专利名称：：利用胶德克斯氏菌生产富氨基酸、维生素e、b的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物工业发酵技术，特别是利用胶德克斯氏抗氨固氮菌工业发酵生产富氨基酸、维生素E、B2单细胞蛋白，有机锗营养液的方法。利用微生物进行工业发酵，生产单细胞蛋白营养物质，目前已引起有关科学家的重视，并已取得了一些进展，如DonaldO.Hitzman，BartlesvilleoklaL.U.SPatentDocuments4302542，1981利用嗜热细菌进行混合发酵，以乙醇等醇类化合物作为碳源和能源来产生单细胞蛋白;杨振华“851”口服液利用人工诱变处理维氏固氮菌(AzotobacterVinelandii)而得到一组命名为851黄的抗氨固氮菌，作为工业发酵的生产用菌株，利用所设计的培养基生产富硒单细胞蛋白、维生素和菌肥(以上内容参见1987年9月30日CN86100490B，发明专利申请审定说明书，《利用抗氨固氮菌生产富硒单细胞蛋白，维生素E和菌肥的方法》一文)，利用该方法已生产出“851超级口服液”产品，作为人们日常生活中的一种很有营养价值的保健饮料。本发明的目的是筛选出一种新的具有抗氨固氮性能的微生物菌种以及设计出适合于该菌生长的培养基，要求这种菌不但具有851黄维氏抗氨固氮菌的性能，而且利用其作为生产用菌，采用所设计出的培养基生产出的产品有效成分更为丰富，营养比例更为合理。本发明的技术方案1.菌株在对某组维氏抗氨固氮菌进行提纯复壮过程中，我们发现了一组边缘无色(或白色)菌落，其细胞型态从显微镜上观察是小杆状，0.2～0.5×1微米，单生。广东省微生物所对该菌进行光学显微镜和电子显微镜观察结果，发现细胞以极生鞭毛运动，在含有结合态氮的液体培养基中有大量运动的细胞，但在缺乏氮的培养基中罕有运动的细胞，革兰氏染色阳性。培养特征菌落小杆状，平滑，有光泽，透明;在阿氏贝(Ashby)培养基面上可以生长，呈无色;无机盐氮液培养基上可以生长;甘露醇-酵母培养基斜面上，生长很好，菌落无色;大豆培养基、有机氮丰富液体培养基上生长迅速，呈灰黄色;洋菜培养基上的菌落透明无色，液体培养基上形成菌膜。生理特征在无氮液体培养基中，能固定大气中分子态氮，接触酶阳性，无芽孢，孢囊或荚膜，吲哚试验阴性，硝酸盐还原阳性，不利用淀粉，葡萄糖发酵不产生酸，不产气、V.P.阴性，甲基红阴性，石蕊牛奶胨化还原，在16℃～37℃能生长，最适PH为6～8，依据V.B.D.斯克尔曼《细菌属的鉴定指导》发现该菌符合Berger氏鉴定手册所描述的固氮菌科(Azotobacteraceac)德克斯氏属(Derxia)的胶德克斯氏菌(DerxiagummosaJenson，Petersem，De&Bhattacharya1960)(我们命名其为“健字N型菌”1991年2月7日送交武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC№M91027)。2.培养基健字N型菌对培养基的适应范围很广，可采用多种培养基进行培养。(1)大豆培养基大豆粉5～15%氯化钠0.01～0.02%硫酸镁0.03～0.05%钼酸钠5～10ppm硫酸锌10～30ppm酵母膏0.05～0.1%磷酸氢二钾0.04～0.08%磷酸二氢钾0.03～0.05%亚硒酸钠1～5ppm二氧化锗4～20ppm硼酸5～10ppm(2)甘露醇-酵母膏培养基甘露醇1%酵母膏0.05%K2HPO40.06%MgSO40.03%NaCl0.03%CaCO30.05%NaMoO410ppmH3BO310ppm(3)有机氮丰富液体培养基干淀粉1～5%酵母浸出汁0.05～0.10%K2HPO40.05～0.08%KH2PO40.02～0.05%MgSO40.02～0.04%NaCl0.02～0.04%NaMoO410～20ppmH3BO310ppmZnSO45～10ppm3.工艺流程把上述健字N型菌接种到本发明所设计的大豆培养基或本发明所使用的甘露醇-酵母培养基或有机氮丰富液体培养基中，即先把键字N型菌接种到由附表一“斜面”一栏的具体培养基配方所配成的培养基斜面上培养93～98小时后，转入装有由附表一“三角瓶”一栏的具体培养基配方所配成的培养基的三角瓶中培养22～26小时，在上述过程中培养环境温度控制在30～33℃之间，然后再转入装有由附表一“一级种子罐”一栏的具体培养基配方所配成的培养基的一级种子罐中，培养18～24小时，再转入装有由附表一“二级发酵罐”一栏的具体培养基配方所配在的培养基的二级发酵罐培养36～44小时，在这过程中，温度应保持在30～32℃之间，将经上述处理后的培养液装入高位槽中，用90℃温度处理使菌体灭活后过滤，装入经预先处理好的玻璃瓶，再用120℃的高温灭菌30分钟便成。