铁蛋白受体基因，胰岛素受体基因，PDGF受体基因和EGF受体基团。
7.一种治疗个体中良性细胞增生性疾病的方法，包括给某种异常增生细胞使用一种含有抑制性生长调节基因(NGRG)的至少一种活性基因复制品的DNA构件。
8.如权利要求5的方法，其中所说的NGRG是选自由下列一组基因视网膜神经胶质瘤基因，P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，视黄酸受体，甲状腺激素受体myoD基因，DCC基因，NF-1基因，和NM-23基因。
9.一种治疗个体中恶性细胞疾病的方法，包括给某种增生癌细胞使用一种含有选自下列一组基因中某种基因的至少一种活性基因复制品的DNA结构，这组基因是P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，视黄酸受体，甲状腺激素受体，myo D基因，DCC基因，NF-1基因，和NM-23基因。
10.一种含有阴性生长调节基因的至少一种活性等位基因但仍然异常增生的增生细胞的生长抑制方法，方法是对所说的异常增生细胞使用含有所说抑制性调节基因的DNA构件的至少一种复制品。
11.如权利要求10的方法，其中所说的增生细胞是下列一组疾病的病因，这种疾病是牛皮癣，良性增生性皮肤病，鳞癣，乳头状瘤，基底细胞癌，鳞状细胞癌，纤维增生性疾病，血管增生性疾病，和皮肤增生性疾病。
12.一种治疗细胞增生性疾病的方法，包括对一种异常增生细胞使用一种DNA构件，所说的DNA构件选自由下列组成的一组成份(1)一种抑制性生长调节基因，和(2)编码一种含有互补于由PGR基因编码的核或信使RNA的核苷酸顺序的核糖核酸酶的DNA。
13.一种治疗病理性细胞增生疾病的方法，包括对含有某种PGR基因的细胞使用一种DNA构件，其中所说的DNA构件可抑制所说PGR基因的功能性表达。
14.如权利要求10的方法，其中所说的DNA结构含有一种有效表达DNA顺序的重组表达载体，所表达的DNA顺序编码一种核糖核酸酶(ribozyme)，并且通过人工操作被连结到与一种转化子宿主细胞相匹配的二级控制DNA顺序上。
15.如权利要求11的方法，其中所说的编码所说核糖核酸酶(ribozyme)的DNA顺序，包含有互补于由存在于转化子宿主细胞中的PGR基因所编码的核或信使RNA的DNA顺序。
16.一种抑制异常细胞增生的方法，向异常增生细胞中插入一种选下列一组的DNA结构，包括一种抗致癌基因，一种阴性生长调节基因，和与互补于促进剂生长启动子基因的顺序相邻的核糖核酸酶(ribozyme)。
17.一种对缺乏抑制性生长调节基因的至少一种活性等位基因的增生细胞的生长限制方法，包括用一种含有某种抑制性生长调节基因的至少一种等位基因的DNA构件转染所说的增生细胞。
18.一种限制和防止在遗传学上有发病倾向的个体内发生癌症的预防性治疗方法，包括下列步骤识别只具有抑制性生长调节基因的一个活性等位基因而易于发生癌症的个体，向被识别为缺少有所说抑制性生长基因之足够正常复制基因的，所说易于患病个体的卵子，精子，或受精卵中插入至少一种选自下列一组中的某种抑制性生长基因的复制基因，这种基因包括人视网膜神经胶质瘤基因，P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，视黄酸受体，甲状腺激素受体，myo D基因，DCC基因，NF-1基因，和NM-23基因，并且使这些卵子继续受精或受精卵继续胚胎发育。
19.一种编核糖核酸酶(ribozyme)的DNA顺序，该顺序在所说的核糖核酸酶(ribozyme)顺序的3′和5′端含有编码互补于由存在于靶宿主细胞中的促进剂生长调节成份所编码的核心RNA或信使RNA中至少一种核苷酸DNA顺序。
20.一种含有一种表达载体的DNA结构，它含有编码某种抑制性生长调节成份的DNA顺序。
21.如权利要求20的DNA结构，其中所说的NGR成份是一种NGR基因。
22.如权利要求21的DNA结构，其中所说的NGR基因选自由下列基因组成的一组基因，包括人视网膜神经胶质瘤基因，P53基因，P85基因，P107基因，P130基因，视黄酸受体，甲状腺激素受体，myo D基因，DCC基因，NF-1基因，和NM-23基因。
23.一种治疗局部细胞增生性疾病的方法，包括对增生细胞使用如权利要求19的DNA结构。
24.如权利要求10的方法，其中所说的增生细胞是下列一组疾病的病因，包括眼科的纤维增生性，血管增生性和肿瘤性疾病。
全文摘要
细胞增生性疾病的基因疗法。本发明提供了一种用于治疗发生于如肿癌、恶性细胞增生，良性增生疾病和其他病理性细胞增生疾病中的异常或病理性细胞增生的方法。本发明还提供了一种治疗个体中细胞增生性疾病的方法，包括对异常增生的细胞使用某种抑制性生长调节基因(NGR)成份的一种或几种活性基因复制品。本发明的另一个方案是提供一种抑制异常细胞增生的方法，包括向一种异常增生细胞中插入一种可以灭活PGR成份功能性表达的本发明的合成DNA或RNA构件。
文档编号C12N5/10GK1056427SQ9110305
公开日1991年11月27日 申请日期1991年4月8日 优先权日1990年4月10日
发明者恽凯峰, 艾伦L·默弗里 申请人:研究发展基金会