利用上述方法制成的培养液，还可以进一步加工，用浓缩干燥法生产N型851胶囊或冲剂，其具体的工艺流程如附图二所示。本发明由于采用了健字N型菌作为生产用菌，由于该菌的代谢物含磷(P)较低，其脂质过氧化反应(LPR)产生的自由基和过氧化物可引起多种细胞损伤，因此利用该菌及所能制成的培养基工业发酵生产的产品(下称N型851口服液)，除了具有杨振华851口服液所具有的营养成分外，而且其大部分有效成分的合量比杨振华851口服液高(见附表2)，而且易被人体所吸收，有利于人体对钙的吸收，其主要营养成分的含量氨基酸≥60mg/100ml，干物质≥4～12%，维生素B2≥0.2mg/100mg其产品还含较丰富的有机锗;有较强的过氧化脂质作用，能提高抗过氧化物酶的含量(见附表3)，保护脂质过氧化物对细胞模、小动脉和中枢神经系统的损害;该产品还具有识别癌细胞的功能，尤其对胃癌FGC的试验，其结果比杨振华851口服液高20%以上。因其营养成分含量丰富，对正常细胞又是一种极好的营养品。图一是本发明生产N型851口服液的工艺流程图。图二是本发明采用浓缩干燥法生产N型851胶囊或冲剂的工艺流程图。表1是本发明生产N型851口服液工艺流程中不同工序的培养基配方情况表。表2是本发明生产的N型851口服液与原杨振华851口服液各种营养成分对比表。表3是本发明生产的N型851口服液对不同组小白鼠肝脂质过氧化作用的影响情况表下面结合附图表说明本发明的实施把健字N型菌接种到由附表一“斜面”一栏的具体培养基配方所配成的培养基斜面上，在30～33℃温度环境下培养93～98小时，然后把培养后的菌移至装有由附表一“三角瓶”一栏的具体培养基配方所配成的培养基的三角瓶中，在30～33℃温度环境中培养22～26小时后，再把培养菌转入一级种子罐中，该罐中装有由附表一“一级种子罐”一栏的具体培养基配方所配成的培养基，这一流程培养基温度应控制在30～32℃，培养时间18～24小时，经过这一流程后便可把该培养菌及培养基一起转入二级发酵罐中，二级发酵罐中装有由由附表一“二级发酵罐”一栏的具体培养基配方所配成的培养基，在这流程中培养基温度应控制在30～32℃，培养时间36～44小时，经过上述处理后再把培养液及培养菌转入高位槽中，在90℃的温度下进行菌体灭活处理之后，再过滤，装入经清洗、消毒后的瓶子中，再在120℃温度下灭菌30分钟便可贴标、装箱出售。利用上述方法制成的培养液，可以直接作为一种营养饮料，也可以进一步加工，用浓缩干燥法生产N型851胶囊或冲剂，其具体的工艺流程如附图二所示。表1广东N型851口服液工艺流程中不同工序的培养基配方表2广东N型851口服液与福建851口服液营养成分对比表</tables>权利要求1.本发明涉及一种利用微生物生产富氨基酸、维生素E、B2及有机锗培养液的方法，其特征在于利用胶德克斯氏抗氨固氮菌(CCTCC№M91027)(我们命名其为健字N型菌)接种到本发明所设计的大豆培养基或本发明所使用的甘露醇--酵母培养基、有机氮丰富液体培养基中发酵培养生产培养液。即先把键字N型菌接种到由附表-“斜面”-栏的具体培养基配方所配成的培养基斜面上培养93～98小时后，转入装有由附表-“三角瓶”-栏的具体培养基配方所配成的培养基的三角瓶中培养22～26小时，在上述过程中培养环境温度控制在30～33℃之间，然后再转入装有由附表-“一级种子罐”-栏的具体培养基配方所配成的培养基的一级种子罐中，培养18～24小时，再转入装有由附表一“二级发酵罐”-栏的具体培养基配方所配在的培养基的二级发酵罐培养36～44小时，在这过程中，温度应保持在30～32℃之间。2.根据权利要求1所述的大豆培养基，其特征在于含有大豆粉5～15%，氯化钠0.01～0.02%，硫酸镁0.03～0.05%，钼酸钠5～10ppm，硫酸锌10～30ppm，酵母膏0.05～0.1%，磷酸氢钾0.04～0.08%，磷酸二氢钾0.03～0.05%，亚硒酸钠1～5ppm，有机锗4～20ppm，硼酸5～10ppm。3.根据权利要求1所述的培养液其特征在于还可以进一步加工，用浓缩干燥法生产N型851胶囊或冲剂。全文摘要本发明涉及一种利用胶德克斯氏抗氨固氮菌，利用大气中的氮作为氮源在本发明所设计的大豆培养基及所使用的甘露醇、酵母膏培养基、有机氮丰富液体培养基中发酵生产培养液的技术，采用该技术生产出的产品含有丰富的氨基酸、维生素E、B文档编号C12P1/04GK1059757SQ9110319公开日1992年3月25日申请日期1991年5月17日优先权日1991年5月17日发明者武传斌,曾庆坤,罗铸崇,张志明,林绍其,朱思聪申请人:惠州市岭南生物工程公司